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        高產(chǎn)聚蘋果酸黑色素短梗霉CGMCC18996全基因組組裝注釋及關(guān)鍵蛋白分析

        2023-09-13 02:52:46王舸楠李佳謙李雨桐陳世偉王淑賢趙廷彬賈士儒喬長晟
        食品科學(xué) 2023年16期
        關(guān)鍵詞:基因簇蘋果酸黑色素

        王舸楠,李佳謙,李雨桐,陳世偉,王淑賢,趙廷彬,賈士儒,喬長晟,,

        (1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室,天津 300457;3.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心,天津 300457;4 .天津慧智百川生物工程有限公司,天津 300457)

        聚蘋果酸(polymalic acid,PMLA)是以蘋果酸為唯一單體的均聚高分子聚合物,屬于聚酯類聚合物,具有高生物相容性、高水溶性、生物可吸收性、化學(xué)可衍生性、可降解性和無免疫原性等多種優(yōu)良性能[1]。PMLA分子的側(cè)鏈帶有可修飾性較強的羧基,一些分子能夠通過官能團反應(yīng)引入其聚合鏈上,同時PMLA水解產(chǎn)生的蘋果酸是理想的調(diào)酸劑,這使PMLA在生物醫(yī)藥、食品和生物材料領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[2-6]。

        研究表明產(chǎn)黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)是一種具有較強產(chǎn)PMLA能力的類酵母真菌[4],但目前對其PMLA生物合成研究并不透徹,對通路中關(guān)鍵酶的研究并不清晰。產(chǎn)量還有很大的提升空間[7]。同時,該菌基因組信息依舊較少,限制了該菌株的開發(fā)利用。因此,對該菌種進行基因組測序及組裝可為改造菌種,提高產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

        目前,主流的基因測序分為兩種,單分子測序(如Pacbio三代測序平臺)和高通量測序(如二代Illumina平臺),其中單分子測序具有讀長長組裝結(jié)果好的特點,但其測序成本與錯誤率較高;高通量測序采用雙端測序策略,結(jié)果兼?zhèn)滟|(zhì)量高、價格低的特點,但其測序長度較短,組裝會產(chǎn)生較多的片段(contigs)。因此采用三代測序結(jié)果組裝再通過二代測序結(jié)果進行糾錯(基因組polish),能夠很大程度降低contigs數(shù)目同時保持基因組準(zhǔn)確率,在完成基因組組裝后,可通過轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果對基因組進行結(jié)構(gòu)注釋,以同時獲得高質(zhì)量基因組注釋結(jié)果[8]。

        本研究通過PacBio Sequel II及Illumina NovaSeq 6000測序平臺對高產(chǎn)PMLA產(chǎn)黑色素短梗霉基因組進行測序,通過不同組裝軟件對測序的下機文件進行組裝及優(yōu)化;結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對組裝結(jié)果進行基因結(jié)構(gòu)注釋。之后對基因組注釋結(jié)果進行不同數(shù)據(jù)庫的功能注釋,同時分析PMLA合成關(guān)鍵蛋白。通過這種方法,期望得到適合于基因組分析以及后續(xù)分子生物學(xué)實驗的高質(zhì)量基因組,為產(chǎn)黑色素短梗霉的開發(fā)利用提供一定生物信息學(xué)參考,并同時為其他類似物種的基因組組裝提供思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        菌株黑色素短梗霉,已保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心(保藏號:CGMCC18996);基因組提取試劑盒 湖南艾科瑞生物工程有限公司;乙腈(色譜純)北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸(均為色譜純)天津市大茂化學(xué)試劑廠。

        1.2 儀器與設(shè)備

        UC7超薄切片機 德國Leica公司;LC-10高效液相色譜儀 日本島津公司;ZWYR-D2403恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司;LRH-250A生化培養(yǎng)箱 泰宏醫(yī)療器械有限公司;NanoDrop One超微量分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司。

        1.3 方法

        1.3.1 基因組提取與測序

        本實驗的基因組提取、建庫以及測序委托諾禾致源科技股份有限公司(北京)完成,實驗流程均按照諾禾致源公司測序方法進行(https://www.novogene.com/novo/sd_cpjs_6.html,https://www.novogene.com/novo/ed_cpjs_2.html)。

        1.3.2 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

        使用曙光云計算服務(wù)器(曙光信息產(chǎn)業(yè)股份有限公司)進行生物信息學(xué)分析。最終得到相關(guān)的測序下機文件以及組裝的基因組文件已上傳至國家生物信息中心(項目號:PRJCA011444)。

