李 娟，陳茵茵，梅 巖，陳雪華，王 達(dá)，黃嘉文

（1.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州 510000；2.廣東省食品檢驗所，廣東廣州 510000）

芝麻又稱胡麻，既是油料作物，又可直接食用。芝麻醬是由芝麻炒熟、磨碎制成，其香味濃郁，色澤金黃，口感細(xì)滑，是廣大消費者喜愛的一種調(diào)味品[1]。芝麻醬的營養(yǎng)豐富，含有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素E、礦物質(zhì)、鐵等對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)[2]。芝麻醬的制作工藝簡單，不需要特殊的大型設(shè)備，但因市場準(zhǔn)入門檻低等使得生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量相差很大，各種摻假方式層出不窮，如摻入其他油料作物、用淀粉香精調(diào)制等[3]。因此，芝麻醬作為消費者生活中必不可少的調(diào)味品，其摻假檢測非常必要。

目前，芝麻醬的摻偽鑒定還未有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)出臺，最常用的芝麻醬摻偽鑒別方式是感官鑒別，對其色、香、味、形進(jìn)行判定，但一般消費者并不具備相關(guān)的知識導(dǎo)致難以分辨是否摻偽。國內(nèi)學(xué)者對于芝麻醬的研究也較少，其鑒定指標(biāo)/技術(shù)有采用色譜法測定脂肪酸、采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定特征風(fēng)味物質(zhì)[4]、分子生物學(xué)技術(shù)PCR 法等[5]。分子生物學(xué)技術(shù)現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于多種動植物產(chǎn)品摻假鑒定中，本項目應(yīng)用的實時熒光PCR 技術(shù)可直接判讀芝麻醬產(chǎn)品是否含有芝麻源性成分或其他標(biāo)簽未標(biāo)識的其他源性成分，靈敏度高、操作簡便。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熒 光PCR 試 劑：Takara Premix Ex Taq（Probe qPCR）RR390A，分析純；異丙醇，分析純；DNA提取試劑：QIAGEN DNeasy mericon Food Kit（Code No.69514），分析純，德國QIAGEN 公司；引物，生工生物上海有限公司。

Bio-rad CFX96 熒光定量PCR 儀，美國Bio-rad公司；Biospec-nano 核酸蛋白測定儀，日本島津公司；1300 系列A2 級別生物安全柜，美國Thermofisher 公司；Sorvall ST 8 離心機(jī)，美國Thermofisher 公司。

1.2 實驗方法

將芝麻醬樣品進(jìn)行均質(zhì)，按照優(yōu)化后的植物DNA 提取流程或成品的試劑盒DNA 提取流程進(jìn)行DNA 的提取，之后以提取的DNA 為模板，采用2S albumim mRNA 基因的特異性引物、探針進(jìn)行實時熒光PCR 檢測，觀察是否出現(xiàn)實時熒光PCR 的增幅現(xiàn)象，判斷待檢樣品中是否含有芝麻源性成分，實現(xiàn)芝麻源性成分的鑒定。

1.2.1 樣品前處理

將芝麻醬樣品中析出的上層油質(zhì)去除，盡量去除干凈，否則影響芝麻醬DNA 的提取，用潔凈的玻璃棒攪拌均勻，取芝麻醬樣品約500 mg 置于離心管中，4 ℃冷凍離心，去上清留沉淀，置于-20 ℃冰箱中保存，以備下一步進(jìn)行核酸提取。

1.2.2 DNA 提取

試劑盒優(yōu)化法：①取經(jīng)過前處理后的樣品約1 000 mg，加入等體積的異丙醇溶液，輕輕渦旋振蕩；②振蕩后將其置于4 ℃冰箱中靜置30 min，后取出于4 ℃冷凍離心；③按照商業(yè)化DNA 提取試劑盒說明書中的要求進(jìn)行DNA 提取。提取過程中設(shè)置提取對照，以滅菌去離子水代替樣品進(jìn)行DNA 提取。

1.2.3 DNA 濃度測定

采用Biospec-nano 核酸蛋白分析儀對提取的DNA 進(jìn)行濃度測定。

1.2.4 實時熒光PCR 擴(kuò)增及其質(zhì)控設(shè)置

芝 麻 源 性 成 分 檢 測2S albumim mRNA基因的特異性引物探針序列， 上游引物：CCAGAGGGCTAGGGACCTTC； 下 游 引 物：CTCGGAATTGGCATTGCTG； 探 針 序 列：FAMTCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA。

芝麻源性成分檢測實時熒光PCR 反應(yīng)體系采用25 μL 反應(yīng)體系，PCR 緩沖液加入2.5 μL，其工作濃度為10 倍Buあer；上下游引物、探針各加1 μL，其工作濃度均為10 μmol·L-1；dNTPs 加入2 μL，其工作濃度均為10 μmol·L-1，Taq DNA 聚合酶加入0.2 μL，其工作濃度為2.5 U·μL-1；DNA模板加入量為10～100 ng，最后用滅菌去離子水補(bǔ)足25 μL 反應(yīng)體系。

