葉銀鵬+葉偉平+周虎+饒璐珊

摘要：選取5種龍泉破壁靈芝孢子粉為研究對(duì)象，使用紫外分光光度法，建立了一種快速、簡(jiǎn)單、高靈敏度，專門(mén)針對(duì)靈芝孢子粉中三萜測(cè)定的方法。結(jié)果表明，該方法測(cè)得龍泉破壁靈芝孢子粉三萜含量為2.94%～3.43%。熊果酸濃度在20～140 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度（RSD）為0.88%，回收率為88.6%～92.5%，完全能夠滿足于破壁靈芝孢子粉中三萜成分的分析研究。

關(guān)鍵詞：紫外分光光度法；靈芝孢子粉；三萜；龍泉市

中圖分類號(hào)：R932 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）02-0329-02

靈芝[Ganoderma lucidum（Leyss. ex Fr.） Karst.]是擔(dān)子菌綱多孔科靈芝屬真菌，具有極高的藥用價(jià)值。靈芝生長(zhǎng)成熟后從菌蓋彈射出非常小的孢子即靈芝孢子，靈芝孢子聚集在一起即成為靈芝孢子粉[1-3]。靈芝孢子粉富含三萜、蛋白質(zhì)和氨基酸、多糖等有效成分，其中具有抗腫瘤、抗HIV-1型病毒、護(hù)肝、解毒和改善記憶力等藥理活性的三萜更是廣泛受到人們的關(guān)注[4]。龍泉野生靈芝資源豐富，是天然的“靈芝菌種庫(kù)”，素有“中華靈芝第一鄉(xiāng)”的美譽(yù)。2011年，龍泉靈芝孢子粉被國(guó)家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。因此，快速測(cè)定龍泉靈芝孢子粉中三萜含量，對(duì)其原產(chǎn)地品質(zhì)鑒定以及有效活性分析具有重要意義。目前，靈芝孢子粉三萜的檢測(cè)尚沒(méi)有統(tǒng)一國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，僅能參照農(nóng)業(yè)部在2001年頒布的檢測(cè)靈芝及其產(chǎn)品中總?cè)坪康膫浒笜?biāo)準(zhǔn)（NY/SJ 339-2001）進(jìn)行。由于該方法不是專門(mén)針對(duì)靈芝孢子粉三萜含量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，存在標(biāo)準(zhǔn)取樣體積過(guò)少，造成標(biāo)準(zhǔn)曲線不準(zhǔn)等缺陷。

本研究利用紫外分光光度法，以乙酸乙酯為提取劑，采用熱超聲提取技術(shù)，對(duì)龍泉破壁靈芝孢子粉的三萜含量進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)建立了一種專門(mén)針對(duì)靈芝孢子粉三萜含量的快速、簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，對(duì)于靈芝孢子粉生產(chǎn)企業(yè)具有較好的應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（GR，99%）、香草醛（AR，99%）、乙酸乙酯（AR，99%）購(gòu)自上海麥恪林生化科技有限公司；冰醋酸（CH3COOH，GR）購(gòu)自麗水宏大化學(xué)用料有限公司；水為超純水，由ULUP-Ⅳ-20T超純水儀制備，電阻率>18.25 MΩ·cm。

1.2 儀器

UV-8000紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；AL104電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SK8210HP超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲波儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；THD-0506低溫恒溫槽（寧波天恒儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶中，即得200 mg/L熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 樣品處理 精密稱取靈芝孢子粉0.5 g（精確到0.000 1 g）放入50 mL的離心管中，加入20 mL乙酸乙酯，放入超聲波清洗器中超聲30 min，超聲功率為53 kHz，溫度60 ℃。超聲結(jié)束后，將上層清液過(guò)濾至50 mL的容量瓶中，再加入20 mL乙酸乙酯到沉淀物中重復(fù)上述操作，合并2次上清液，定容至50 mL容量瓶，即得樣品提取液。

