商能欣 劉翠婷

作者單位：321017浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬金華中醫(yī)院

腸道微生物群是指由細(xì)菌、病毒、真菌和其他影響健康與疾病的微生物組成的復(fù)雜集合體，其中，細(xì)菌占主導(dǎo)地位，是腸道微生物群的主要研究對(duì)象。一百多年前，“乳酸菌之父”伊利亞·梅契尼科夫認(rèn)為：腸道菌群主宰著人類的健康與疾病。嬰兒腸道菌群的建立來源于母親，母親微生物組中的每一個(gè)細(xì)菌都可能在嬰兒生命早期，轉(zhuǎn)移入腸道內(nèi)成為腸道菌群形成的基礎(chǔ)。人類腸道內(nèi)會(huì)寄生10萬億個(gè)細(xì)菌，參與影響機(jī)體大腦、消化和免疫系統(tǒng)等發(fā)育并介導(dǎo)疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘、代謝性和免疫性疾病等均可能存在一個(gè)胎兒起源并與腸道菌群的早期定植變化存在關(guān)聯(lián)［1-3］。因此，明確嬰兒腸道菌群的初始定植時(shí)間，將有助于我們解密某些成人疾病胎兒起源的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，并進(jìn)一步獲取疾病可能的潛在治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)階段，人類腸道菌群的定植始于產(chǎn)前還是產(chǎn)后仍存在廣泛爭(zhēng)議［4］，尚無研究進(jìn)行系統(tǒng)梳理與總結(jié)?；诖?，本文綜述嬰兒腸道菌群定植時(shí)間的研究現(xiàn)狀，分析其初次定植的時(shí)間傾向，為基于腸道菌群而開展的成人疾病胎兒起源研究提供思路與建議。

1 胎兒的物質(zhì)來源途徑

胎兒的誕生始于受精卵，其后受精卵反復(fù)分裂形成囊胚，囊胚植入子宮壁，并在此發(fā)育成胚胎。胚胎附著于胎盤上，被充滿羊水的羊膜囊包被，在受精8周后發(fā)育為胎兒。胎兒在密閉的羊水中漂浮，通過臍帶和胎盤與母體進(jìn)行物質(zhì)交換。因此，羊水、臍帶和胎盤作為胎兒的物質(zhì)來源途徑，與胎兒的聯(lián)系最為密切，此三者的生態(tài)變化可直接影響胎兒。

2 嬰兒早期腸菌定植理論

2.1 “宮內(nèi)菌群定植” 腸道菌群定植于產(chǎn)前 人們普遍認(rèn)為，胎盤具有免疫學(xué)特征，可以阻止菌群進(jìn)入，維持胎兒在宮內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與安全，因此，“無菌子宮”理論深入人心。但隨著檢測(cè)技術(shù)的日益革新，部分學(xué)者提出“宮內(nèi)菌群定植”假說，逐漸打破人們的固有認(rèn)知。

1982年KOVALOVSZKI等［5］通過培養(yǎng)353個(gè)胎盤發(fā)現(xiàn)，16%的胎盤樣本細(xì)菌培養(yǎng)呈陽性，且無任何絨毛膜羊膜炎的組織學(xué)證據(jù)。還有報(bào)道，屬于孕中期階段的人類胎盤在絨毛膜板內(nèi)可培養(yǎng)出需氧菌和厭氧菌［6］。第2年也有報(bào)道，在人類胎盤中發(fā)現(xiàn)了來自母親腸道的細(xì)菌DNA，提示生命早期的腸道菌群定植可能是由母體通過胎盤垂直傳遞給胎兒［7］。

2012年Isolauri團(tuán)隊(duì)利用qPCR技術(shù)在29個(gè)胎盤和羊水樣本中檢測(cè)出細(xì)菌DNA，還發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌DNA與胎兒腸道中先天免疫基因表達(dá)譜的變化相關(guān)［8］。2013年華盛頓大學(xué)微生物學(xué)家Mysorekar和其同事收集195個(gè)人類胎盤，對(duì)胎盤基板進(jìn)行石蠟切片與染色，觀察到近1/3的胎盤攜帶細(xì)菌，且無明顯的炎癥痕跡，通過此次觀察MYSOREKAR等［9］認(rèn)為，母親胎盤基板中的細(xì)菌可能是胎兒腸菌宮內(nèi)定植的來源。2014年Aagaard團(tuán)隊(duì)注意到，新生兒第1周腸道細(xì)菌與母體陰道細(xì)菌并不相似，懷疑腸道菌群的定植可能始于產(chǎn)前，其后他們借助320名產(chǎn)婦的胎盤，在執(zhí)行無菌和陰性對(duì)照的條件下，通過基因測(cè)序在部分胎盤中檢測(cè)出細(xì)菌DNA，并提出腸道菌群的初始定植可能始于產(chǎn)前［10］，這一發(fā)現(xiàn)引起人們對(duì)“宮內(nèi)菌群定植”假說的極大關(guān)注。

