尹志東 孔維珂 程路

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是其最常見類型。晚期NSCLC患者主要依賴藥物維持生存期，針對存在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變的晚期患者一般采用分子靶向治療，但通常1年左右會產(chǎn)生耐藥。近年來，對NSCLC非手術治療的研究熱點正趨于由靶向治療逐步轉(zhuǎn)向免疫治療。針對免疫檢查點程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）及其配體1（prograrmrled death ligand-1，PDL1）的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）是晚期肺癌治療的新進展。有文獻揭示了PD-1/PD-L1通路與EGFR通路存在相互作用，既往有研究顯示EGFR基因突變的患者接受ICIs治療后生存期及存活率并未顯著提高［1］。本研究主要探討晚期NSCLC組織中EGFR基因突變與PD-L1蛋白表達及臨床病理特征之間的關系，希望在肺癌的個體化治療及預后評估方面能提供更多的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年7月至2021年12月浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院濱江院區(qū)病理科已確診晚期非小細胞肺癌（NSCLC）病例74例。其中男50例，女24例；年齡33～88歲，平均年齡60.5歲；≥70歲38例，＜70歲36例；有吸煙史35例，無吸煙史39例；腫瘤細胞低分化25例，非低分化49例，腫瘤類型腺癌59例，非腺癌15例；TNM分期III期22例，IV期52例；遠處轉(zhuǎn)移骨轉(zhuǎn)移35例，腦轉(zhuǎn)移12例，肝轉(zhuǎn)移6例，腎上腺轉(zhuǎn)移6例等。

1.2 實驗材料及儀器 NSCLC石蠟組織樣本，核酸提取試劑盒（艾德生物），無水乙醇，二甲苯，恒溫加熱器，離心機，渦旋混合儀，紫外分光光度計，熒光PCR法人類EGFR基因外顯子突變18-21檢測試劑盒（艾德生物），SLAN全自動醫(yī)用PCR分析儀，電腦，免疫組織化學法PD-L1（艾德生物），Leica BAND-III全自動染色機，75%、85%和95%乙醇，中性樹膠，蓋玻片，顯微鏡等。

1.3 熒光定量PCR法檢測EGFR基因突變 取經(jīng)過HE片評估后的NSCLC石蠟組織進行離心管脫蠟，根據(jù)艾德生物核酸提取試劑盒的操作方法和步驟進行組織裂解和DNA的提取。用微量紫外分光光度計測定DNA的濃度，需保證DNA濃度＞2 ng/μL且DNA的OD260/OD280應介于1.8～2.1。檢測前，將樣本的DNA濃度稀釋至1.5～3 ng/μL，根據(jù)艾德生物熒光PCR法人類EGFR基因外顯子突變18-21檢測試劑盒的檢驗方法和步驟加好PCR反應板，之后采用SLAN全自動醫(yī)用PCR分析儀進行上機檢測。檢測時設立陽性對照、陰性對照和空白對照。根據(jù)說明書上提供的PCR反應曲線和Ct值進行結(jié)果判定。

1.4 免疫組織化學法檢測PD-L1蛋白表達 切取厚度3～5 μm已選好的NSCLC石蠟組織樣本，將其粘附于陽離子防脫玻片上，玻片置于68 ℃烤片機上烤片1 h，以制成石蠟切片。玻片采用Leica BAND-III全自動染色機進行免疫組化染色，染色機主要經(jīng)過脫蠟、抗原修復、封閉、一抗、二抗、顯色、復染、清洗等步驟。上機時設置陽性對照、陰性對照和空白對照。下機后進行組織玻片的脫水和封片。病理醫(yī)生對免疫組織化學檢測結(jié)果進行判讀及腫瘤細胞陽性比例（TPS）評分，PD-L1著色于腫瘤細胞的細胞膜。腫瘤細胞染色結(jié)果：TPS＜1%為陰性（不表達），即＜1%的腫瘤細胞膜呈現(xiàn)不同程度的著色或完全無著色；TPS≥1%為陽性（表達），即≥1%的腫瘤細胞膜呈現(xiàn)不同程度的著色或完全著色。其中TPS處于1%～49%為弱陽性（低表達），TPS≥50%為強陽性（高表達）。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗，EGFR基因突變狀態(tài)與PD-L1表達情況的相關性分析采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 晚期NSCLC中EGFR基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的關系 在晚期NSCLC患者中，EGFR基因突變率為43.24%（32/74），其中有17例患者EGFR基因第19個外顯子發(fā)生突變，12例患者EGFR基因第21個外顯子發(fā)生突變，2例患者EGFR基因第20個外顯子發(fā)生突變，1例患者EGFR基因第20個外顯子和第21個外顯子均發(fā)生突變。EGFR基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的關系結(jié)果如下：IV期肺癌和腺癌患者的突變率較高（P=0.02和0.042），無吸煙史、腫瘤細胞低分化、女性和腦轉(zhuǎn)移患者更傾向于具有較高的EGFR突變率（P值分別為0.052、0.163、0.189和0.074），突變率與患者年齡和骨轉(zhuǎn)移情況均無關（P＞0.05，表1）。