        1.3.2.1 原始下機文件獲取及質(zhì)控

        通過Illumina NovaSeq 6000平臺獲取高通量測序產(chǎn)生的fastq基因組測序文件,通過PacBio Sequel II測序平臺獲取單分子測序產(chǎn)生的bam基因組測序文件,同時驗證高通量測序和單分子測序文件的md5值與平臺提供是否一致。

        1.3.2.2 基因組組裝及評估

        使用SPAdes-3.15.5[9]組裝軟件對二代測序clean reads進行組裝,為了得到最優(yōu)N50及L50值,將k-mer大小設(shè)定為77、87、97、107、117及127進行組裝。并通過QUAST[10]軟件對組裝結(jié)果進行評估。三代測序通過Flye[11]、Canu[12]、NextDenovo(https://github.com/Nextomics/NextDenovo)以及MECAT2[13]組裝軟件進行組裝,通過quickmerge[14]將最優(yōu)結(jié)構(gòu)與其他組裝結(jié)果進行融合,之后對得到的融合后結(jié)果進行去重復(fù)處理進一步降低contigs數(shù)目。

        1.3.2.3 基因組注釋

        使用BRAKER2[15]軟件進行基因組注釋,首先通過HISAT2將轉(zhuǎn)錄組序列比對到基因組上,生成bam文件,再將生成的bam文件與基因組文件作為輸入?yún)?shù)使用BRAKER2進行注釋。將獲得的氨基酸序列通過InterProScan[16]與eggNOG-mapper[17]進行注釋得到UniProtKB AC/ID(基因名),將這些基因名進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)(https://www.kegg.jp/kegg/)、基因本體論(Gene Ontology,GO)[18]及直系同源集(Clusters of Orthologous Groups,COG)[19]數(shù)據(jù)庫注釋,并通過antiSMASH[20]對次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進行預(yù)測。

        1.3.3 菌體形態(tài)

        透射電鏡拍攝方法如下,將電子顯微鏡固定劑(2.5%戊二醛溶于磷酸緩沖液)添加到經(jīng)離心分離的菌株中,重懸菌體,使用 0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3 次,1%鋨酸固定液固定1 h;之后使用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3 次,丙酮脫水3 次。使用純EMBed 812樹脂(90529-77-4)包埋,移入65 ℃烘箱中聚合48 h;使用超薄切片機切至60~80 nm薄片,用2%乙酸鈾飽和醇溶液和檸檬酸鉛染色15 min。最后,使用JEM1200電鏡進行觀察拍攝,得到放大4000 倍的產(chǎn)黑色素短梗霉CGMCC18996圖像。

        1.3.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測

        蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測使用Alphafold2-2.2.0[21],將基因組注釋的氨基酸序列作為輸入?yún)?shù),運行模式參數(shù)選擇monomer,其余均選用默認(rèn)選項進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測,最終在生成文件中選擇最優(yōu)結(jié)果(即rank0結(jié)果)。之后將蛋白預(yù)測結(jié)果與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank,PDB)[22]中已上傳的晶體結(jié)構(gòu)進行比對(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCKA):1YLH[23];蘋果酸合成酶(malate synthase,MASY):3CUZ[24])。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 通過二代測序數(shù)據(jù)進行基因組預(yù)組裝

        基于Illumina NovaSeq 6000測序平臺對產(chǎn)黑色素短梗霉基因組進行測序,共得到35.85 Gb×2的雙端測序結(jié)果。且該測序平臺得到的raw reads具有較高的質(zhì)量評分(Q>35)。之后,選取質(zhì)控后clean reads進行后續(xù)的組裝實驗。

        不同k-mer長度對產(chǎn)黑色素短梗霉clean reads進行組裝結(jié)果見表1,組裝結(jié)果顯示,產(chǎn)黑色素短梗霉基因組大小約為44 Mb。其中,在k-mer長度為127時得到N50值為908694,L50值為14,基因組覆蓋度為121.2×?;谠摻Y(jié)果可以判斷該菌基因組長度理論值在44 Mb左右;且隨著k-mer長度的增加,N50值增大,L50值減小;若繼續(xù)增大k-mer值會進一步優(yōu)化組裝參數(shù)。但由于SPAdes軟件進行組裝的k-mer值最大為127,這可能是考慮到繼續(xù)加大k-mer值對測序深度要求較高,從而提高測序成本。

        2.2 三代測序組裝結(jié)果及基因組結(jié)構(gòu)注釋

        基于PacBio平臺的單分子測序共產(chǎn)生46 Gb大小的bam基因組測序文件,轉(zhuǎn)換為fasta文件后,根據(jù)二代組裝結(jié)果設(shè)置基因組大小為44 Mb進行組裝。各組裝軟件組裝結(jié)果如表2所示,其中,選用Canu組裝的最優(yōu)結(jié)果通過quickmerge軟件與其他組裝結(jié)果進行融合,并結(jié)合二代測序文件進行基因組糾正(polish),在刪除重復(fù)contigs后的最終組裝結(jié)果見表3。