近幾年，“宮內(nèi)菌群定植”假說得到進(jìn)一步發(fā)展。2016年，芬蘭學(xué)者在健康產(chǎn)婦的胎盤、羊水和嬰兒胎糞中檢測(cè)出具有共同特征的微生物群，認(rèn)為細(xì)菌在母體與胎兒之間轉(zhuǎn)移，且腸道菌群的定植可能在產(chǎn)前經(jīng)由胎盤和羊水中不同的微生物群啟動(dòng)［11］。2018年有研究利用正常妊娠小鼠模型，發(fā)現(xiàn)孕期（E17）胎鼠腸道內(nèi)存在細(xì)菌DNA，且主要來源于母體胎盤［12］；還有研究招募36對(duì)陰道分娩母嬰和42對(duì)剖宮產(chǎn)母嬰，共收集包括但不限于胎盤、胎膜、羊水和新生兒胎糞在內(nèi)的550個(gè)樣本，通過陰性對(duì)照排除污染，發(fā)現(xiàn)胎糞、胎盤和胎膜中的細(xì)菌組成與分布高度相似，且大約一半的胎盤細(xì)菌序列與母體陰道、直腸和口腔樣本中的細(xì)菌序列相同［13］。2020年有研究分析了39對(duì)母嬰的羊水、母體糞便、陰道液、母體唾液和首次胎糞，發(fā)現(xiàn)胎糞菌群與羊水菌群表現(xiàn)出更多的共同特征，其結(jié)果認(rèn)為胎糞中菌群成分來自母體的多個(gè)部位，但羊水內(nèi)細(xì)菌群落貢獻(xiàn)最大［14］。

綜上所述，研究者們?cè)谔何镔|(zhì)來源途徑的羊水、臍帶和胎盤中均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能存在的痕跡，也觀察到嬰兒糞便中微生物群與羊水和胎盤具有某些相似的聯(lián)系，以上發(fā)現(xiàn)在支持“宮內(nèi)菌群定植”假說的同時(shí)，給“無菌子宮”觀念帶來了沖擊。

2.2 “無菌子宮” 腸道菌群定植于產(chǎn)后 二十世紀(jì)初，法國兒科醫(yī)生Tissier斷言，人類嬰兒在無菌環(huán)境中發(fā)育，并在通過母體產(chǎn)道時(shí)獲得細(xì)菌，此后“無菌子宮”理論開始盛行［15-16］。目前，雖然存在不少研究支持孕期“宮內(nèi)菌群定植”假說，但2016年有報(bào)道，使用兩種DNA純化方法，通過16S rRNA基因測(cè)序和群落分析，卻無法將人類胎盤樣本與陰性污染對(duì)照的細(xì)菌群落進(jìn)行分離［17］。另有研究調(diào)查了20名足月分娩和20名自發(fā)早產(chǎn)的胎盤樣本，通過使用兩種測(cè)序方法，均未得出胎盤中存在微生物這一結(jié)論，研究支持健康胎兒的胚胎期發(fā)育是在無菌環(huán)境中進(jìn)行［18］。

2019年劍橋大學(xué)Gordon團(tuán)隊(duì)分析了537名產(chǎn)婦胎盤，通過使用兩種DNA測(cè)序方法（鳥槍法宏基因組測(cè)序和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序）及不同制造商的DNA提取試劑盒，發(fā)現(xiàn)健康的胎盤中并不能找到細(xì)菌物種，他們的結(jié)果表明，腸道菌群的最初定植應(yīng)始于產(chǎn)后［19］；同年有研究報(bào)道，對(duì)29個(gè)人類胎盤組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，除一個(gè)胎盤組織可能被污染外，其余28個(gè)胎盤組織培養(yǎng)物均未產(chǎn)生細(xì)菌［20］。又一項(xiàng)研究對(duì)胎膜、臍帶和絨毛膜絨毛進(jìn)行采樣，發(fā)現(xiàn)只有在胎盤外才有可能分離出有意義數(shù)量的活細(xì)菌或細(xì)菌DNA，宮內(nèi)細(xì)菌或細(xì)菌DNA的出現(xiàn)與分娩過程中樣品暴露于污染相關(guān)［21］；還有研究表明，如果去除DNA試劑盒和檢測(cè)試劑的污染，將無法識(shí)別出獨(dú)特的胎盤微生物群［22］；同年，動(dòng)物（小鼠和猴）實(shí)驗(yàn)表明，通過分子生物學(xué)技術(shù)和基因測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)胎盤和胎兒組織樣本中存在細(xì)菌定植，研究認(rèn)為接受“宮內(nèi)菌群定植”假說尚為時(shí)過早［23-24］。

