陳璐，李文杰，陳鈺亭，侯鵬宇，陳康，雷生姣，3*

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.河南工業(yè)大學(xué) 國(guó)際教育學(xué)院，河南鄭州 450001；3.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002）

水稻是我國(guó)大多數(shù)居民主要的食物來源，含有人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可提供35%～60% 的熱量[1]?，F(xiàn)代稻米加工技術(shù)根據(jù)其加工方式或口感與營(yíng)養(yǎng)組成可分為糙米和精米。糙米是脫殼后的稻谷不經(jīng)過拋光處理，保留其胚芽、胚乳和米糠層而直接獲得的全谷物米粒，而精米經(jīng)過拋光處理后，不含米糠層。稻米中的大部分礦物質(zhì)、維生素和必需氨基酸存在于其糠層部分[2]。糙米因其保留米糠層而含有較多的纖維類物質(zhì)，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值雖全面，但不易煮爛，且口感差；精米口感細(xì)膩[3]，但營(yíng)養(yǎng)流失嚴(yán)重。為了彌補(bǔ)精米和糙米的營(yíng)養(yǎng)與食用缺陷性，研究人員對(duì)大米的加工精度與糠層的保留率進(jìn)行了大量的研究[4-5]，但是從精米表面結(jié)構(gòu)出發(fā)，研究酶解對(duì)其表面淀粉作用后負(fù)載功能性物質(zhì)，進(jìn)而提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的鮮見。

現(xiàn)代社會(huì)由于生活節(jié)奏快，亞健康人群比例逐年上漲，合理的稻米營(yíng)養(yǎng)尤為重要[6]。本研究以精制的東北珍珠大米為原料，對(duì)其進(jìn)行整粒α-淀粉酶酶解處理，以有機(jī)硒為代表功能性物質(zhì)，研究酶解后表面具有孔隙結(jié)構(gòu)大米的負(fù)載性質(zhì)，探究酶解對(duì)大米表面結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性的影響，為開發(fā)負(fù)載功能性的米制品提供一種新的加工方法，具有理論意義和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北珍珠米：市售；α-淀粉酶（10 000 U/g）：邢臺(tái)萬達(dá)生物科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品、氫氧化鈉、鹽酸、硝酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸：上海展云化工有限公司；苯酚：上海麥克林生化科技有限公司；亞硫酸鈉：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；碘：天津市北辰方正試劑廠；碘化鉀：上海銀碘化工有限公司；酵母β-葡聚糖（硒含量20 μg/g）：廣州正廣生物科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZW06150626O4 紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；ME204E 電子天平：梅特勒-托厲多儀器（上海）有限公司；DK-S12 恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LG10-2.4A 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；JSM-7500F 掃描電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社；Ultima IV X-射線粉末衍射儀：日本理學(xué)株式會(huì)社；STA449F5 同步熱分析儀：德國(guó)耐馳儀器制造有限公司；TA.XT Plus C 物性測(cè)試儀：英國(guó)Stable Micro System公司；FS5 熒光光譜儀：英國(guó)愛丁堡公司；C1 電飯煲：上海純米科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大米酶解條件單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 大米的酶解方法

以淀粉水解度為主要指標(biāo)，分別考察酶添加量（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%）、 酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60 ℃）、酶解時(shí)間（20、40、60、80、100、120、140、160、180 min）對(duì)大米淀粉水解度的影響。

1.3.1.2 淀粉水解度測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：參考王莉麗等[7]中的方法并作適當(dāng)修改。準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 的1.0 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至25 mL 比色管中，蒸餾水補(bǔ)足至2.0 mL，加入2.0 mL 二硝基水楊酸試劑，搖勻后沸水浴加熱5 min，迅速置于冰水冷卻至室溫，定容至25.0 mL，在540 nm 處測(cè)定其吸光度。以葡萄糖質(zhì)量（Y1）與吸光值（X1）繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y1=5.456 7X1＋0.107 4（R2=0.999 7）。在0.2～1.6 mg 范圍內(nèi)，葡萄糖質(zhì)量與吸光值呈良好的線性關(guān)系。

