孫沖+王道營??+張牧焓??+張淼??+卞歡??吳海虹??+諸永志??+耿志明??+徐為民

摘要：為了分析氧合肌紅蛋白（OxyMb）的穩(wěn)定性，分別采用紫外分光光度法、圓二色譜法研究在不同溫度（20～60 ℃）、pH值（3.0～11.0）、鹽濃度（1%～5%）條件下OxyMb的蛋白結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，OxyMb穩(wěn)定性減弱；當(dāng)溫度高于40 ℃后，OxyMb的結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，氧化顯著加?。籓xyMb在中性環(huán)境下的氧化還原穩(wěn)定性最高，同時(shí)OxyMb在偏堿性環(huán)境中的氧化還原穩(wěn)定性比偏酸性條件中的高；在鹽濃度不太高的范圍內(nèi)（1%～5%），鹽濃度高低對(duì)OxyMb的自動(dòng)氧化沒有明顯影響。

關(guān)鍵詞：氧合肌紅蛋白（OxyMb）；穩(wěn)定性；紫外分光光度法；圓二色譜法

中圖分類號(hào)： S185；TS251.5+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0360-03

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是存在于動(dòng)物肌肉組織細(xì)胞中儲(chǔ)存氧、分配氧的色素蛋白質(zhì)，由1條多肽鏈構(gòu)成的珠蛋白（globin）、1個(gè)血紅素輔基（1個(gè)卟啉環(huán)與Fe的絡(luò)合物）構(gòu)成。Mb的含量依賴于動(dòng)物的種類、性別、年齡、營養(yǎng)狀況、肌肉活動(dòng)、氧氣消耗率、血液循環(huán)、肌肉類型及肉的處理方式等[1]。在放血充分的肌肉中，Mb是色素物質(zhì)的主要成分，它與肉類顏色的深淺呈正相關(guān)，因此Mb的穩(wěn)定性也會(huì)影響肉色的穩(wěn)定性[2-3]。肌肉中的Mb主要以氧合肌紅蛋白（OxyMb）的形式存在，研究表明，許多因素會(huì)影響OxyMb的氧化，主要包括溫度、高鐵肌紅蛋白（MetMb）還原系統(tǒng)活性、氧分壓以及脂質(zhì)氧化。高溫、低pH值以及非血紅素鐵的存在會(huì)使OxyMb更易氧化?；铙w內(nèi)存在的MetMb還原系統(tǒng)可分為酶系、非酶系，它能維持肌肉中的還原狀態(tài)，并能將MetMb還原成OxyMb，使肌肉中MetMb的水平維持在2%～3%左右。宰后肉中的OxyMb逐漸發(fā)生自動(dòng)氧化轉(zhuǎn)變?yōu)镸etMb，血紅素鐵被氧化，肉色發(fā)生褐變[4]。良好、正常的肉色能很好地激起消費(fèi)者的購買欲望，從而較好地促進(jìn)銷售；相反，貨架期內(nèi)的變色會(huì)給肉及肉制品市場帶來不可低估的負(fù)面影響。

相關(guān)研究表明，Mb氧化過程能促進(jìn)脂質(zhì)氧化，這一過程受很多因素影響，包括pH值、MetMb含量、血紅素的結(jié)合力、鐵離子的游離程度等，同時(shí)一些脂質(zhì)氧化產(chǎn)物也能加速進(jìn)肌肉中Mb的氧化和劣變[5-8]。本研究以豬肉糜中提取所得Mb為研究對(duì)象，并將其制備成OxyMb，研究離體條件下不同pH值、溫度、鹽度對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響，確定影響肉色穩(wěn)定的外界因素以及穩(wěn)定肉色的措施，以期為改善肉色穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮豬肉購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。無水乙醇、Tris、鹽酸、硫酸銨、連二亞硫酸鈉、磷酸二氫鉀等均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備有M124A萬分之一分析天平、T18型高速勻漿機(jī)、UV-6100分光光度計(jì)、圓二色譜儀、K3冷凍離心機(jī)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、DGG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、KQ-300GVDV型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1肌紅蛋白的提取肌紅蛋白的提取參考相關(guān)文獻(xiàn)并適當(dāng)改進(jìn)[9-10]。取100 g肉糜與300 mL預(yù)冷的萃取介質(zhì)（10 mmol/L Tris-HCl，pH值=8.5）混勻，13 000 r/min勻漿2 min；然后在4 ℃條件下于10 000×g離心15 min，吸出上清液，置于65%飽和度的硫酸銨中鹽析1 h；上清液于10 000 g離心15 min，取粉紅色的濾液，于-20 ℃儲(chǔ)存待用。