2021年有研究利用直腸拭子，于剖腹產(chǎn)期間和抗生素使用之前，收集胎兒出生前胎糞，通過比較陰性對(duì)照和嬰兒糞便發(fā)現(xiàn)，出生前胎糞中并未檢測(cè)到不同于陰性對(duì)照的微生物信號(hào)，該研究認(rèn)為健康足月嬰兒的腸道定植不會(huì)發(fā)生在產(chǎn)前，并且嬰兒胎糞的微生物特征主要反映的是產(chǎn)后獲得的細(xì)菌種群［25］；同年，有報(bào)道通過經(jīng)腹羊膜穿刺術(shù)，研究360名早產(chǎn)且胎膜完整的嬰兒羊膜腔微生物狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在無羊膜內(nèi)炎癥的情況下，從羊水樣本中分離出細(xì)菌可能是實(shí)驗(yàn)過程中樣本受到了污染，而非早期定植或感染［26］；另有報(bào)道對(duì)44名嬰兒的羊水、胎盤和首次胎糞進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)論不支持胎盤或羊水中存在微生物群的觀點(diǎn)，首次胎糞中含有的細(xì)菌跡象似乎是圍產(chǎn)期定植的結(jié)果［27］；還有報(bào)道新生兒胎糞的細(xì)菌含量與未含有任何生物樣本的陰性對(duì)照無明顯差異，且其細(xì)菌培養(yǎng)也支持這一發(fā)現(xiàn)，該研究表明尚無法支持“宮內(nèi)菌群定植”假說［28］。

綜上表明，在嚴(yán)格的取樣和檢測(cè)過程控制下，“宮內(nèi)菌群定植”假說飽受爭(zhēng)議，“無菌子宮”理論仍被認(rèn)可。

3 “宮內(nèi)菌群定植”對(duì)比“無菌子宮”的研究爭(zhēng)議

“宮內(nèi)菌群定植”假說的興起，嚴(yán)重考驗(yàn)著“無菌子宮”理論。雖然研究者已在羊水、胎盤、臍帶血和胎糞中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA［6-8，10-11，13-14］，但仍存在方法學(xué)上的缺陷，削弱著“宮內(nèi)菌群定植”研究結(jié)論的可信度。

“宮內(nèi)菌群定植”研究的現(xiàn)有不足：（1）尚未在胎兒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)活菌：“宮內(nèi)菌群定植”研究中，研究者通過細(xì)菌培養(yǎng)、分子微生物學(xué)技術(shù)和基因測(cè)序等手段，僅檢測(cè)出細(xì)菌DNA而非活菌［6-8，10-11，13-14］，故缺少更直接且客觀的證據(jù)。有報(bào)道，通過培養(yǎng)孕期羊水、胎盤及胎糞中的活菌，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照并無明顯差異［29］。（2）污染：“無菌子宮”支持者認(rèn)為，羊水、胎盤、臍帶血及胎糞的樣本收集和相關(guān)檢測(cè)中，缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)過程的污染控制，導(dǎo)致獲取的數(shù)據(jù)難以真正聚焦宮內(nèi)菌群。有報(bào)道，“宮內(nèi)菌群定植”研究中相關(guān)檢測(cè)試劑存在污染［17，22，29］；另有部分研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中缺乏充足的陰性對(duì)照設(shè)置，故其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有待商榷［7-9］；還有研究檢測(cè)的羊水、胎盤或胎糞樣本是于出生后采集，無法排除生產(chǎn)過程及產(chǎn)后菌群定植的可能，故其研究結(jié)論需要謹(jǐn)慎認(rèn)可［6-11，13-14］。（3）方法學(xué)缺陷：“宮內(nèi)菌群定植”相關(guān)研究中，檢測(cè)方法、存儲(chǔ)條件等均存在差異，部分研究僅使用一種方法檢測(cè)樣本中細(xì)菌存在的痕跡，未進(jìn)行二次驗(yàn)證［6-9，13］，這是否存在檢測(cè)偏移？且研究中樣本獲取時(shí)間、獲取方法和保存途徑等亦未統(tǒng)一，致使研究可重復(fù)性欠佳［30］。（4）“低微生物量”樣品挑戰(zhàn)：現(xiàn)有技術(shù)雖可以高度靈敏地?cái)U(kuò)增極微量的DNA，但任何污染都可能超過僅含有極低微生物量的樣品中的真實(shí)信號(hào)，而胎盤、羊水中細(xì)菌含量較低［10-11，21］，如何避免假陽性結(jié)果和污染問題，仍值得思考。（5）樣本數(shù)據(jù)：雖然“宮內(nèi)菌群定植”支持者收集了幾百個(gè)研究樣本，但僅有部分研究樣本支持了他們的觀點(diǎn)［6，9-10］，且是否存在批次效應(yīng)有待驗(yàn)證，故“宮內(nèi)菌群定植”假說還需要更多的多中心、大規(guī)模的相關(guān)研究支持。（6）臨床研究有限：近幾年臨床中，以“宮內(nèi)菌群定植”為結(jié)果的研究，其數(shù)量低于“無菌子宮”，且這些研究未提供直接的證據(jù)，證明腸道菌群的定植是由母親在孕期垂直傳遞給胎兒。（7）胎兒菌群定植來源矛盾：“宮內(nèi)菌群定植”研究顯示，胎兒菌群定植的微生物來源主要與羊水［14］、胎盤［9，12-13］或者羊水與胎盤［11］高度相關(guān)，并未產(chǎn)生統(tǒng)一而明確的結(jié)論，故其實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待重復(fù)考證。

