于 瀟

（上海中維檢測技術(shù)有限公司，上海 201600）

李斯特氏菌屬革蘭氏陽性菌，廣泛存在于自然界中，具有耐低溫、耐酸、耐高鹽等特點。涼拌菜、肉與肉制品、乳與乳制品以及動物性水產(chǎn)品等都容易受到李斯特氏菌屬的污染[1]。單增李斯特氏菌是人們常見的食源性致病菌，具有較強(qiáng)的致病性、抗逆性，是李斯特氏菌屬中唯一能夠引起人畜共患病的病原菌[2]。它可隨食物經(jīng)消化道進(jìn)入人體，感染孕婦、嬰兒、老年人及免疫力低下者，引發(fā)呼吸急促、腸胃炎、敗血癥、流產(chǎn)以及早產(chǎn)等[3]。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）規(guī)定其不得檢出。

江南等[4]分析了北京市通州區(qū)2016—2019 年市售632 件食品樣本，單核細(xì)胞增生李斯特菌檢出率為4.3%。陳培超等[5]分析了上海市嘉定區(qū)2019—2021 年市售188 份禽肉中單核細(xì)胞增生李斯特菌污染狀況，總檢出率為18.6%。為了測試機(jī)構(gòu)的檢驗水平技術(shù)能力，本實驗室參加了2022 年南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院組織的能力驗證，并對實驗過程和結(jié)果進(jìn)行總結(jié)分析，為今后的檢驗工作提供依據(jù)，也為實驗室通過資質(zhì)認(rèn)定工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源

南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院發(fā)放的乳制品樣品，西林瓶包裝，每瓶0.5 g，編號為054 和141，共兩瓶。

1.1.2 試劑

李氏增菌肉湯（LB1，LB2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基；李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基；單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒；PALCAM 瓊脂；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）；革蘭氏染色液試劑盒。

1.1.3 儀器設(shè)備

DHP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱；BSC-1300 Ⅱ A2型生物安全柜；BCM-1600A 生物潔凈工作臺；XSP-2C 雙目顯微鏡；BSA2201 電子天平；SQ810C立式壓力蒸汽滅菌器。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19111；伊氏李斯特氏菌ATCC 19119；斯氏李斯特氏菌ATCC 35967；英諾克李斯特氏菌ATCC 33090；金黃色葡萄球菌ATCC 25923；馬紅球菌ATCC 6939 均進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定和生化鑒定，確保菌株的質(zhì)量。

1.2 實驗方法

依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）和南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行實驗操作。

1.2.1 增菌

無菌操作開啟西林瓶后，立即加入4.5 mL 滅菌蒸餾水復(fù)溶，復(fù)溶后的5 g 樣品勻液轉(zhuǎn)移至45 mL 的LB1增菌液中混勻進(jìn)行增菌，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d 后，取0.1 mL 轉(zhuǎn)接到無菌LB2增菌液內(nèi)，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)1 d。

1.2.2 分離

取培養(yǎng)完成的增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板和PALCAM 平板，36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。

1.2.3 分純

選擇劃線平板培養(yǎng)基上的5 個典型（可疑）菌落，接種到木糖、鼠李糖生化鑒定管中，同時劃線于TSA-YE 平板上，在36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d 后觀察結(jié)果。

1.2.4 鑒定

①根據(jù)菌落在木糖和鼠李糖生化鑒定管上的結(jié)果，挑選TSA-YE 平板培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行染色鏡檢、動力試驗、生化鑒定、溶血試驗和協(xié)同溶血試驗。②通過革蘭氏染色鏡檢，判斷細(xì)菌的屬性。③取單菌落穿刺接種半固體動力培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落是否具有動力。④通過過氧化氫酶實驗，選取陽性結(jié)果菌落繼續(xù)接種于單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒，于36 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察生化特性。⑤取一塊血瓊脂平板，先在背面畫格分區(qū)成22 個，然后依次接種陰陽對照菌株和可疑單菌落，在36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；另取一塊血瓊脂平板，在培養(yǎng)基表面畫平行線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，再取陰陽對照菌株和可疑菌落在對照菌株平行線之間劃線，注意垂直線兩端距離平行線1 ～2 mm，不要觸及平行線，在36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 ～48 h 后觀察溶血效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 增菌

兩個樣品在LB1增菌液中培養(yǎng)后，培養(yǎng)物均呈渾濁狀態(tài)，表明培養(yǎng)基中有微生物生長。

2.2 分離

在PALCAM 平板和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，樣品141 無菌落生長，判定樣品141 為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌未檢出，樣品054 有典型菌落生長，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)生化鑒定試驗。在PALCAM 平板上，樣品054 呈灰綠色菌落，中心凹陷且呈黑色，菌落周圍培養(yǎng)基棕黑色；在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，樣品054 呈藍(lán)綠色菌落，周圍有不透明白色暈圈，培養(yǎng)基上無其他明顯干擾菌生長。在進(jìn)行分離鑒定試驗期間，陽性對照菌株需要接種在營養(yǎng)瓊脂等固體培養(yǎng)基上，方便單菌落生長，挑取以及對比觀察。

