張學(xué)政 吳冬冰 張學(xué)娟 吳冬寒

三亞市人民醫(yī)院消化內(nèi)二病區(qū) (海南 三亞,572100)

肝纖維化是由各種肝臟疾病引起的肝臟結(jié)締組織異常增生的肝臟病理學(xué)變化,若不及時(shí)進(jìn)行干預(yù),肝纖維化會(huì)進(jìn)展為肝硬化、肝癌等嚴(yán)重肝臟疾病及多組織器官并發(fā)癥[1]。由于肝纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且影響因素多,目前臨床上用于治療肝纖維化且療效確切、安全性好的藥物有限[2],所以對(duì)于抗肝纖維化藥物的研發(fā)是亟需解決的問題。JAK/STAT信號(hào)通路是與炎癥信號(hào)傳遞及細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)相關(guān)的信號(hào)通路[3,4],研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化的發(fā)生及進(jìn)展與JAK/STAT信號(hào)通路表達(dá)異常密切相關(guān)[5,6]。黃芪建中湯是基于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論的中藥成方制劑,最早記載于中國(guó)古典醫(yī)學(xué)著作《金匱要略》?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃芪建中湯對(duì)肝臟疾病具有治療作用,且在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出顯著療效[7,8]。本文通過研究黃芪建中湯對(duì)肝纖維化大鼠的作用及機(jī)制,旨在為黃芪建中湯的藥理作用研究及肝纖維化治療藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Sprague Dawley雄性大鼠60只,8周齡,體重200～220 g,購(gòu)于海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(瓊)2018-0002],實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房溫度24～26℃,濕度55%,光照12 h/d,自由飲食,單籠分組飼養(yǎng),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品及試劑 黃芪建中湯(黃芪、桂枝、生姜各9 g,白芍18 g,炙甘草6 g,大棗4枚和飴糖30 g)由藥材飲片制成每毫升含18.4 g生藥的制劑,購(gòu)自北京同仁堂制藥有限公司;秋水仙堿購(gòu)自北京嘉林藥業(yè)股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字:H20003842);HA(貨號(hào):CSB-EL010918RA)、PCⅢ(貨號(hào):CSB-E15810r)、LN(貨號(hào):EK0435)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自和序生物公司、ColⅣ酶(貨號(hào):KT-32025) ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自默瑞(上海)生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液(貨號(hào):P0013B)、RNA提取試劑盒(貨號(hào):R0016)、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):D7168L)、SOD活性(WST-8法)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):S0103),MDA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):S0131M),p-JAK2(貨號(hào):AF1486)、p-STAT3(貨號(hào):AF1495)、JAK2(貨號(hào):AF1489)、STAT3(貨號(hào):AF1492)及GAPDH兔單克隆抗體(貨號(hào):AF1186),辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào):A0208)、化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào):P0018M)、TNF-α (貨號(hào):PT516)、IL-1β(貨號(hào):PI303)、IL-6(貨號(hào):PI328)ELISA試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;蘇木素染液(貨號(hào):J28N6Y6648)、伊紅染液(貨號(hào):Y13M6C2)均購(gòu)自源葉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器及設(shè)備 CKX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司);1～16 k高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)sigma公司);SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司);GIS-500凝膠成像儀(杭州米歐儀器有限公司);DM2500光學(xué)/熒光顯微鏡(德國(guó)LEICA公司);Leica RM2245型石蠟切片機(jī)購(gòu)自徠卡貿(mào)易有限公司;DYC456-8型電泳槽(北京六一儀器廠);HBS-1096C型酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)。

1.4 肝纖維化大鼠建模及給藥 大鼠按照15只/組隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、黃芪建中湯組及陽性對(duì)照組,除對(duì)照組,其余各組參照文獻(xiàn)[9,10]建立四氯化碳誘導(dǎo)(CCl4)的肝纖維化大鼠模型,具體方法為:每只大鼠按照3 ml/kg的劑量首次腹腔注射CCl4,之后按照3 ml/kg腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為50%的CCl4橄欖油溶液(橄欖油∶CCl4=1∶1),每周2次,連續(xù)給藥8周后,隨機(jī)抽取3只大鼠,以戊巴比妥溶液麻醉后斷頸處死,迅速分離肝組織,采用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)檢查肝組織病理學(xué)變化,以評(píng)價(jià)造模是否成功,對(duì)照組大鼠腹腔注射給予等量橄欖油。未有大鼠在造模過程中死亡,45只造模大鼠中19只出現(xiàn)輕度腹水。黃芪建中湯組根據(jù)大鼠體重按照10 ml/kg的劑量灌胃給予大鼠黃芪建中湯(每毫升含18.4 g生藥)[11],陽性對(duì)照組按照0.2 mg/kg灌胃給于大鼠秋水仙堿[10],1次/d,給藥60 d[9]。