可溶性還原糖的測(cè)定：參考陳新峰等[8]的方法并作適當(dāng)修改，在酶解的大米中加入1 mL 的1 mol/mL HCl，對(duì)酶進(jìn)行滅活（未酶解的大米直接取同樣質(zhì)量），加蒸餾水混合均勻定容至100 mL 后過濾待用。取1.0 mL濾液按照葡萄糖測(cè)定方法測(cè)定樣品中的還原糖。

總糖的測(cè)定：酶解前后的大米經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，收集80 目的大米粉，準(zhǔn)確稱取0.5 g 米粉放入250 mL三角瓶中，加入6 mol/L 鹽酸溶液10 mL，于沸水中水解30 min，取1～2 滴于白瓷板上，加1 滴碘-碘化鉀溶液觀察米粉是否水解完全。待水解完全后冷卻至室溫，用6 mol/L NaOH 溶液中和至中性，定容至100 mL，過濾待用。取1.0 mL 濾液按照葡萄糖測(cè)定方法測(cè)定樣品中的還原糖。

所有樣品平行測(cè)定3 次，取平均值進(jìn)行分析，并參照下式計(jì)算淀粉水解度（D，%）。

式中：C0為樣品中本身含有的還原糖質(zhì)量，g ；C1為樣品的總糖質(zhì)量，g ；C2為酶解后大米中的還原糖質(zhì)量，g。

1.3.2 大米特性指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 大米吸水指數(shù)測(cè)定

參考劉艷香等[9]的方法并作適當(dāng)修改，準(zhǔn)確稱取2.0 g 大米原樣或酶解大米，置于已知質(zhì)量的離心管中，加入10 mL 蒸餾水，在室溫下保持1 h，每10 min振蕩一次，3 000 r/min 離心20 min，除去上清液，稱質(zhì)量，吸水指數(shù)（y，g/g）計(jì)算公式如下。

式中：m 為沉淀物質(zhì)量，g；M 為樣品干重，g 。

1.3.2.2 大米質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

使用物性測(cè)試儀對(duì)酶解前后的大米進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。測(cè)試探頭SMS P/36R，參數(shù)設(shè)置為測(cè)試速度1.0 mm/s；觸發(fā)力5 g。

1.3.2.3 米飯食品感官評(píng)價(jià)

分別稱取100 g 酶解前后的大米洗凈，按樣品∶水=1.0∶1.5（質(zhì)量比）置于電飯煲，650 W 蒸煮40 min，對(duì)米飯的氣味、外觀結(jié)構(gòu)、適口性、滋味以及冷飯質(zhì)地指標(biāo)進(jìn)行綜合品評(píng)[10]。綜合得分=氣味×2＋外觀結(jié)構(gòu)×2＋適口性×3＋滋味×2.5＋冷飯質(zhì)地×0.5，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 米飯感官評(píng)定指標(biāo)及分值標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation index and score standard of rice

1.3.2.4 大米表面結(jié)構(gòu)測(cè)定

將樣品烘干，用刀片沿米粒中部、橫軸施加壓力，使其自然斷裂，將適宜大米的樣品表面朝上，表面濺射鍍金后用掃描電鏡觀察，得到放大倍數(shù)為200、500倍和1 000 倍的米粒表面圖像。

1.3.2.5 大米晶型測(cè)定

將樣品研磨成粉，過80 目篩，通過X-射線粉末衍射儀獲得樣品的衍射圖譜，目標(biāo)電壓40 kV，電流30 mA，掃描角度為3°～50°，衍射角為2θ，掃描步長(zhǎng)為0.02/s。

1.3.2.6 大米熱力學(xué)性質(zhì)分析

利用同步熱分析儀測(cè)定酶解前后大米的熱力學(xué)性質(zhì)變化。以10 ℃/min 的加熱速率將樣品從30 ℃加熱至500 ℃，以40 mL/min 流速的氮?dú)鈿夥沼米鞔祾邭怏w。