1.3.3 樣品測(cè)定 取0.3 mL提取液于60 ℃水浴蒸干，然后加入0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和 1.00 mL高氯酸，在60 ℃水浴加熱15 min并移入冰水浴中；再加入5.00 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫；15 min后在548 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度。精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，按上述優(yōu)選條件及步驟在548 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，熊果酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，考察熊果酸在相關(guān)濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。

1.3.4 計(jì)算 破壁靈芝孢子粉中三萜含量測(cè)定應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算，樣品中的三萜含量（X）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，如下式所示：

X=（50/0.3）C/1 000·m×100%

式中，m為試樣靈芝孢子粉樣品質(zhì)量（g）；C為提取液中三萜濃度（mg）；X為靈芝孢子粉三萜含量（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程

按“1.3.3”條件精確吸取相應(yīng)體積數(shù)的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)吸光度與濃度進(jìn)行回歸分析，考察三萜在相關(guān)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1所示），回歸方程y=0.007 26x-0.051 29，r=0.999 79，表示吸光度與熊果酸含量在20～140 μg圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。在548 nm處的方法檢出限為3.9 μg。

2.2 靈芝孢子粉三萜含量測(cè)定分析

從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)5種不同品牌產(chǎn)自龍泉的破壁靈芝孢子粉樣品。樣品處理根據(jù)上述提取方法和檢測(cè)方法進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從表1中可看出，兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值小于10%。5種來(lái)自龍泉的破壁靈芝孢子粉的三萜含量為2.94%～3.43%，不同廠家的龍泉靈芝孢子粉三萜含量差別不大。表明龍泉產(chǎn)區(qū)的破壁靈芝孢子粉的三萜含量相對(duì)穩(wěn)定。

2.3 精密度試驗(yàn)

為了考察該方法的精密度，進(jìn)行精密度試驗(yàn)。取1#樣品提取液5份，每份0.3 mL，按上述檢測(cè)方法檢測(cè)三萜含量。連續(xù)進(jìn)樣5次測(cè)定吸光度，并計(jì)算每種樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，該方法的RSD為0.88%，精密度良好。

2.4 加標(biāo)試驗(yàn)

為了驗(yàn)證該方法的可行性，進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)。配制100 mg/mL的熊果酸溶液，作為加標(biāo)試驗(yàn)用。取樣品0.5 g，放入50 mL比色管。取0.5 mL濃度為100 mg/mL的熊果酸溶液，加入上述比色管中。樣品前處理以及檢測(cè)過(guò)程分別按“1.3.2”和“1.3.3”進(jìn)行，結(jié)果如表3所示，該方法檢測(cè)靈芝孢子粉的回收率為88.6%～92.5%，表明該方法應(yīng)用于靈芝孢子粉三萜的提取是可行的。

3 結(jié)論與討論

本研究以龍泉靈芝孢子粉為研究對(duì)象，選用低毒的乙酸乙酯為提取液，利用紫外分光光度法快速測(cè)定三萜含量，樣品處理僅通過(guò)恒溫超聲后進(jìn)行UV分析，簡(jiǎn)單高效。本研究建立的快速、簡(jiǎn)單、高靈敏度、環(huán)保的紫外分光光度法專門(mén)針對(duì)破壁靈芝孢子粉三萜含量檢測(cè)，并且針對(duì)線性、精密度、回收率等進(jìn)行了方法驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法測(cè)得龍泉靈芝孢子粉三萜含量為2.94%～3.43%。熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在20～140 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度（RSD）為0.88%，回收率為88.6%～92.5%。并且該方法所用的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，提取溶劑經(jīng)濟(jì)環(huán)保，提取技術(shù)簡(jiǎn)單高效，尤其適合應(yīng)用于靈芝孢子粉企業(yè)內(nèi)部檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 林志彬，王鵬云.靈芝孢子及其活性成分的藥理研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2006，38（5）：541-547.

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