商能欣 劉翠婷

作者單位：321017浙江中醫(yī)藥大學附屬金華中醫(yī)院

腸道微生物群是指由細菌、病毒、真菌和其他影響健康與疾病的微生物組成的復雜集合體，其中，細菌占主導地位，是腸道微生物群的主要研究對象。一百多年前，“乳酸菌之父”伊利亞·梅契尼科夫認為：腸道菌群主宰著人類的健康與疾病。嬰兒腸道菌群的建立來源于母親，母親微生物組中的每一個細菌都可能在嬰兒生命早期，轉移入腸道內成為腸道菌群形成的基礎。人類腸道內會寄生10萬億個細菌，參與影響機體大腦、消化和免疫系統(tǒng)等發(fā)育并介導疾病的發(fā)生與轉歸。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘、代謝性和免疫性疾病等均可能存在一個胎兒起源并與腸道菌群的早期定植變化存在關聯(lián)［1-3］。因此，明確嬰兒腸道菌群的初始定植時間，將有助于我們解密某些成人疾病胎兒起源的發(fā)生和發(fā)展機制，并進一步獲取疾病可能的潛在治療靶點?，F(xiàn)階段，人類腸道菌群的定植始于產前還是產后仍存在廣泛爭議［4］，尚無研究進行系統(tǒng)梳理與總結?；诖?，本文綜述嬰兒腸道菌群定植時間的研究現(xiàn)狀，分析其初次定植的時間傾向，為基于腸道菌群而開展的成人疾病胎兒起源研究提供思路與建議。

1 胎兒的物質來源途徑

胎兒的誕生始于受精卵，其后受精卵反復分裂形成囊胚，囊胚植入子宮壁，并在此發(fā)育成胚胎。胚胎附著于胎盤上，被充滿羊水的羊膜囊包被，在受精8周后發(fā)育為胎兒。胎兒在密閉的羊水中漂浮，通過臍帶和胎盤與母體進行物質交換。因此，羊水、臍帶和胎盤作為胎兒的物質來源途徑，與胎兒的聯(lián)系最為密切，此三者的生態(tài)變化可直接影響胎兒。

2 嬰兒早期腸菌定植理論

2.1 “宮內菌群定植” 腸道菌群定植于產前 人們普遍認為，胎盤具有免疫學特征，可以阻止菌群進入，維持胎兒在宮內環(huán)境的穩(wěn)定與安全，因此，“無菌子宮”理論深入人心。但隨著檢測技術的日益革新，部分學者提出“宮內菌群定植”假說，逐漸打破人們的固有認知。

1982年KOVALOVSZKI等［5］通過培養(yǎng)353個胎盤發(fā)現(xiàn)，16%的胎盤樣本細菌培養(yǎng)呈陽性，且無任何絨毛膜羊膜炎的組織學證據(jù)。還有報道，屬于孕中期階段的人類胎盤在絨毛膜板內可培養(yǎng)出需氧菌和厭氧菌［6］。第2年也有報道，在人類胎盤中發(fā)現(xiàn)了來自母親腸道的細菌DNA，提示生命早期的腸道菌群定植可能是由母體通過胎盤垂直傳遞給胎兒［7］。

2012年Isolauri團隊利用qPCR技術在29個胎盤和羊水樣本中檢測出細菌DNA，還發(fā)現(xiàn)這些細菌DNA與胎兒腸道中先天免疫基因表達譜的變化相關［8］。2013年華盛頓大學微生物學家Mysorekar和其同事收集195個人類胎盤，對胎盤基板進行石蠟切片與染色，觀察到近1/3的胎盤攜帶細菌，且無明顯的炎癥痕跡，通過此次觀察MYSOREKAR等［9］認為，母親胎盤基板中的細菌可能是胎兒腸菌宮內定植的來源。2014年Aagaard團隊注意到，新生兒第1周腸道細菌與母體陰道細菌并不相似，懷疑腸道菌群的定植可能始于產前，其后他們借助320名產婦的胎盤，在執(zhí)行無菌和陰性對照的條件下，通過基因測序在部分胎盤中檢測出細菌DNA，并提出腸道菌群的初始定植可能始于產前［10］，這一發(fā)現(xiàn)引起人們對“宮內菌群定植”假說的極大關注。

近幾年，“宮內菌群定植”假說得到進一步發(fā)展。2016年，芬蘭學者在健康產婦的胎盤、羊水和嬰兒胎糞中檢測出具有共同特征的微生物群，認為細菌在母體與胎兒之間轉移，且腸道菌群的定植可能在產前經由胎盤和羊水中不同的微生物群啟動［11］。2018年有研究利用正常妊娠小鼠模型，發(fā)現(xiàn)孕期（E17）胎鼠腸道內存在細菌DNA，且主要來源于母體胎盤［12］；還有研究招募36對陰道分娩母嬰和42對剖宮產母嬰，共收集包括但不限于胎盤、胎膜、羊水和新生兒胎糞在內的550個樣本，通過陰性對照排除污染，發(fā)現(xiàn)胎糞、胎盤和胎膜中的細菌組成與分布高度相似，且大約一半的胎盤細菌序列與母體陰道、直腸和口腔樣本中的細菌序列相同［13］。2020年有研究分析了39對母嬰的羊水、母體糞便、陰道液、母體唾液和首次胎糞，發(fā)現(xiàn)胎糞菌群與羊水菌群表現(xiàn)出更多的共同特征，其結果認為胎糞中菌群成分來自母體的多個部位，但羊水內細菌群落貢獻最大［14］。