1.3.3 酶解大米負(fù)載有機(jī)硒

以有機(jī)硒為代表功能性物質(zhì)，準(zhǔn)確稱取1.0 g 酶處理后的大米于250 mL 的三角瓶，再加入0.80 μg/mL的硒溶液10 mL，在30 ℃下吸附30 min，過濾，參考GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》[11]中的熒光分光光度法測(cè)定溶液中的硒含量，富硒量（x，μg/g）計(jì)算公式[12]如下。

式中：WA為硒的質(zhì)量，μg，WB為濾液中硒的質(zhì)量，μg，WC為大米的質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用Origin2018 繪圖，SPSS 20 進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米酶解條件單因素研究結(jié)果

2.1.1 酶添加量對(duì)大米淀粉水解度的影響

酶添加量會(huì)影響酶和大米表面淀粉的接觸面積，進(jìn)而影響淀粉水解速率[13]。固定其他參數(shù)不變，探究酶添加量對(duì)大米表面淀粉水解度的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

圖1 酶添加量對(duì)大米淀粉水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis of rice starch

由圖1 可知，酶添加量在0.8%～1.4%范圍內(nèi)，大米淀粉水解度隨著酶添加量的增加不斷增加；當(dāng)酶添加量超過1.4%后，大米淀粉水解度增加趨勢(shì)減緩，其原因可能是底物中的酶添加量已達(dá)到飽和，過量的酶無法使大米淀粉水解度增加，底物接觸位點(diǎn)不能充分暴露出來[14]，由于大米以整粒狀態(tài)存在，淀粉酶較難作用于顆粒內(nèi)部淀粉，其水解度不再升高。因此以酶添加量為1.4%作后續(xù)研究。

2.1.2 酶解溫度對(duì)大米淀粉水解度的影響

酶解溫度對(duì)酶活影響較大，酶活會(huì)進(jìn)一步影響酶解效果。固定其他參數(shù)不變，探究酶解溫度對(duì)大米淀粉水解度的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 酶解溫度對(duì)大米淀粉水解度的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on hydrolysis degree of rice starch

從圖2 中可知，在酶解溫度30～40 ℃，大米淀粉水解度急劇增加；在酶解溫度大于40 ℃后，大米淀粉水解度增長(zhǎng)趨勢(shì)較為平緩。主要原因是大多數(shù)酶對(duì)溫度敏感，溫度太低酶不易表現(xiàn)出催化活性，溫度太高容易導(dǎo)致酶失活[15]，且會(huì)使大米半熟，因此考慮到實(shí)際生產(chǎn)和節(jié)能，以酶解溫度40 ℃作后續(xù)研究。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)大米水解度的影響

酶解時(shí)間長(zhǎng)短決定了酶對(duì)底物的作用程度[14]。固定其他參數(shù)不變，探究酶解時(shí)間的大米淀粉水解度的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)大米淀粉水解度的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree of rice starch

由圖3 可知，酶解時(shí)間在20～120 min 的范圍內(nèi)，大米淀粉水解度迅速增加，當(dāng)酶解時(shí)間超過120 min時(shí)，其增長(zhǎng)趨勢(shì)較為緩慢。酶解時(shí)間越長(zhǎng)，酶解反應(yīng)越充分，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，大米表面直鏈淀粉減少以及水解產(chǎn)物的增多，對(duì)水解反應(yīng)的抑制作用也逐漸增大[16-17]，水解曲線接近平衡，因此，酶解時(shí)間選擇120 min 較為適宜。

通過單因素結(jié)果可知，在大米質(zhì)量25 g、酶添加量為1.4%、酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間120 min，大米淀粉水解度可達(dá)4.54%。以下特性指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果都以此條件下酶解的大米與原樣大米比較。

2.2 特性指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.2.1 酶解對(duì)大米吸水性的影響

原樣大米的吸水指數(shù)為1.73 g/g，酶解后大米的吸水指數(shù)為1.85 g/g，提高了0.069 倍，這可能是淀粉酶破壞了淀粉的完整性，使大米表面積增加，從而增大了淀粉的水結(jié)合能力[18]。另外，淀粉酶解成孔后，會(huì)降低淀粉結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，水分子也會(huì)更容易進(jìn)入淀粉的內(nèi)部[19]。