4 關(guān)于“宮內(nèi)菌群定植”和“無菌子宮”的相關(guān)思考

作者發(fā)現(xiàn)“宮內(nèi)菌群定植”面臨著眾多質(zhì)疑，因?yàn)殛P(guān)于細(xì)菌在孕期從母親轉(zhuǎn)移至胎兒腸道內(nèi)的證據(jù)的可靠度尚不清楚。近幾年，較多的臨床研究結(jié)果側(cè)重支持“無菌子宮”學(xué)說，認(rèn)為腸道菌群的定植應(yīng)該始于出生后［17-20，22，25-28］，但已發(fā)現(xiàn)無脊椎動(dòng)物中共生菌存在垂直傳播的現(xiàn)象［16，31］，表明母體共生菌傳遞可能是一種古老且具有進(jìn)化優(yōu)勢(shì)的機(jī)制，然而該現(xiàn)象在人類中獲得證實(shí)還存在諸多困難。

如果接受“宮內(nèi)菌群定植”假說，隨之而來的問題很多：（1）若胎盤、羊水和臍帶血內(nèi)存在細(xì)菌，這些細(xì)菌是否能真正轉(zhuǎn)移至胎兒身上，并進(jìn)入胎兒腸道內(nèi)定植？（2）與健康相關(guān)的菌群組成和功能特征尚未明確［32］，故出生前胎兒接觸細(xì)菌是如何規(guī)避感染？因?yàn)榧韧芯空J(rèn)為，孕期宮內(nèi)細(xì)菌可能代表感染跡象，這些細(xì)菌可激活機(jī)體免疫應(yīng)答，而過度的免疫炎性反應(yīng)與流產(chǎn)、早產(chǎn)和產(chǎn)后并發(fā)癥等不良結(jié)局相關(guān)，甚至可能增加成年時(shí)慢性疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)［33］。（3）如果腸道菌群的初始定植時(shí)間發(fā)生于產(chǎn)前，那么母體是如何平衡腸道菌群與胎兒間的關(guān)系？Aagaard作為“宮內(nèi)菌群定植”堅(jiān)定的支持者，認(rèn)為胎盤中可能存在微生物，且這些微生物阻止了致病菌在胎兒體內(nèi)的定植，但這種觀點(diǎn)尚需要更多更充分的研究證明。（4）腸道菌群的定植會(huì)對(duì)人類胎兒的生長發(fā)育產(chǎn)生何種影響？其對(duì)健康的胎盤和胎兒是否是必要存在？如果是，腸道菌群又是通過何種機(jī)制影響胎兒？隨著腸-腦軸、腸-肝軸、腸-肺軸等理論的興起，微生物又是如何調(diào)節(jié)復(fù)雜的妊娠過程？

“宮內(nèi)菌群定植”假說沖擊著生殖及生殖免疫等領(lǐng)域。目前，作者認(rèn)為尚無法直接肯定得出嬰兒腸道菌群的早期定植時(shí)間，但能明確嬰兒腸道菌群的廣泛定植發(fā)生于產(chǎn)后。近期研究多傾向支持“無菌子宮”學(xué)說，但要證實(shí)孕期宮內(nèi)無菌也十分困難。明確“宮內(nèi)菌群定植”和“無菌子宮”正確與否，還需要更多高質(zhì)量和可重復(fù)的臨床研究觀察。

綜上所述，作者建議如需開展母嬰腸道菌群與疾病間聯(lián)系的相關(guān)研究，可先立足于腸道菌群代謝產(chǎn)物（可穿過胎盤屏障），從而避免“宮內(nèi)菌群定植”和“無菌子宮”的爭(zhēng)議。