綜上所述，研究者們在胎兒物質來源途徑的羊水、臍帶和胎盤中均發(fā)現(xiàn)細菌可能存在的痕跡，也觀察到嬰兒糞便中微生物群與羊水和胎盤具有某些相似的聯(lián)系，以上發(fā)現(xiàn)在支持“宮內菌群定植”假說的同時，給“無菌子宮”觀念帶來了沖擊。

2.2 “無菌子宮” 腸道菌群定植于產后 二十世紀初，法國兒科醫(yī)生Tissier斷言，人類嬰兒在無菌環(huán)境中發(fā)育，并在通過母體產道時獲得細菌，此后“無菌子宮”理論開始盛行［15-16］。目前，雖然存在不少研究支持孕期“宮內菌群定植”假說，但2016年有報道，使用兩種DNA純化方法，通過16S rRNA基因測序和群落分析，卻無法將人類胎盤樣本與陰性污染對照的細菌群落進行分離［17］。另有研究調查了20名足月分娩和20名自發(fā)早產的胎盤樣本，通過使用兩種測序方法，均未得出胎盤中存在微生物這一結論，研究支持健康胎兒的胚胎期發(fā)育是在無菌環(huán)境中進行［18］。

2019年劍橋大學Gordon團隊分析了537名產婦胎盤，通過使用兩種DNA測序方法（鳥槍法宏基因組測序和16S rRNA擴增子測序）及不同制造商的DNA提取試劑盒，發(fā)現(xiàn)健康的胎盤中并不能找到細菌物種，他們的結果表明，腸道菌群的最初定植應始于產后［19］；同年有研究報道，對29個人類胎盤組織進行細菌培養(yǎng)，除一個胎盤組織可能被污染外，其余28個胎盤組織培養(yǎng)物均未產生細菌［20］。又一項研究對胎膜、臍帶和絨毛膜絨毛進行采樣，發(fā)現(xiàn)只有在胎盤外才有可能分離出有意義數(shù)量的活細菌或細菌DNA，宮內細菌或細菌DNA的出現(xiàn)與分娩過程中樣品暴露于污染相關［21］；還有研究表明，如果去除DNA試劑盒和檢測試劑的污染，將無法識別出獨特的胎盤微生物群［22］；同年，動物（小鼠和猴）實驗表明，通過分子生物學技術和基因測序，未發(fā)現(xiàn)胎盤和胎兒組織樣本中存在細菌定植，研究認為接受“宮內菌群定植”假說尚為時過早［23-24］。

2021年有研究利用直腸拭子，于剖腹產期間和抗生素使用之前，收集胎兒出生前胎糞，通過比較陰性對照和嬰兒糞便發(fā)現(xiàn)，出生前胎糞中并未檢測到不同于陰性對照的微生物信號，該研究認為健康足月嬰兒的腸道定植不會發(fā)生在產前，并且嬰兒胎糞的微生物特征主要反映的是產后獲得的細菌種群［25］；同年，有報道通過經腹羊膜穿刺術，研究360名早產且胎膜完整的嬰兒羊膜腔微生物狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在無羊膜內炎癥的情況下，從羊水樣本中分離出細菌可能是實驗過程中樣本受到了污染，而非早期定植或感染［26］；另有報道對44名嬰兒的羊水、胎盤和首次胎糞進行檢測，其結論不支持胎盤或羊水中存在微生物群的觀點，首次胎糞中含有的細菌跡象似乎是圍產期定植的結果［27］；還有報道新生兒胎糞的細菌含量與未含有任何生物樣本的陰性對照無明顯差異，且其細菌培養(yǎng)也支持這一發(fā)現(xiàn)，該研究表明尚無法支持“宮內菌群定植”假說［28］。

綜上表明，在嚴格的取樣和檢測過程控制下，“宮內菌群定植”假說飽受爭議，“無菌子宮”理論仍被認可。

3 “宮內菌群定植”對比“無菌子宮”的研究爭議

“宮內菌群定植”假說的興起，嚴重考驗著“無菌子宮”理論。雖然研究者已在羊水、胎盤、臍帶血和胎糞中發(fā)現(xiàn)細菌DNA［6-8，10-11，13-14］，但仍存在方法學上的缺陷，削弱著“宮內菌群定植”研究結論的可信度。