1.2.2OxyMb的制備和表征利用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度后，調(diào)整濃度至2 mg/mL，立即使用。取5 mL Mb、50 mg連二亞硫酸鈉反應(yīng)即得氧合肌紅蛋白（OxyMb）。樣品中多余的連二亞硫酸鈉可通過10倍體積預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=7.0）透析除去，透析液換20次。將透析后的OxyMb濃度調(diào)至0.2 mg/mL?？偧〖t蛋白含量、OxyMb的含量根據(jù)Krzywicki的方法[11]計(jì)算，具體公式如下：

以50 mmol/L、pH值=7.0的磷酸鹽緩沖液作對(duì)照，將提取的Mb、OxyMb溶液分別在350～700 nm波長處用紫外分光光度計(jì)掃描。蛋白結(jié)構(gòu)采用圓二色譜儀進(jìn)行表征，圓二色譜儀測試參數(shù)：參比溶液為PBS，石英比色皿厚度為1 mm，掃描范圍180～320 nm，步階為1.0 nm。

1.2.3溫度對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響取3 mL制備的OxyMb溶液（pH值=7.0） 分別置于20、30、40、50、60 ℃水浴中加熱10 min，然后將樣品取出迅速浸入冰中，防止溫度繼續(xù)上升。再于4 000 r/min離心5 min后立即用紫外分光光度計(jì)分別掃描350～700 nm波長下的光譜，根據(jù)上述Krzywicki公式計(jì)算MetMb含量。蛋白結(jié)構(gòu)采用圓二色譜儀進(jìn)行表征。

1.2.4pH值對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響OxyMb溶液用10倍體積，pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0預(yù)冷 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液透析15 h，再于4 000 r/min離心 5 min。所有的操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。取5種pH值的溶液，分別用紫外分光光度計(jì)掃描350～700 nm波長下的光譜，根據(jù)上述Krzywicki公式計(jì)算MetMb含量。采用圓二色譜儀對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.2.5鹽度對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響在OxyMb溶液中分別加入1%、2%、3%、4%、5%氯化鈉，再于4 000 r/min離心 5 min。所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。取5種不同鹽濃度的溶液，分別用紫外分光光度計(jì)掃描350～700 nm波長下的光譜，根據(jù)上述Krzywicki公式計(jì)算MetMb含量。蛋白結(jié)構(gòu)采用圓二色譜儀進(jìn)行表征。

2結(jié)果與分析

2.1Mb的提取、OxyMb的制備和表征

肉糜中提取的Mb粗提液經(jīng)65%硫酸銨沉淀后，得到紅褐色溶液，進(jìn)一步制備得到OxyMb。圖1顯示，Mb在412、541、574 nm處有吸收峰，OxyMb溶液在407、538、568 nm處有吸收峰[12]。圓二色譜可以用來研究Mb、OxyMb蛋白結(jié)構(gòu)的變化情況。由圖2可見，Mb在228 nm處有1個(gè)負(fù)峰；當(dāng)加入連二亞硫酸鈉制備OxyMb，在234 nm處出現(xiàn)1個(gè)負(fù)峰。結(jié)合光譜結(jié)果可知，OxyMb已經(jīng)成功制備，蛋白結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生較大改變。

2.2溫度對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響通過紫外掃描光譜及圓二色譜可表征。由圖3、圖4可知：當(dāng)溫度為20、30、40 ℃時(shí)，OxyMb的紫外吸收光譜及圓二色譜圖均表明其結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化不大，但是含量逐漸降低；同時(shí)通過計(jì)算可知，高鐵肌紅蛋白的生成量在20、30、40 ℃分別為（33.92±0.012）%、（3799±0.015）%、（43.86±0.013）%，逐漸提高；但在50～60 ℃時(shí)，OxyMb在350～450 nm的峰形及吸光度明顯降低，

圓二色譜顯示其特征吸收峰極大減弱，表明OxyMb的結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，蛋白變性加劇；同時(shí)通過計(jì)算高鐵肌紅蛋白的含量[50、60 ℃分別為（61.34±0.015）%、（66.12±0.017）%]可知，含量明顯增大。這些結(jié)果是由于肌紅蛋白的熱穩(wěn)定性受其結(jié)構(gòu)影響所造成的[12-15]。

2.3pH值對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖5、圖6可見不同pH值下OxyMb穩(wěn)定性的變化。OxyMb特征吸收峰由大到小排序?yàn)閜H值=7.0>pH值=90>pH值=11.0>pH值=5.0，表明OxyMb在中性溶液中穩(wěn)定性最高，偏堿性環(huán)境穩(wěn)定性較偏酸性環(huán)境高。但是在pH值=3的溶液中，OxyMb沉淀完全，說明在極酸性的環(huán)境中血紅素和球蛋白之間的共價(jià)鍵被破壞[16-17]。這些結(jié)果可能是由于在中性環(huán)境下，OxyMb的空間結(jié)構(gòu)沒有被破壞，而堿性條件下血紅素解離，OxyMb結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

