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        紫外分光光度法快速測定龍泉破壁靈芝孢子粉三萜含量

        2017-03-27 16:35:15葉銀鵬葉偉平周虎饒璐珊
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年2期
        關(guān)鍵詞:紫外分光光度法龍泉市三萜

        葉銀鵬+葉偉平+周虎+饒璐珊

        摘要:選取5種龍泉破壁靈芝孢子粉為研究對象,使用紫外分光光度法,建立了一種快速、簡單、高靈敏度,專門針對靈芝孢子粉中三萜測定的方法。結(jié)果表明,該方法測得龍泉破壁靈芝孢子粉三萜含量為2.94%~3.43%。熊果酸濃度在20~140 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,精密度(RSD)為0.88%,回收率為88.6%~92.5%,完全能夠滿足于破壁靈芝孢子粉中三萜成分的分析研究。

        關(guān)鍵詞:紫外分光光度法;靈芝孢子粉;三萜;龍泉市

        中圖分類號:R932 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2017)02-0329-02

        靈芝[Ganoderma lucidum(Leyss. ex Fr.) Karst.]是擔(dān)子菌綱多孔科靈芝屬真菌,具有極高的藥用價(jià)值。靈芝生長成熟后從菌蓋彈射出非常小的孢子即靈芝孢子,靈芝孢子聚集在一起即成為靈芝孢子粉[1-3]。靈芝孢子粉富含三萜、蛋白質(zhì)和氨基酸、多糖等有效成分,其中具有抗腫瘤、抗HIV-1型病毒、護(hù)肝、解毒和改善記憶力等藥理活性的三萜更是廣泛受到人們的關(guān)注[4]。龍泉野生靈芝資源豐富,是天然的“靈芝菌種庫”,素有“中華靈芝第一鄉(xiāng)”的美譽(yù)。2011年,龍泉靈芝孢子粉被國家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。因此,快速測定龍泉靈芝孢子粉中三萜含量,對其原產(chǎn)地品質(zhì)鑒定以及有效活性分析具有重要意義。目前,靈芝孢子粉三萜的檢測尚沒有統(tǒng)一國家標(biāo)準(zhǔn),僅能參照農(nóng)業(yè)部在2001年頒布的檢測靈芝及其產(chǎn)品中總?cè)坪康膫浒笜?biāo)準(zhǔn)(NY/SJ 339-2001)進(jìn)行。由于該方法不是專門針對靈芝孢子粉三萜含量的檢測標(biāo)準(zhǔn),存在標(biāo)準(zhǔn)取樣體積過少,造成標(biāo)準(zhǔn)曲線不準(zhǔn)等缺陷。

        本研究利用紫外分光光度法,以乙酸乙酯為提取劑,采用熱超聲提取技術(shù),對龍泉破壁靈芝孢子粉的三萜含量進(jìn)行檢測,同時(shí)建立了一種專門針對靈芝孢子粉三萜含量的快速、簡單的檢測方法,對于靈芝孢子粉生產(chǎn)企業(yè)具有較好的應(yīng)用意義。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑

        熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(GR,99%)、香草醛(AR,99%)、乙酸乙酯(AR,99%)購自上海麥恪林生化科技有限公司;冰醋酸(CH3COOH,GR)購自麗水宏大化學(xué)用料有限公司;水為超純水,由ULUP-Ⅳ-20T超純水儀制備,電阻率>18.25 MΩ·cm。

        1.2 儀器

        UV-8000紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);AL104電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);SK8210HP超聲波清洗器(上??茖?dǎo)超聲波儀器有限公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);THD-0506低溫恒溫槽(寧波天恒儀器廠)。

        1.3 方法

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶中,即得200 mg/L熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

        1.3.2 樣品處理 精密稱取靈芝孢子粉0.5 g(精確到0.000 1 g)放入50 mL的離心管中,加入20 mL乙酸乙酯,放入超聲波清洗器中超聲30 min,超聲功率為53 kHz,溫度60 ℃。超聲結(jié)束后,將上層清液過濾至50 mL的容量瓶中,再加入20 mL乙酸乙酯到沉淀物中重復(fù)上述操作,合并2次上清液,定容至50 mL容量瓶,即得樣品提取液。