PALCAM 瓊脂可以將單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌與其他李斯特氏菌區(qū)分開，這是由于李斯特氏菌在PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基上能夠水解七葉苷生成6,7-二羥基香豆素，其與培養(yǎng)基中的鐵離子作用，使培養(yǎng)基變黑。菌種培養(yǎng)24 h 后可明顯觀察到黑色素的形成。PALCAM 瓊脂上李斯特氏菌的另一特征是菌落凹陷，這需要培養(yǎng)48 h 才能明顯觀察到。李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基可根據(jù)菌落周圍是否形成不透明白色暈環(huán)來區(qū)分單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌。對比陽性對照菌株，單增李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)1 d 就可以長出藍(lán)色菌落，但看不到白色暈圈，繼續(xù)培養(yǎng)，白色暈圈逐漸顯現(xiàn)，而英諾克李斯特氏菌在李顯平板上生長的菌落無白色暈環(huán)。

實驗中發(fā)現(xiàn)許多因素會導(dǎo)致單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的白色暈環(huán)不明顯，甚至沒有。李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的添加劑為凍干粉形式，使用前一定要完全溶解并攪拌至奶油狀均質(zhì)溶液再加入李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基中，避免因添加劑溶液不均勻而使培養(yǎng)基形成絮狀物，使培養(yǎng)出的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落無白色暈環(huán)。此外，李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板冷藏避光可保存一周，保存不當(dāng)也會導(dǎo)致培養(yǎng)出的菌落無白色暈環(huán)。為了避免漏檢，實驗也應(yīng)該將李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上無不透明白色暈環(huán)的菌落作為可疑菌落進(jìn)行鑒定，可根據(jù)經(jīng)驗排除部分周圍無暈圈的藍(lán)綠色小菌落。

2.3 分純

將從PALCAM 培養(yǎng)基和李顯培養(yǎng)基上挑取的樣品054 菌落轉(zhuǎn)接到木糖和鼠李糖生化鑒定管，培養(yǎng)終止后，木糖實驗結(jié)果均為陰性，鼠李糖實驗結(jié)果均為陽性，由此判斷樣品054 為可疑單增李斯特氏菌。

2.4 鑒定

樣品054 顯微鏡檢驗結(jié)果為紫色桿菌，是革蘭氏陽性菌；在動力培養(yǎng)基中呈傘狀生長，表明樣品具有動力；菌落滴加過氧化氫酶試劑后產(chǎn)生氣泡，表明過氧化氫酶試驗結(jié)果為陽性。將血平皿舉起透過燈光觀察，可以看到樣品054 的溶血圈與陽性對照菌株單增李斯特氏菌的溶血圈一樣，即狹窄、清晰、明亮，判斷樣品054 可能為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。溶血實驗一般24 h 就可明顯判斷結(jié)果，若溶血圈不明顯，可將培養(yǎng)皿放在4 ℃冰箱1 ～2 d 再觀察結(jié)果。實驗操作中注意血平皿勿進(jìn)行烘干，高溫會破壞紅血球，導(dǎo)致溶血圈現(xiàn)象不明顯，甚至不產(chǎn)生溶血圈。在協(xié)同溶血實驗的血平皿上可以看到陽性對照菌株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和樣品054 均在靠近金黃色葡萄球菌一端有溶血增強(qiáng)區(qū)域，也表明樣品054可能為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。生化鑒定試劑盒結(jié)果見表1。

表1 054 生化鑒定試劑盒結(jié)果

在血平皿上很容易將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌區(qū)分開，伊氏李斯特氏菌菌落周圍不產(chǎn)生溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌菌落周圍產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的溶血區(qū)域。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落和斯氏李斯特氏菌菌落的溶血環(huán)形態(tài)相似，主要是根據(jù)溶血環(huán)的明亮程度不同加以區(qū)分，觀察時將血平板舉起對著光源，邊輕微左右翻轉(zhuǎn)平皿邊觀察溶血環(huán)，這樣比較容易區(qū)分接種點周圍溶血環(huán)的明亮程度，再結(jié)合生化鑒定中木糖、鼠李糖生化管試驗結(jié)果來判斷樣品中是否有單增李斯特氏菌檢出。

綜合染色鏡檢、動力試驗、生化鑒定、溶血試驗和協(xié)同溶血試驗的結(jié)果，判定樣品054 為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，能力驗證結(jié)果評價見表2。

表2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果評價表

3 結(jié)論與討論

能力驗證是通過實驗室間比對來評價實驗室的檢測、校準(zhǔn)能力，是食品檢測機(jī)構(gòu)質(zhì)量控制的重要手段，它反映了實驗室的綜合檢測能力以及檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的國標(biāo)檢驗法中所用到的設(shè)備簡單、成本低，比較容易開展試驗，但溶血實驗難度較大，結(jié)果不易觀察區(qū)分，對技術(shù)員的檢驗技能和培養(yǎng)基質(zhì)量性能等要求較高，這就需要在日常工作中做好培養(yǎng)基的驗收和質(zhì)量控制，加強(qiáng)對技術(shù)人員的培養(yǎng)和監(jiān)督，提升檢測人員的自身能力與素質(zhì)，讓檢測人員意識到食品微生物檢測工作的重要性，形成認(rèn)真負(fù)責(zé)的工作態(tài)度。本次能力驗證使用的培養(yǎng)基（試劑）均依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)驗收，儀器設(shè)備均為本實驗室日常工作所使用，能力驗證結(jié)果為滿意，表明實驗室具備單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測能力。