表1 晚期NSCLC中EGFR突變和PD-L1表達與臨床病理特征的關系（n）

2.2 晚期NSCLC中PD-L1表達情況與臨床病理特征的關系 在晚期NSCLC患者中，腫瘤細胞TPS評分≥1%的患者占比率為60.81%（45/74），其中TPS評分介于1%～＜50%之間的占比率為71.11%（32/45），TPS評分≥50%的占比率為28.89%（13/45）（見圖1）。腫瘤細胞低分化患者更傾向于具有較高的PD-L1表達率（P=0.159），PD-L1陽性表達率與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤類型、TNM分期、骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移均無明顯相關性（P＞0.05，表1）。

圖1 晚期NSCLC中PD-L1的表達情況（×200）。注：A. 肺鱗癌的HE染色；B. PD-L1陰性的肺鱗癌病例；C.PD-L1低表達的肺鱗癌病例；D. PD-L1高表達的肺鱗癌病例；E. 肺腺癌的HE染色；F. PD-L1陰性的肺腺癌病例；G. PD-L1低表達的肺腺癌病例；H. PD-L1高表達的肺腺癌病例

2.3 晚期NSCLC中EGFR突變與PD-L1表達的相關性 晚期NSCLC中，EGFR呈現(xiàn)為野生型PD-L1陰性者12例，EGFR呈現(xiàn)為野生型PD-L1陽性者30例，EGFR突變PD-L1陰性者17例，EGFR突變PD-L1陽性者15例；EGFR呈現(xiàn)為野生型PD-L1弱陽性者20例，EGFR呈現(xiàn)為野生型PD-L1強陽性者10例，EGFR突變PD-L1弱陽性者12例，EGFR突變PD-L1強陽性者3例。EGFR突變狀態(tài)與PD-L1表達情況存在負相關（r=-0.249，P=0.032），EGFR基因突變狀態(tài)與PD-L1陽性強弱程度無相關性（P＞0.05，表2）。

表2 晚期NSCLC中EGFR突變與PD-L1表達的相關性分析

3 討論

肺癌是起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，是全球癌癥相關死亡的首要原因，其發(fā)病率和死亡率均較高。NSCLC包括鱗癌、腺癌、大細胞癌，約占肺癌總數(shù)的80%以上，其絕大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，無法手術，其5年生存率較低，系統(tǒng)化療和放療的作用也有限［2-4］。手術治療是NSCLC患者的首選治療，對于已失去手術機會的患者，其治療的首要目標是延長生存期，提高生存質(zhì)量，盡量爭取帶瘤長期生存。以吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼等為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）是EGFR基因突變的晚期肺癌患者分子靶向治療的標準一線治療方案，客觀緩解率可＞70%，但通常1年左右患者會產(chǎn)生耐藥［3-4］。免疫治療是近年來NSCLC非手術治療的研究熱點，針對PD-1/PD-L1的免疫檢查點抑制劑是晚期肺癌治療的新進展，尤其對腫瘤細胞PD-L1高表達的進展期NSCLC患者更有益，如帕博利珠單抗，相比以鉑類為基礎的化療，其可顯著延長患者無進展生存期和總生存期且不良反應發(fā)生率較低［5］。