        1.3.3 樣品測定 取0.3 mL提取液于60 ℃水浴蒸干,然后加入0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和 1.00 mL高氯酸,在60 ℃水浴加熱15 min并移入冰水浴中;再加入5.00 mL冰乙酸,搖勻后置于室溫;15 min后在548 nm波長下測定樣品溶液的吸光度。精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)對照溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL,按上述優(yōu)選條件及步驟在548 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),熊果酸含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程,考察熊果酸在相關(guān)濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。

        1.3.4 計(jì)算 破壁靈芝孢子粉中三萜含量測定應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算,樣品中的三萜含量(X)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示,如下式所示:

        X=(50/0.3)C/1 000·m×100%

        式中,m為試樣靈芝孢子粉樣品質(zhì)量(g);C為提取液中三萜濃度(mg);X為靈芝孢子粉三萜含量(%)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 線性方程

        按“1.3.3”條件精確吸取相應(yīng)體積數(shù)的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在進(jìn)行測定,根據(jù)吸光度與濃度進(jìn)行回歸分析,考察三萜在相關(guān)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系。以吸光度為縱坐標(biāo),質(zhì)量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示),回歸方程y=0.007 26x-0.051 29,r=0.999 79,表示吸光度與熊果酸含量在20~140 μg圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。在548 nm處的方法檢出限為3.9 μg。

        2.2 靈芝孢子粉三萜含量測定分析

        從市場購買5種不同品牌產(chǎn)自龍泉的破壁靈芝孢子粉樣品。樣品處理根據(jù)上述提取方法和檢測方法進(jìn)行,檢測結(jié)果如表1所示。從表1中可看出,兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值小于10%。5種來自龍泉的破壁靈芝孢子粉的三萜含量為2.94%~3.43%,不同廠家的龍泉靈芝孢子粉三萜含量差別不大。表明龍泉產(chǎn)區(qū)的破壁靈芝孢子粉的三萜含量相對穩(wěn)定。

        2.3 精密度試驗(yàn)

        為了考察該方法的精密度,進(jìn)行精密度試驗(yàn)。取1#樣品提取液5份,每份0.3 mL,按上述檢測方法檢測三萜含量。連續(xù)進(jìn)樣5次測定吸光度,并計(jì)算每種樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。從表2可以看出,該方法的RSD為0.88%,精密度良好。

        2.4 加標(biāo)試驗(yàn)

        為了驗(yàn)證該方法的可行性,進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)。配制100 mg/mL的熊果酸溶液,作為加標(biāo)試驗(yàn)用。取樣品0.5 g,放入50 mL比色管。取0.5 mL濃度為100 mg/mL的熊果酸溶液,加入上述比色管中。樣品前處理以及檢測過程分別按“1.3.2”和“1.3.3”進(jìn)行,結(jié)果如表3所示,該方法檢測靈芝孢子粉的回收率為88.6%~92.5%,表明該方法應(yīng)用于靈芝孢子粉三萜的提取是可行的。

        3 結(jié)論與討論

        本研究以龍泉靈芝孢子粉為研究對象,選用低毒的乙酸乙酯為提取液,利用紫外分光光度法快速測定三萜含量,樣品處理僅通過恒溫超聲后進(jìn)行UV分析,簡單高效。本研究建立的快速、簡單、高靈敏度、環(huán)保的紫外分光光度法專門針對破壁靈芝孢子粉三萜含量檢測,并且針對線性、精密度、回收率等進(jìn)行了方法驗(yàn)證。結(jié)果表明,該方法測得龍泉靈芝孢子粉三萜含量為2.94%~3.43%。熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在20~140 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,精密度(RSD)為0.88%,回收率為88.6%~92.5%。并且該方法所用的儀器設(shè)備簡單,提取溶劑經(jīng)濟(jì)環(huán)保,提取技術(shù)簡單高效,尤其適合應(yīng)用于靈芝孢子粉企業(yè)內(nèi)部檢測。

        參考文獻(xiàn):

        [1] 林志彬,王鵬云.靈芝孢子及其活性成分的藥理研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,38(5):541-547.

        [2] 唐 柳,張志軍,魏雪生,等.靈芝孢子粉藥理作用研究進(jìn)展[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,17(3):25-28.

        [3] 嚴(yán)培蘭.破壁時(shí)間對靈芝孢子粉中有效成分測定的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,30(3):42-44.

        [4] 董虹玲,夏廣萍,趙娜夏,等.HPLC法測定靈芝子實(shí)體和孢子粉中靈芝酸C2、靈芝酸G和靈芝酸A[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2013, 28(1):41-43.

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