“宮內菌群定植”研究的現(xiàn)有不足：（1）尚未在胎兒體內發(fā)現(xiàn)活菌：“宮內菌群定植”研究中，研究者通過細菌培養(yǎng)、分子微生物學技術和基因測序等手段，僅檢測出細菌DNA而非活菌［6-8，10-11，13-14］，故缺少更直接且客觀的證據(jù)。有報道，通過培養(yǎng)孕期羊水、胎盤及胎糞中的活菌，結果顯示與陰性對照并無明顯差異［29］。（2）污染：“無菌子宮”支持者認為，羊水、胎盤、臍帶血及胎糞的樣本收集和相關檢測中，缺乏對實驗過程的污染控制，導致獲取的數(shù)據(jù)難以真正聚焦宮內菌群。有報道，“宮內菌群定植”研究中相關檢測試劑存在污染［17，22，29］；另有部分研究，實驗設計中缺乏充足的陰性對照設置，故其實驗結果的準確性有待商榷［7-9］；還有研究檢測的羊水、胎盤或胎糞樣本是于出生后采集，無法排除生產過程及產后菌群定植的可能，故其研究結論需要謹慎認可［6-11，13-14］。（3）方法學缺陷：“宮內菌群定植”相關研究中，檢測方法、存儲條件等均存在差異，部分研究僅使用一種方法檢測樣本中細菌存在的痕跡，未進行二次驗證［6-9，13］，這是否存在檢測偏移？且研究中樣本獲取時間、獲取方法和保存途徑等亦未統(tǒng)一，致使研究可重復性欠佳［30］。（4）“低微生物量”樣品挑戰(zhàn)：現(xiàn)有技術雖可以高度靈敏地擴增極微量的DNA，但任何污染都可能超過僅含有極低微生物量的樣品中的真實信號，而胎盤、羊水中細菌含量較低［10-11，21］，如何避免假陽性結果和污染問題，仍值得思考。（5）樣本數(shù)據(jù)：雖然“宮內菌群定植”支持者收集了幾百個研究樣本，但僅有部分研究樣本支持了他們的觀點［6，9-10］，且是否存在批次效應有待驗證，故“宮內菌群定植”假說還需要更多的多中心、大規(guī)模的相關研究支持。（6）臨床研究有限：近幾年臨床中，以“宮內菌群定植”為結果的研究，其數(shù)量低于“無菌子宮”，且這些研究未提供直接的證據(jù)，證明腸道菌群的定植是由母親在孕期垂直傳遞給胎兒。（7）胎兒菌群定植來源矛盾：“宮內菌群定植”研究顯示，胎兒菌群定植的微生物來源主要與羊水［14］、胎盤［9，12-13］或者羊水與胎盤［11］高度相關，并未產生統(tǒng)一而明確的結論，故其實驗結果有待重復考證。

4 關于“宮內菌群定植”和“無菌子宮”的相關思考

作者發(fā)現(xiàn)“宮內菌群定植”面臨著眾多質疑，因為關于細菌在孕期從母親轉移至胎兒腸道內的證據(jù)的可靠度尚不清楚。近幾年，較多的臨床研究結果側重支持“無菌子宮”學說，認為腸道菌群的定植應該始于出生后［17-20，22，25-28］，但已發(fā)現(xiàn)無脊椎動物中共生菌存在垂直傳播的現(xiàn)象［16，31］，表明母體共生菌傳遞可能是一種古老且具有進化優(yōu)勢的機制，然而該現(xiàn)象在人類中獲得證實還存在諸多困難。

如果接受“宮內菌群定植”假說，隨之而來的問題很多：（1）若胎盤、羊水和臍帶血內存在細菌，這些細菌是否能真正轉移至胎兒身上，并進入胎兒腸道內定植？（2）與健康相關的菌群組成和功能特征尚未明確［32］，故出生前胎兒接觸細菌是如何規(guī)避感染？因為既往研究認為，孕期宮內細菌可能代表感染跡象，這些細菌可激活機體免疫應答，而過度的免疫炎性反應與流產、早產和產后并發(fā)癥等不良結局相關，甚至可能增加成年時慢性疾病的患病風險［33］。（3）如果腸道菌群的初始定植時間發(fā)生于產前，那么母體是如何平衡腸道菌群與胎兒間的關系？Aagaard作為“宮內菌群定植”堅定的支持者，認為胎盤中可能存在微生物，且這些微生物阻止了致病菌在胎兒體內的定植，但這種觀點尚需要更多更充分的研究證明。（4）腸道菌群的定植會對人類胎兒的生長發(fā)育產生何種影響？其對健康的胎盤和胎兒是否是必要存在？如果是，腸道菌群又是通過何種機制影響胎兒？隨著腸-腦軸、腸-肝軸、腸-肺軸等理論的興起，微生物又是如何調節(jié)復雜的妊娠過程？

“宮內菌群定植”假說沖擊著生殖及生殖免疫等領域。目前，作者認為尚無法直接肯定得出嬰兒腸道菌群的早期定植時間，但能明確嬰兒腸道菌群的廣泛定植發(fā)生于產后。近期研究多傾向支持“無菌子宮”學說，但要證實孕期宮內無菌也十分困難。明確“宮內菌群定植”和“無菌子宮”正確與否，還需要更多高質量和可重復的臨床研究觀察。

綜上所述，作者建議如需開展母嬰腸道菌群與疾病間聯(lián)系的相關研究，可先立足于腸道菌群代謝產物（可穿過胎盤屏障），從而避免“宮內菌群定植”和“無菌子宮”的爭議。