王佳 張莉 豆思遠 高軍軍 李勇生
摘? 要:本研究就畜禽常見腹瀉病原菌的生長特性、細菌懸液濁度和細菌計數(shù)之間的關系進行探討,通過對常見畜禽腹瀉病原菌大腸桿菌(O8型和O139型)、雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌和雞傷寒沙門菌不同培養(yǎng)時間段吸光度(optical density,OD)值的測定,結(jié)合平板活菌計數(shù)法來確定這5種細菌的生長曲線,并對細菌濁度和細菌計數(shù)相關性進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)極顯著相關(P<0.01),建立了5種細菌在生長期和穩(wěn)定期的OD值-細菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程,O8型大腸桿菌:y=2.55x+6.72(r2=0.96);O139型大腸桿菌:y=1.45x+8.77(r2=0.95);雞傷寒沙門菌:y=4.50x+7.02(r2=0.95);鼠傷寒沙門菌:y=5.59x+7.67(r2=0.97);雞白痢沙門菌:y=9.72x+6.60(r2=0.98)。利用該回歸方程可快速準確地確定菌液濃度,為探討細菌的培養(yǎng)特性、致病機制及動物實驗中攻毒劑量的確定等相關實驗提供參考依據(jù)。
關鍵詞:生長曲線;紫外分光光度法;活菌計數(shù)
中圖分類號:S852.6 文獻標志碼:A ? ? ? ?文章編號:1001-0769(2023)04-00101-06
在微生物實驗中,在細菌毒力的測定和動物攻毒實驗時,菌液濃度是重要指標之一,常需要進行準確的細菌計數(shù)。細菌生長的測定方法分為直接法和間接法[1-2],比較常見的是平板計數(shù)法和比濁法。平板計數(shù)法結(jié)果相對準確,但操作復雜且時間較長;比濁法相對簡單,但結(jié)果易受環(huán)境溫度、培養(yǎng)基色澤等因素的影響,易發(fā)生偶然誤差。研究表明,細菌懸液的吸光度與其濃度呈正相關性[3-5]。本研究采用分光光度計,對大腸桿菌(O8型和O139型)、雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌、雞傷寒沙門菌等細菌懸液進行吸光度(optical density,OD)值的測定,結(jié)合平板活菌計數(shù)的結(jié)果,擬建立一種快速準確的方法,為動物實驗中攻毒劑量的濃度確定提供科學參數(shù)。
1 材料與方法
1.1 菌種
大腸桿菌(Escherichia coli:O8型和O139型)、雞傷寒沙門菌(Salmonella gallinarum)、雞白痢沙門菌(Salmonella pullorum)、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)由甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院微生物實驗室提供。
1.2 儀器與試劑
722s可見分光光度計購自上海精密科學儀器有限公司,TD25-WS低速多管架自動平衡離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司,麥氏比濁管(0.5-5 McFarland)購自北京中西遠大科技有限公司,L棒、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉等購于北京奧博星生物技術有限責任公司,NaOH購于西安化學試劑廠,K2HPO4購于成都化學試劑廠,NaCL購于天津市標準科技有限公司。
1.3 菌種活化及種子液的培養(yǎng)
試驗前將保存的5種菌種接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化,然后接種于無菌新鮮肉湯10 mL中,37 ℃培養(yǎng)18 h后,將培養(yǎng)物倒入無菌離心管內(nèi)離心10 min(3 000 r/min),用無菌生理鹽水洗滌三次后,將菌種配制成1.8×109 CFU/mL的菌懸液,一般情況下每100 mL培養(yǎng)18 h的大腸桿菌或沙門菌培養(yǎng)液,離心10 min(3 000 r/min)后制成20 mL細菌懸液,作為種子液,以備擴大培養(yǎng)用。
1.4 種子液擴大培養(yǎng)
按5%的接種量,將備用種子液接種于200 mL無菌新鮮肉湯中,充分搖勻后置于? 37 ℃培養(yǎng)。從培養(yǎng)起每隔1 h/2 h吸取菌液用分光光度計測吸光度值,并結(jié)合活菌計數(shù)法測細菌濃度,每隔1 h/2 h重復以上步驟(培養(yǎng)10 h及以前的菌液每隔1 h重復以上步驟,培養(yǎng)10 h后的菌液每隔2 h重復以上步驟)。
1.5 吸光度值測定
定時取樣,用分光光度計于460 nm/600 nm波長(O8型大腸桿菌和O139型選用460 nm,雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌、雞傷寒沙門菌選用600 nm)測OD值,以無菌肉湯作為對照[6-8]。以時間為橫坐標,不同時間段OD值為縱坐標,作圖,繪制生長曲線。