2.2.2 酶解對(duì)大米質(zhì)構(gòu)的分析

質(zhì)構(gòu)是大米最重要的食用品質(zhì)之一[20]，尤其是硬度和黏度[21-22]，大米的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)與直鏈淀粉含量相關(guān)，直鏈淀粉含量過高會(huì)導(dǎo)致米飯質(zhì)地較硬，含量過低則會(huì)導(dǎo)致米飯質(zhì)地過軟且無彈性[23]。

通過質(zhì)構(gòu)儀數(shù)據(jù)分析得到酶解前后大米硬度和延展性變化規(guī)律，如表2 所示。

表2 酶解前后大米質(zhì)構(gòu)特性分析Table 2 Analysis of texture characteristics of rice before and after enzymatic hydrolysis

由表2 可知，大米經(jīng)過淀粉酶酶解處理后，其硬度減小，延展性增大，通過SPSS 單因素方差分析發(fā)現(xiàn)酶解處理對(duì)大米的硬度和延展性影響顯著。大米硬度的減小，可能是由于淀粉酶對(duì)直鏈淀粉的水解，直鏈淀粉含量降低，其延展性可能與大米的黏度相關(guān)，直鏈淀粉含量的降低，導(dǎo)致其延展性和黏度的增加。

2.2.3 酶解對(duì)米飯品質(zhì)的影響

通過感官分析得到酶解對(duì)大米蒸煮品質(zhì)的影響，如表3 所示。

表3 酶解對(duì)米飯品質(zhì)的影響Table 3 Effect of enzymatic hydrolysis on rice quality

由表3 可知，酶解對(duì)大米的氣味和滋味影響不大，但對(duì)其外觀結(jié)構(gòu)、適口性和冷飯質(zhì)地影響較明顯，酶解后的大米表面淀粉被水解，使其外觀結(jié)構(gòu)不完整，大米在水解過程中其直鏈淀粉含量的變化可能會(huì)影響其粘度，進(jìn)而影響其適口性和冷飯質(zhì)地，這與大米質(zhì)構(gòu)結(jié)果相符合。

2.2.4 酶解對(duì)大米表面微觀結(jié)構(gòu)的影響

酶解前后大米表面結(jié)構(gòu)電鏡圖如圖4 所示。

圖4 酶解對(duì)大米表面微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis on the surface microstructure of rice

由圖4 可知，酶解處理前后大米表面的微觀結(jié)構(gòu)，原樣大米表面結(jié)構(gòu)緊實(shí)，而酶解處理后大米表面出現(xiàn)孔洞結(jié)構(gòu)，這是由于大米表面的淀粉顆粒被淀粉酶酶解，α-淀粉酶會(huì)使淀粉顆粒表面不平整，有裂紋，孔隙度增加，使淀粉分子分裂成更小的分子，并以麥芽糖的形式存在[24]?？锥创笮〔灰槐砻鞯矸鄣囊恍﹨^(qū)域比其他區(qū)域更易受到酶的影響，這可能是由于淀粉的表面存在空隙和針孔，水解淀粉的表面孔隙是顆粒內(nèi)部的開孔，在淀粉酶酶解過程中淀粉表面的孔結(jié)構(gòu)將變得更大，大部分延伸至中心空腔，使酶可以通過通道和空腔直接進(jìn)入淀粉中心的疏松區(qū)域，導(dǎo)致淀粉顆粒形態(tài)的改變[25]。

2.2.5 酶解對(duì)大米晶體結(jié)構(gòu)的影響

天然的淀粉顆粒由很多放射狀的微晶束組成，具有結(jié)晶性，在X-射線衍射圖中會(huì)呈現(xiàn)出特殊的衍射峰，根據(jù)X-射線衍射圖譜可將淀粉結(jié)晶區(qū)分為A 型、B 型、C 型和V 型[26]。酶解對(duì)大米晶體結(jié)構(gòu)影響如圖5所示。

圖5 酶解前后大米的X-射線衍射Fig.5 X-ray diffraction pattern of rice before and after enzymatic hydrolysis