EGFR是上皮生長因子細胞增殖和信號傳導的受體，是一種跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體。當人體EGFR基因發(fā)生缺失、突變或重排時，EGFR可出現(xiàn)異常表達或高表達，其與腫瘤細胞的增殖、腫瘤血管的生成、腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移、腫瘤的化療抗性和預后密切相關［6］。EGFR基因位于人體第7號染色體短臂上，有28個外顯子。NSCLC患者EGFR基因突變可發(fā)生于很多位點，常見位點主要位于酪氨酸激酶區(qū)18～21外顯子上，其中19和21號外顯子突變占EGFR突變的90%以上［7］。有相關研究顯示，EGFR在NSCLC中的突變率存在較大地域差異性，亞洲人群遠超非亞洲人群，突變率高達50%［8］。本次研究EGFR突變率為43.24%（32/74），其中19和21外顯子突變率占93.75（30/32）。國內(nèi)既往研究表明，EGFR基因突變與非吸煙女性肺腺癌患者密切相關［9］。本次研究表明IV期肺癌和腺癌患者的突變率較高（P=0.02和0.042），無吸煙史、腫瘤細胞低分化、女性和腦轉(zhuǎn)移患者更傾向于具有較高的EGFR突變率（P=0.052、0.163、0.189和0.074），EGFR基因突變率與患者年齡和骨轉(zhuǎn)移情況均無關。

PD-1是免疫球蛋白B7-CD28家族成員之一，主要在T細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞（natural kiiller，NK）、樹突狀細胞、單核-巨噬細胞等腫瘤浸潤性淋巴結(jié)細胞上表達［10］。PD-L1又稱B7-H1或CD274，是PD-1的主要配體。PD-L1與PD-1相結(jié)合，傳遞免疫抑制信號，抑制T細胞的活化和增殖，通過免疫逃逸、抑制免疫應答、逃避殺傷清除機制，增強腫瘤微環(huán)境對機體正常免疫的抵抗作用［11］。2016年免疫檢查點抑制劑PD-1抗體Pembrolizumab 獲批成為晚期NSCLC的一線治療用藥，用藥效果與PD-L1的表達水平相關。目前關于PD-L1在NSCLC中表達的異質(zhì)性研究相對較少，尤其是與臨床病理特征和分子特征之間的相關性方面，結(jié)論有著較大的矛盾，其中PD-L1在NSCLC 中的陽性率為39.9%～53.1%［12］。本次研究PD-L1的陽性表達占60.81%（45/74），其中TPS評分介于1%～49%的占比為71.11%（32/45），TPS評分≥50%的患者占比為28.89%（13/45），腫瘤細胞低分化患者更傾向于具有較高的PD-L1表達率（P=0.159），晚期NSCLC患者中PD-L1陽性表達率與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤類型、TNM分期、骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移均無明顯相關性。

目前，對NSCLC患者的EGFR突變與PD-L1表達的相關性研究結(jié)果存在差異性［13］。本次研究中EGFR基因突變陽性的患者PD-L1陽性表達率低（P=0.032），患者的EGFR基因突變狀態(tài)與PD-L1陽性表達的高低無關（P＞0.05）。EGFR基因突變狀態(tài)與PD-L1陽性表達存在負相關（r=-0.249，P=0.032），EGFR基因突變狀態(tài)與PD-L1陽性強弱程度無相關性。

本次研究是回顧性研究，受限于本研究的病例數(shù)較少，上述部分結(jié)果未達到預設的統(tǒng)計學差異，未來作者將納入更多的病例用于進一步探究EGFR基因突變狀態(tài)與PD-L1蛋白表達情況和上述臨床特征的相關性。本研究分析發(fā)現(xiàn)，VI期不吸煙腺癌患者更易發(fā)生EGFR基因突變，患者的EGFR基因突變狀態(tài)與PD-L1蛋白表達存在負相關性。提示在NSCLC的發(fā)生和發(fā)展過程中EGFR和PD-L1之間可能存在相關作用，希望可以為晚期NSCLC患者的靶向或免疫治療及臨床藥物實驗方面提供新思路。