1.6 活菌計數(shù)
菌液取樣后,進行活菌計數(shù)。對培養(yǎng)的各菌液進行倍比稀釋(培養(yǎng)0~10 h的菌液取10-2~10-9稀釋度,培養(yǎng)超過10 h的菌液取10-4~10-10稀釋度),分別取100 μL細菌懸液均勻涂布于直徑90 mm的平板上,每個稀釋度涂3塊平板。37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h后,可見菌落形成,選取菌落數(shù)在30~300的平板進行計數(shù),取平均值作為菌落數(shù),計算出菌懸液的濃度(CFU/mL)。以細菌菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標,生長時間為橫坐標,構建生長曲線。
1.7 細菌濁度與活菌計數(shù)的相關性分析
用統(tǒng)計方法對5種細菌的OD值與活菌計數(shù)之間的相關性進行分析,根據(jù)它們之間是否存在顯著的相關性,確定是否可以建立數(shù)學模型定量的描述細菌濁度和細菌計數(shù)的相關性,從而根據(jù)建立的曲線回歸方程進行相關指標的評估,建立OD值-細菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程[9]。
2? 結(jié)果與分析
在培養(yǎng)條件不變的情況下,定時取樣測定其在460 nm/600 nm處的OD值(大腸桿菌測定波長采用600 nm,沙門菌的采用460 nm),以生長時間為橫坐標,OD值或細菌數(shù)對數(shù)為縱坐標,構建生長曲線。5條曲線分別包含適應期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期[10]。
對5種菌的OD值與細菌數(shù)的相關性進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果表明它們均存在極顯著的相關性(P<0.01),這表明可以通過建立數(shù)學模型定量描述細菌濁度和細菌計數(shù)的關系。因此可以根據(jù)建立的5種菌曲線回歸方程來進行相關指標的評估。
2.1 O8型大腸桿菌
測定O8型大腸桿菌生長曲線,其初始接種菌懸液濃度為3.7×106 CFU/mL。從圖1可以看出,該菌生長大致分為4個時期。其中0~ 1 h為適應期,在這個時期內(nèi),細菌生長遲緩。2~6 h為對數(shù)期,此時細菌數(shù)的對數(shù)值與時間呈線性關系,細菌數(shù)以幾何級數(shù)增加。6~20 h為穩(wěn)定期,細菌增加和死亡的數(shù)量趨向平衡。20~24 h為衰亡期,表現(xiàn)“負增長”現(xiàn)象,即細菌死亡的數(shù)量多于細菌增加的數(shù)量。
對O8型大腸桿菌OD600 nm值與細菌數(shù)的相關性進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明存在極顯著的相關性(P<0.01),在生長期和穩(wěn)定期細菌菌液的OD值與細菌數(shù)之間呈顯著相關性,O8型大腸桿菌的OD值與細菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程是y=2.55x+6.72(r2=0.96)。該曲線的回歸相關指數(shù)r2=0.96,說明曲線回歸方程的擬合度比較高(圖2)。
2.2 O139型大腸桿菌
從細菌生長周期中菌懸液OD600 nm值和活菌計數(shù)的動態(tài)變化中發(fā)現(xiàn),O139型大腸桿菌整個生長階段有4個時期[11]。其接種初始濃度為3.168×107 CFU/mL,接種后0~3 h,處于適應期,隨后進入對數(shù)生長期(3~6 h),并持續(xù)約3 h,6~16 h為穩(wěn)定期,這一時期的活菌數(shù)最高且維持穩(wěn)定;16 h后曲線呈下滑趨勢,處于衰亡期(圖3)。
對O139型大腸桿菌與細菌數(shù)的相關性分析,結(jié)果表明它們存在極顯著的相關性? ? ? ? ?(P<0.01),因此在生長期和穩(wěn)定期時,O139型大腸桿菌OD600 nm值與細菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程是y=1.45x+8.77(r2=0.95),該曲線的回歸相關指數(shù)r2=0.95(圖4)。
2.3 雞傷寒沙門菌
從菌株的生長曲線可以看出(圖5),菌株的適應性很強,初始接種濃度為1.52×? ? ?107 CFU/mL,生長迅速,培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)期,2~6 h為對數(shù)期,生長穩(wěn)定期為6~? ? ? ?16 h,16 h后出現(xiàn)菌體生物量減少的現(xiàn)象,處于衰亡期。