從圖5 中可以看出，原樣大米和酶處理后的大米均呈現(xiàn)典型的A 型淀粉晶體結(jié)構(gòu)，在15°、17°、18°、23°的衍射角（2θ）處有明顯的衍射峰。但未處理大米結(jié)晶度（74.39%）高于酶解后的大米（73.17%），這可能是酶解處理后大米淀粉的長(zhǎng)程有序結(jié)構(gòu)降低而產(chǎn)生更多的短程有序結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致大米淀粉的結(jié)晶度相對(duì)降低[27]。

2.2.6 酶解對(duì)大米熱分解行為的影響

采用熱重法（thermogravimetric analysis，TG）測(cè)定大米質(zhì)量隨溫度的變化關(guān)系；差式掃描熱量（differential scanning calorimetry，DSC） 測(cè)定酶解前后大米在相同溫度所需要的溫度差，以反映其焓變，分析研究未經(jīng)酶解處理的大米原樣和酶解處理的大米的熱分解行為。在惰性氣體氮?dú)鈼l件下能清楚觀察到淀粉脫水和分解這兩個(gè)獨(dú)立過程[28]。通過同步熱分析儀得出酶解前后大米的熱分解行為，如圖6 所示。

圖6 酶解對(duì)大米的TG-DSC 曲線的影響Fig.6 The effect of enzymatic hydrolysis on the TG-DSC curve of rice

由圖6 可知，原樣大米和酶解處理后的大米都有兩個(gè)階段的重量損失。30～160 ℃為失重的第一階段，這是由于自由水分的蒸發(fā)，255～330 ℃為失重的第二階段，這是由于大米質(zhì)量急劇下降。

在TG 曲線中，酶解前后大米在相同的溫度范圍下失重率相同，第一階段的失重率為5%左右，第二階段的失重率約為57%，且起始溫度都在292 ℃左右，這說明酶解基本不會(huì)改變淀粉的組成成分，這與王成等[29]研究結(jié)論一致。

在DSC 曲線中，酶解前后大米的峰值溫度均約為292 ℃，但其焓值由142.9 J/g 增至197 J/g，這可能是由于短程有序結(jié)構(gòu)中的中長(zhǎng)鏈和高分支度含量增加，從而形成更穩(wěn)定有序的結(jié)構(gòu)[30-31]。淀粉的峰值溫度和焓值越大，說明需要更多的能量來解開淀粉的結(jié)晶區(qū)，表明淀粉的結(jié)晶區(qū)更為穩(wěn)定[32]。

2.3 酶解處理的大米負(fù)載性能研究

以有機(jī)硒為代表功能性物質(zhì)，采用吸附法[33]對(duì)酶解米和原樣大米進(jìn)行富硒加工，發(fā)現(xiàn)在硒添加量3.0 μg，富硒時(shí)間30 min，溫度為30 ℃，發(fā)現(xiàn)酶解大米富硒量0.26 μg/g，符合GB/T 22499—2008《富硒稻谷》[34]中富硒稻米含硒量為0.04～0.3 mg/kg 的指標(biāo)，而酶解前大米富硒量為0.024 μg/g，不在其范圍內(nèi)，表明酶解處理后具有疏松孔洞結(jié)構(gòu)的大米具有良好的負(fù)載其他功能性成分的能力。

3 結(jié)論

為使大米營(yíng)養(yǎng)全面且口感細(xì)膩，以拋光處理的東北珍珠米為原料，采用α-淀粉酶作用于整粒大米表面，結(jié)果表明，大米經(jīng)α-淀粉酶酶解處理后，硬度減小，延展性增大，說明酶解后大米中的直鏈淀粉含量降低；焓值增高，表明其淀粉結(jié)晶區(qū)更加穩(wěn)定；大米表面微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表面出現(xiàn)疏松孔洞結(jié)構(gòu)，比表面積增大，吸水指數(shù)增高。酶解處理后的精制大米具有良好的載硒能力，為大米表面負(fù)載其他功能性成分奠定了理論基礎(chǔ)，可全面提高大米的附加值，具有非常好的應(yīng)用前景。