2.4鹽度對(duì)OxyMb穩(wěn)定性的影響

在制備好的OxyMb溶液中分別加入不同NaCl，使其鹽濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%。由圖7、圖8可以看出：低鹽度的溶液中（1%）穩(wěn)定性最高；2%～5%鹽濃度下，OxyMb特[CM（25]征吸收峰相差不大；通過計(jì)算可知，不同鹽濃度對(duì)應(yīng)高鐵[CM）]

肌紅蛋白的生成量[1%、2%、3%、4%、5%鹽濃度分別為（20.19±0.01）%、（21.36±0.012）%、（22.64±0.011）%、（24.0±0.009 5）%、（25.09±0.014）%]也沒有明顯差異，說明OxyMb受鹽濃度的影響不大。

3結(jié)論

研究結(jié)果表明，隨著溫度的升高，OxyMb穩(wěn)定性減弱；當(dāng)溫度高于40 ℃后，OxyMb的結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，氧化顯著加劇?？梢奜xyMb在中性環(huán)境下氧化還原穩(wěn)定性最高；同時(shí)，OxyMb在偏堿性的環(huán)境中比偏酸性條件下的氧化穩(wěn)定性要高；在鹽濃度不太高的范圍內(nèi)（1%～5%），鹽濃度的高低對(duì)OxyMb的自動(dòng)氧化沒有明顯影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]Perutz M F. Mechanisms regulating the reactions of human hemoglobin with oxygen and carbon monoxide[J]. Annual Review of Physiology，1990，52（1）：1-25.

[2]Mancini R A，Hunt M C. Current research in meat color[J]. Meat Science，2005，71（1）：100-121.

[3]Bekhit A E，F(xiàn)austman C. Metmyoglobin reducing activity[J]. Meat Science，2005，71（3）：407-439.

[4]Maqsood S，Benjakul S. Comparative studies on molecular changes and pro-oxidative activity of haemoglobin from different fish species as influenced by pH[J]. Food Chemistry，2011，124（3）：875-883.

[5]Sohn J H，Taki Y，Ushio H，et al. Lipid oxidations in ordinary and dark muscles of fish：influences on rancid off-odor development and color darkening of yellowtail fresh during ice storage[J]. Journal of Food Science，2005，70（7）：490-496.

[6]Rawdkuen S，Jongjareonrak A，Benjakul S，et al. Discoloration and lipid deterioration of farmed giant catfish （Pangasianodon gigas） muscle during refrigerated storage[J]. Journal of Food Science，2008，73（3）：C179-C184.

[7]Lee S，Phillips A L，Liebler D C，et al. Porcine oxymyoglobin and lipid oxidation in vitro[J]. Meat Science，2003，63（2）：241-247.

[8]Lee B J，Hendricks D G，Cornforth D P. A comparison of carnosine and ascorbic acid on color and lipid stability in a ground beef pattie model system[J]. Meat Science，1999，51（3）：245-253.

[9]Trout G R，Gutzke D A. A simple，rapid preparative method for isolating and purifying oxymyoglobin[J]. Meat Science，1996，43（1）：1-13.[ZK）]

[10]陳景宜，牛力，黃明，等. 牛心氧合肌紅蛋白的分離純化及氧化穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學(xué)，2013，34（13）：1-5.

[11]Krzywicki K. The determination of heam pigments in meat[J]. Meat Science，1982，7（7）：29-36.

[12]林森森，廖明濤，劉書臣，等. 鰹魚4 ℃貯藏期間色素物質(zhì)及脂質(zhì)氧化的變化[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2014，14（7）：87-94.

[13]Ueki N，Chow C J，Ochiai Y. Characterization of bullet tuna myoglobin with reference to thermostability-structure relationship[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2005，53（12）：4968-4975.

[14]Ueki N，Ochiai Y. Primary structure and thermostability of bigeye tuna myoglobin in relation to those of other scombridae fish[J]. Fisheries Science，2004，70（5）：875-884.

[15]Ueki N，Ochiai Y. Effect of amino acid replacements on the structural stability of fish myoglobin[J]. Journal of Biochemistry，2006，140（5）：649-656.

[16]Chaijan M，Benjakul S，Visessanguan W A. Characterisation of myoglobin from sardine （Sardinella gibbosa） dark muscle[J]. Food Chemistry，2007，100（1）：156-164.

[17]Renerre M，Anton M，Gatellier P. Autoxidation of purified myoglobin from two bovine muscles[J]. Meat Science，1992，32（3）：331-342.