用統(tǒng)計學方法對雞傷寒沙門菌OD460 nm值與細菌數(shù)之間的相關性進行分析,結(jié)果表明它們有極顯著的相關性(P<0.01),在生長期和穩(wěn)定期雞傷寒沙門菌OD值—細菌數(shù)對數(shù)的曲線回歸方程是y=4.50x+7.02(r2=0.95),曲線的回歸相關指數(shù)r2=0.95(圖6)。
2.4 鼠傷寒沙門菌
鼠傷寒沙門菌生長的適應期為0~2 h,對數(shù)生長期為2~8 h,8 h~16 h進入穩(wěn)定期,16 h后進入衰亡期(圖7)。
對鼠傷寒沙門菌OD460 nm值與活菌計數(shù)之間的相關性進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明它們之間有極顯著的相關性(P<0.01),在生長期和穩(wěn)定期鼠傷寒沙門氏菌OD值與細菌數(shù)對數(shù)曲線回歸方程是y=5.59x+7.67 (r2=0.97)。曲線的回歸相關指數(shù)r2=0.97(圖8)。
2.5 雞白痢沙門菌
從細菌生長周期中細菌懸液OD460值和活菌計數(shù)的動態(tài)變化中發(fā)現(xiàn),雞白痢沙門菌整個生長階段有4個時期。其接種初始濃度為1.18×107 CFU/mL,0~1 h為適應期,1~ 10 h處于對數(shù)生長期,10~16 h為穩(wěn)定期,16 h后為衰亡期(圖9)。
對雞白痢沙門菌OD值與活菌計數(shù)之間的相關性進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明它們有極顯著的相關性(P<0.01),在生長期和穩(wěn)定期雞白痢沙門菌OD值與細菌數(shù)對數(shù)曲線回歸方程為y=9.72x+6.60(r2=0.98),曲線的回歸相關指數(shù)r2=0.98(圖10)。
3? 討論
在細菌培養(yǎng)過程中不斷有培養(yǎng)液營養(yǎng)消耗和細菌代謝產(chǎn)物增加,同時死亡細菌的消融產(chǎn)物也會對菌液的OD值產(chǎn)生影響。本試驗研究表明,菌液隨時間延長OD值不斷增加。試驗也發(fā)現(xiàn),菌液顏色隨培養(yǎng)時間延長變化明顯,由棕黃色逐步變?yōu)闇\黃色。
生長曲線體現(xiàn)了細菌在培養(yǎng)過程中的生長和繁殖規(guī)律,不同細菌在相同培養(yǎng)條件下生長曲線不同,相同細菌在不同的培養(yǎng)條件下其生長曲線也存在差異。本研究以O8型大腸桿菌、O139型大腸桿菌、雞傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌等為研究對象,通過24 h連續(xù)培養(yǎng),對OD值、細菌數(shù)的變化規(guī)律和相關性進行分析和探討。運用統(tǒng)計軟件構建OD值和細菌數(shù)的直觀圖,結(jié)果表明其與理論圖形是一致的。從生長曲線圖形中發(fā)現(xiàn)整個生長階段有4個時期,這與相關文獻一致[7-9]。
細菌懸液的濃度和細菌菌液的混濁度呈正相關,因此檢測OD值能夠反映出菌液的濃度,濃度越高,說明生長的細菌越多。從試驗中可以看出,隨著培養(yǎng)時間的延長,OD值先增大,后逐漸趨于穩(wěn)定,說明菌液中的菌數(shù)也經(jīng)歷了一個先增多、后趨于穩(wěn)定的過程。試驗設立的陰性對照組的OD值為0,從而消除干擾因素。
OD值和活菌計數(shù),兩種測定方法在穩(wěn)定期和衰亡期出現(xiàn)差異,這是因為OD值反映的是總菌濃度,在對數(shù)生長期細菌數(shù)呈指數(shù)增加,死亡菌數(shù)很少可忽落不計,而在穩(wěn)定期尤其是衰亡期,有大量細菌死亡,活菌數(shù)逐漸減少而總菌數(shù)基本穩(wěn)定,這就造成了兩種測定方法繪制的生長曲線反映的穩(wěn)定期、衰亡期時間階段不同。因此在計算世代時間時,應以活菌計數(shù)法為準。細菌總數(shù)雖然是在穩(wěn)定期最多,但是在對數(shù)生長期細菌形態(tài)、生物活性都很典型,對外界環(huán)境因素的作用敏感,因此研究細菌性狀、藥物抗菌作用等選擇此對數(shù)生長期最好[11-15]。
根據(jù)朗伯—比耳(Lambert-Beer)定律,溶液的濃度太高或太低,均能影響測量結(jié)果的準確性,因此OD值選擇在0.2~1的范圍。結(jié)合測量的數(shù)據(jù),運用Excel軟件繪制散點圖。由于繪制的散點圖的分布情況類似對數(shù)函數(shù)圖形,故選擇用y=a+blgx進行擬合。令X′= lgx可將其化為y=a+bX′,其中X′是OD值,y是菌數(shù)的對數(shù)值,結(jié)果表明5種試驗菌回歸相關指數(shù)都不小于0.95,從而說明在這個吸光度的范疇內(nèi),細菌菌液的吸光度和細菌菌數(shù)具有顯著相關性。運用統(tǒng)計學方法對細菌濁度與活菌計數(shù)之間的相關性進行分析,結(jié)果表明它們之間存在著極顯著的相關性(P<0.01),通過構建細菌濁度與細菌計數(shù)的數(shù)學模型,可以有效彌補傳統(tǒng)計數(shù)方法的缺陷。
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