1.5 血清ALP、GGT、ALT、AST水平檢測(cè) 大鼠眼眶取血至離心管中,4℃靜置4 h后,4℃,3 500 rpm離心10 min,離心半徑13.5 cm,取上清液,進(jìn)樣至全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT、AST、ALP、GGT水平。

1.6 血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平測(cè)定 大鼠麻醉腹主動(dòng)脈取血至離心管中,4℃靜置4 h后,以4℃,3 500 rpm離心10 min,離心半徑13.5 cm,取上清液,分別按照ELISA試劑盒說明書方法測(cè)定HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平。

1.7 肝組織MDA水平及SOD活性測(cè)定 取大鼠肝組織,置于組織勻漿器中研磨勻漿后,以12 000 rpm,4℃離心10 min,離心半徑13.5 cm,按照試劑盒規(guī)定操作方法測(cè)定肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6及MDA水平及SOD活性。

1.8 肝組織病理學(xué)檢查 取大鼠部分肝組織(6只/組),于中性甲醛中固定12 h后,置于石蠟包埋機(jī)中進(jìn)行包埋,行5 μm切片,分別進(jìn)行HE染色及Masson染色,顯微鏡下觀察。

1.9 肝組織中JAK2、STAT3 m RNA水平測(cè)定 每組取6只大鼠。按照RNA提取試劑盒方法提取大鼠肝組織總RNA,并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,熒光定量PCR檢測(cè)肝組織JAK2及STAT3 m RNA的表達(dá)。用于檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR的各基因引物見表1,以β-actin為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量。

表1 各檢測(cè)基因引物序列

1.10 肝組織JAK2、STAT3蛋白水平檢測(cè) 取大鼠(6只/組)肝組織,使用裂解液裂解并進(jìn)行組織勻漿,以4℃,12 000 rpm離心10 min,離心半徑13.5 cm,取上清液,置于100℃水浴5 min變性。BCA法測(cè)定蛋白濃度后,取50 μg蛋白進(jìn)行電泳分離,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉后,JAK2、STAT3及GAPDH抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜后,加入稀釋(1∶2 000)后的山羊抗兔IgG室溫條件下孵育2 h,PBST洗滌后,置于凝膠成像儀滴加適量發(fā)光液成像,使用Image J軟件檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清ALP、GGT、ALT、AST水平 見表2。

表2 各組大鼠血清ALP、GGT、ALT、AST水平

2.2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平 見表3。

表3 各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平

2.3 大鼠肝組織MDA水平及SOD活性水平 見表4。

表4 各組大鼠肝組織SOD活性及MDA水平

2.4 各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查 對(duì)照組大鼠肝組織無病理學(xué)改變;與對(duì)照組大鼠肝組織病理檢查結(jié)果相比,模型組大鼠肝組織病理學(xué)提示細(xì)胞形狀不規(guī)則,結(jié)構(gòu)破壞,可見氣泡樣改變及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝組織纖維樣改變,肝組織細(xì)胞壞死、脫落;與模型組比較,黃芪建中湯組及陽性對(duì)照組大鼠肝組織細(xì)胞組織病理學(xué)明顯改善,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,細(xì)胞壞死及炎性浸潤(rùn)明顯減輕,纖維增生明顯減輕。各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果見圖1、2。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果 (×200)

圖2 大鼠肝組織Masson結(jié)果 (×200)

2.5 大鼠肝組織JAK2及STAT3 mRNA水平 見表5。

表5 各組大鼠肝組織JAK2及STAT3 mRNA水平

2.6 各組大鼠肝組織JAK2及STAT3蛋白水平比較 與對(duì)照組比較,模型組、黃芪建中湯組及陽性對(duì)照組肝組織JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,黃芪建中湯組及陽性對(duì)照組大鼠肝組織JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平顯著降低(P<0.05);黃芪建中湯組p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平較陽性對(duì)照組顯著降低(P<0.05);陽性對(duì)照組大鼠JAK2及STAT3蛋白水平與黃芪建中湯組不存在顯著性差異(P>0.05)。各組大鼠肝組織JAK2及STAT3蛋白水平見圖3及表6。

