葉銀鵬+葉偉平+周虎+饒璐珊

摘要：選取5種龍泉破壁靈芝孢子粉為研究對象，使用紫外分光光度法，建立了一種快速、簡單、高靈敏度，專門針對靈芝孢子粉中三萜測定的方法。結(jié)果表明，該方法測得龍泉破壁靈芝孢子粉三萜含量為2.94%～3.43%。熊果酸濃度在20～140 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度（RSD）為0.88%，回收率為88.6%～92.5%，完全能夠滿足于破壁靈芝孢子粉中三萜成分的分析研究。

關(guān)鍵詞：紫外分光光度法；靈芝孢子粉；三萜；龍泉市

中圖分類號：R932 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）02-0329-02

靈芝[Ganoderma lucidum（Leyss. ex Fr.） Karst.]是擔(dān)子菌綱多孔科靈芝屬真菌，具有極高的藥用價(jià)值。靈芝生長成熟后從菌蓋彈射出非常小的孢子即靈芝孢子，靈芝孢子聚集在一起即成為靈芝孢子粉[1-3]。靈芝孢子粉富含三萜、蛋白質(zhì)和氨基酸、多糖等有效成分，其中具有抗腫瘤、抗HIV-1型病毒、護(hù)肝、解毒和改善記憶力等藥理活性的三萜更是廣泛受到人們的關(guān)注[4]。龍泉野生靈芝資源豐富，是天然的“靈芝菌種庫”，素有“中華靈芝第一鄉(xiāng)”的美譽(yù)。2011年，龍泉靈芝孢子粉被國家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。因此，快速測定龍泉靈芝孢子粉中三萜含量，對其原產(chǎn)地品質(zhì)鑒定以及有效活性分析具有重要意義。目前，靈芝孢子粉三萜的檢測尚沒有統(tǒng)一國家標(biāo)準(zhǔn)，僅能參照農(nóng)業(yè)部在2001年頒布的檢測靈芝及其產(chǎn)品中總?cè)坪康膫浒笜?biāo)準(zhǔn)（NY/SJ 339-2001）進(jìn)行。由于該方法不是專門針對靈芝孢子粉三萜含量的檢測標(biāo)準(zhǔn)，存在標(biāo)準(zhǔn)取樣體積過少，造成標(biāo)準(zhǔn)曲線不準(zhǔn)等缺陷。

本研究利用紫外分光光度法，以乙酸乙酯為提取劑，采用熱超聲提取技術(shù)，對龍泉破壁靈芝孢子粉的三萜含量進(jìn)行檢測，同時(shí)建立了一種專門針對靈芝孢子粉三萜含量的快速、簡單的檢測方法，對于靈芝孢子粉生產(chǎn)企業(yè)具有較好的應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（GR，99%）、香草醛（AR，99%）、乙酸乙酯（AR，99%）購自上海麥恪林生化科技有限公司；冰醋酸（CH3COOH，GR）購自麗水宏大化學(xué)用料有限公司；水為超純水，由ULUP-Ⅳ-20T超純水儀制備，電阻率>18.25 MΩ·cm。

1.2 儀器

UV-8000紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；AL104電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SK8210HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲波儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；THD-0506低溫恒溫槽（寧波天恒儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶中，即得200 mg/L熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 樣品處理 精密稱取靈芝孢子粉0.5 g（精確到0.000 1 g）放入50 mL的離心管中，加入20 mL乙酸乙酯，放入超聲波清洗器中超聲30 min，超聲功率為53 kHz，溫度60 ℃。超聲結(jié)束后，將上層清液過濾至50 mL的容量瓶中，再加入20 mL乙酸乙酯到沉淀物中重復(fù)上述操作，合并2次上清液，定容至50 mL容量瓶，即得樣品提取液。

1.3.3 樣品測定 取0.3 mL提取液于60 ℃水浴蒸干，然后加入0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和 1.00 mL高氯酸，在60 ℃水浴加熱15 min并移入冰水浴中；再加入5.00 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫；15 min后在548 nm波長下測定樣品溶液的吸光度。精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)對照溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，按上述優(yōu)選條件及步驟在548 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，熊果酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，考察熊果酸在相關(guān)濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。

1.3.4 計(jì)算 破壁靈芝孢子粉中三萜含量測定應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算，樣品中的三萜含量（X）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，如下式所示：

X=（50/0.3）C/1 000·m×100%

式中，m為試樣靈芝孢子粉樣品質(zhì)量（g）；C為提取液中三萜濃度（mg）；X為靈芝孢子粉三萜含量（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程

按“1.3.3”條件精確吸取相應(yīng)體積數(shù)的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在進(jìn)行測定，根據(jù)吸光度與濃度進(jìn)行回歸分析，考察三萜在相關(guān)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1所示），回歸方程y=0.007 26x-0.051 29，r=0.999 79，表示吸光度與熊果酸含量在20～140 μg圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。在548 nm處的方法檢出限為3.9 μg。

2.2 靈芝孢子粉三萜含量測定分析

從市場購買5種不同品牌產(chǎn)自龍泉的破壁靈芝孢子粉樣品。樣品處理根據(jù)上述提取方法和檢測方法進(jìn)行，檢測結(jié)果如表1所示。從表1中可看出，兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值小于10%。5種來自龍泉的破壁靈芝孢子粉的三萜含量為2.94%～3.43%，不同廠家的龍泉靈芝孢子粉三萜含量差別不大。表明龍泉產(chǎn)區(qū)的破壁靈芝孢子粉的三萜含量相對穩(wěn)定。

2.3 精密度試驗(yàn)

為了考察該方法的精密度，進(jìn)行精密度試驗(yàn)。取1#樣品提取液5份，每份0.3 mL，按上述檢測方法檢測三萜含量。連續(xù)進(jìn)樣5次測定吸光度，并計(jì)算每種樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。從表2可以看出，該方法的RSD為0.88%，精密度良好。

2.4 加標(biāo)試驗(yàn)

為了驗(yàn)證該方法的可行性，進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)。配制100 mg/mL的熊果酸溶液，作為加標(biāo)試驗(yàn)用。取樣品0.5 g，放入50 mL比色管。取0.5 mL濃度為100 mg/mL的熊果酸溶液，加入上述比色管中。樣品前處理以及檢測過程分別按“1.3.2”和“1.3.3”進(jìn)行，結(jié)果如表3所示，該方法檢測靈芝孢子粉的回收率為88.6%～92.5%，表明該方法應(yīng)用于靈芝孢子粉三萜的提取是可行的。

3 結(jié)論與討論

本研究以龍泉靈芝孢子粉為研究對象，選用低毒的乙酸乙酯為提取液，利用紫外分光光度法快速測定三萜含量，樣品處理僅通過恒溫超聲后進(jìn)行UV分析，簡單高效。本研究建立的快速、簡單、高靈敏度、環(huán)保的紫外分光光度法專門針對破壁靈芝孢子粉三萜含量檢測，并且針對線性、精密度、回收率等進(jìn)行了方法驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法測得龍泉靈芝孢子粉三萜含量為2.94%～3.43%。熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在20～140 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度（RSD）為0.88%，回收率為88.6%～92.5%。并且該方法所用的儀器設(shè)備簡單，提取溶劑經(jīng)濟(jì)環(huán)保，提取技術(shù)簡單高效，尤其適合應(yīng)用于靈芝孢子粉企業(yè)內(nèi)部檢測。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 董虹玲，夏廣萍，趙娜夏，等.HPLC法測定靈芝子實(shí)體和孢子粉中靈芝酸C2、靈芝酸G和靈芝酸A[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2013， 28（1）：41-43.