芝麻源性成分檢測實時熒光PCR 反應(yīng)程序：50 ℃/2 min，1 個循環(huán)；95 ℃/15 min，1 個循環(huán)；95 ℃/15 s，60 ℃/1 min，40 個循環(huán)；在每次循環(huán)退火時收集熒光信號。反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號以及所使用試劑的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

以芝麻中提取的DNA 為陽性對照，以花生提取的DNA 為陰性對照，以滅菌水為空白對照，以水為樣品進(jìn)行提取作為提取過程的對照。

1.2.5 熒光PCR 擴(kuò)增結(jié)果判斷與表述

閾值的設(shè)定根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點，且Ct 值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準(zhǔn)。

（1）各對照結(jié)果應(yīng)符合以下要求。①陰性對照：無熒光增幅現(xiàn)象。②提取對照及空白對照：無熒光增幅現(xiàn)象。③陽性對照：有明顯的熒光增幅現(xiàn)象。④內(nèi)參照：有明顯的熒光增幅現(xiàn)象。⑤以上指標(biāo)有一項不符合均視為此次實驗無效。

（2）結(jié)果判定。①同時進(jìn)行的內(nèi)參照、陰性、陽性、空白和提取對照實驗結(jié)果正常，檢測樣品無熒光增幅現(xiàn)象，Ct 值＞40.0，判斷被檢樣品陰性，未檢出芝麻源性成分。②同時進(jìn)行的內(nèi)參照、陰性、陽性、空白、提取對照實驗結(jié)果正常，檢測樣品有明顯的熒光增幅曲線，且Ct 值＜35.0，判斷被檢樣品陽性，檢出芝麻源性成分。③同時進(jìn)行的內(nèi)參照、陰性、陽性、空白、提取對照實驗結(jié)果正常，且檢測樣品熒光增幅曲線的Ct值在35.0～40.0，則應(yīng)重新進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)。再次擴(kuò)增出的結(jié)果Ct 值仍在35.0 ～40.0，可判斷被檢樣品可疑，否則可判斷被檢樣品陰性。

1.2.6 方法特異性研究

在芝麻醬產(chǎn)品中可能會摻雜花生成分[1]，為驗證該方法的特異性，以花生樣品提取的DNA 為模板，以本研究中芝麻的上下游引物、探針進(jìn)行擴(kuò)增，查看擴(kuò)增結(jié)果是否出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

1.2.7 方法檢出限研究

樣品中若芝麻成分含量少，提取到的DNA 濃度過低，可能會導(dǎo)致檢測不出芝麻源性成分，因此需要對本研究中的上下游引物、探針進(jìn)行檢出限的驗證。對芝麻樣品提取的DNA 進(jìn)行稀釋，濃度分別為提取后濃度的10%、1%、0.1%、0.01%，以不同比例稀釋后的DNA 為模板進(jìn)行實時熒光PCR 擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法特異性驗證結(jié)果

從圖1 中看出，以花生樣品提取的DNA 為陰性對照進(jìn)行擴(kuò)增后，無熒光增幅現(xiàn)象，說明本研究中應(yīng)用的上下游引物、探針具有特異性，可特異性擴(kuò)增芝麻源性成分。

圖1 芝麻源性成分2S albumim mRNA 基因檢測

2.2 方法檢出限驗證結(jié)果

對芝麻樣品提取的DNA 進(jìn)行稀釋后，濃度分別為原濃度的10%、1%、0.1%、0.01%，以此為模板擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。從圖中可看出，在DNA 濃度為0.01%時仍有熒光增幅現(xiàn)象，且Ct 值＜35，說明該方法的最低檢出限（LOD）為0.01%。

圖2 芝麻源性成分檢測檢出限

2.3 市售樣品檢測結(jié)果

超市購買芝麻醬待檢品3 份，產(chǎn)品均有明確的標(biāo)簽標(biāo)識，其中2 份標(biāo)識含有芝麻源性成分和花生源性成分，一份標(biāo)識僅含有花生源性成分。用本方法進(jìn)行芝麻源性成分的鑒定，結(jié)果見圖1 及表1，結(jié)果顯示同時進(jìn)行的陰性、陽性、空白、提取對照實驗結(jié)果正常，兩份樣品能檢測出芝麻源性成分，標(biāo)簽僅含花生源性成分的樣品未檢出芝麻源性成分。

表1 實際樣品檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了利用實時熒光PCR 法對芝麻源性成分進(jìn)行檢測的方法，并利用該方法對市售樣品進(jìn)行了檢測。經(jīng)過驗證，該方法的特異性及檢出限均能滿足檢測要求，市售樣品檢測結(jié)果均符合產(chǎn)品標(biāo)簽，說明該方法檢測結(jié)果可靠。