圖3 各組大鼠肝組織JAK2及STAT3蛋白水平

表6 各組大鼠肝組織JAK2及STAT3蛋白水平

3 討論

肝纖維化是指由病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病等肝臟疾病所致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,如果致病因素長(zhǎng)期不能去除,則會(huì)發(fā)展成肝硬化[1]。肝纖維化在臨床表現(xiàn)上無顯著特點(diǎn),其進(jìn)展為肝硬化等疾病過程中則常表現(xiàn)出疲乏無力、食欲減退、消化不良[12]。目前臨床上用于治療肝纖維化的藥物有限,且存在有效率低等缺點(diǎn),所以對(duì)于治療肝纖維化藥物的研發(fā)是目前的臨床工作重點(diǎn)之一。

黃芪建中湯是由黃芪、桂枝、白芍、生姜等多種中藥材組成的中藥成方制劑,具有補(bǔ)脾益氣,溫陽散寒之功效,主要用于治療用于氣虛里寒,腹中拘急疼痛等疾病[13],廣泛記載于中國(guó)古代醫(yī)學(xué)著作中?，F(xiàn)代研究表明,黃芪建中湯具有抗胃潰瘍、抗腫瘤、抗疲勞及抗慢阻肺等多種藥理作用[14-16]。張燕云等[7]報(bào)道了黃芪建中湯對(duì)病毒性肝炎具有一定的治療作用;唐文哲等[8]研究發(fā)現(xiàn)黃芪建中湯對(duì)自身免疫性肝炎具有一定的改善作用;黃恒霞[17]報(bào)道了黃芪建中湯對(duì)肝郁脾虛癥具有明顯的改善作用。

JAK/STAT信號(hào)通路是多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同途徑,與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程密切相關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn),JAK/STAT通路的異常激活能夠促進(jìn)炎癥性疾病、淋巴瘤、白血病以及實(shí)體腫瘤等各種疾病的發(fā)生、發(fā)展[19]。孫玉霞等[20]發(fā)現(xiàn)慢性萎縮性胃炎模型大鼠的發(fā)病機(jī)制與JAK/STAT的異常激活有關(guān),陳宇斐等[21]報(bào)道了JAK2/STAT3通路的異常激活能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)JAK/STAT通路的異常激活與肝纖維化的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展相關(guān)[22,23],其中,蔣亞玲等[22]報(bào)道了肝星狀細(xì)胞纖維化病變與其JAK/STAT相關(guān)蛋白水平升高;李晉等[23]則發(fā)現(xiàn)川芎嗪能夠改善小鼠肝纖維化癥狀,其機(jī)制與抑制JAK/STAT信號(hào)通路有關(guān)。

ALT、AST、ALP、GGT水平是反映肝功能的重要指標(biāo),其水平的升高提示肝細(xì)胞損傷壞死;PCⅢ是反映肝內(nèi)Ⅲ型膠原合成的指標(biāo),與肝纖維化形成的活動(dòng)程度密切相關(guān);ColⅣ是肝纖維化過程中的早期標(biāo)志之一,含量增高可較靈敏反映出肝纖維化過程;LN水平升高也能反映肝纖維化的進(jìn)展,HA為基質(zhì)成分之一,由間質(zhì)細(xì)胞合成,其水平升高反映肝內(nèi)已生成的纖維量及肝細(xì)胞受損狀況,是肝纖維化和肝硬變的敏感指標(biāo)[24]。肝組織SOD活性及MDA水平是反映肝組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo),SOD活性降低及MDA水平升高則表明大鼠肝纖維化大鼠的肝組織氧化應(yīng)激損傷加重[25]。本實(shí)驗(yàn)通過采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纖維化模型,研究黃芪建中湯對(duì)其的治療作用及機(jī)制。結(jié)果表明,與模型組比較,黃芪建中湯組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平,大鼠肝組織MDA水平顯著降低,肝組織SOD活性顯著升高,提示黃芪建中湯能夠明顯改善肝纖維化大鼠的肝功能,抑制大鼠肝纖維化進(jìn)展,改善大鼠肝組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷狀態(tài),促進(jìn)大鼠肝組織細(xì)胞的恢復(fù)。同時(shí),結(jié)果表明,黃芪建中湯組大鼠肝組織中JAK2及STAT3mRNA水平及JAK2、STAT3蛋白水平均顯著降低,提示黃芪建中湯能夠顯著抑制JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的異常表達(dá),進(jìn)而抑制JAK/STAT信號(hào)通路的過度激活,發(fā)揮其抗肝纖維化作用。黃芪建中湯組能夠明顯改善大鼠肝功能,降低肝纖維化大鼠肝纖維化水平及肝臟氧化應(yīng)激損傷,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路有關(guān)。