        表2 三代組裝結(jié)果Table 2 Results of third-generation assembly

        表3 產(chǎn)黑色素短梗霉基因組裝結(jié)果Table 3 Results of genome assembly of A.melanogenum

        結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序文件進行基因組結(jié)構(gòu)注釋共注釋出15684 個基因,并找到基因編碼區(qū)與氨基酸預(yù)測區(qū),因結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序文件進行結(jié)構(gòu)注釋,這些基因可能包含有可變剪切和重復(fù)注釋的結(jié)構(gòu),會增加注釋出的基因數(shù)目。因此,進行功能注釋和基因名稱注釋后需刪除重復(fù)的基因名;最終,共獲得6202 個基因注釋結(jié)果。

        2.3 GO、KEGG、COG以及antiSMASH次級代謝注釋結(jié)果

        對注釋出的6202 個基因進行GO、KEGG與COG數(shù)據(jù)庫注釋,結(jié)果如圖1所示。其中,COG注釋結(jié)果顯示大部分基因與碳水化合物轉(zhuǎn)運及代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運代謝、轉(zhuǎn)錄后修飾、RNA加工及修飾有關(guān)。KEGG注釋結(jié)果顯示大部分基因所處代謝通路與核糖體、過氧化物體、RNA轉(zhuǎn)運有關(guān)。GO注釋結(jié)果顯示大部分基因與RNA、過氧化物體以及線粒體有關(guān)。最終,antiSMASH次級代謝物預(yù)測結(jié)果共發(fā)現(xiàn)4 個非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)基因簇、5 個一類聚酮合酶(polyketide synthetase,pks)基因簇、3 個β-內(nèi)酯類合成基因簇以及7 個萜類合成基因簇,其中1 個一類pks基因簇和黑色素合成有關(guān)(相關(guān)性100%),1 個一類pks基因簇與黑麥酮酸類化合物合成有關(guān)(相關(guān)性18%)。

        圖1 COG(a)、KEGG(b)、GO(c)數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果Fig.1 Results of annotation in the COG (a),KEGG (b),and GO (c) database

        2.4 產(chǎn)黑色素短梗霉菌體透射電鏡結(jié)果

        如圖2所示,在低產(chǎn)組中菌株具有較大細(xì)胞核(N)以及周圍存在的具有雙層膜結(jié)構(gòu)線粒體(M),在高產(chǎn)組中出現(xiàn)了類似乙醛酸循環(huán)體的圓形結(jié)構(gòu),提示黑色素短梗霉中可能存在有乙醛酸循環(huán)途徑。

        圖2 產(chǎn)黑色素短梗霉PMLA低產(chǎn)組(a、c)及PMLA高產(chǎn)組(b、d)透射電鏡結(jié)果Fig.2 TEM results of low-and high-PMLA producing A.melanogenum

        2.5 PMLA合成相關(guān)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測

        在對基因結(jié)構(gòu)與基因名注釋后,找到PCKA、MASY的蛋白質(zhì)序列,其晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖3、4所示,其中,PCKA、MASY與PDB上傳晶體結(jié)構(gòu)(PCKA:1YLH[23],MASY:3CUZ[24])進行比對,結(jié)果顯示預(yù)測的蛋白結(jié)構(gòu)與PDB數(shù)據(jù)庫中序列比對結(jié)果基本一致,氨基酸比對結(jié)果中序列與其晶體結(jié)構(gòu)中小分子配體的結(jié)合位點也具有較高的一致性。同時蛋白的保守作用位點如PCKA中86R、140V、146G、287G、288D、289D,MASY中440C、275C、276G、277R、278W在比對結(jié)果中一致。

        圖3 Alphafold對PCKA預(yù)測結(jié)果(a)及與PDB中已上傳晶體結(jié)構(gòu)的比對(b)和序列對比結(jié)果(c)Fig.3 Results of PCKA prediction by Alphafold software (a),crystal structure of PCKA versus that in PDB database (b),and amino acid alignment results (c)

        圖4 Alphafold對MASY預(yù)測結(jié)果(a)及與PDB中已上傳晶體結(jié)構(gòu)的比對(b)和序列對比結(jié)果(c)Fig.4 Results of MASY prediction by Alphafold software (a),crystal structure of MASY versus that in PDB database (b),and amino acid alignment results (c)

        3 討論

        結(jié)合基因組及轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可以組裝并注釋出質(zhì)量較高的基因組。本研究通過三代測序(Pacbio sequel II平臺)、二代測序(Illumina NovaSeq 6000)平臺對產(chǎn)黑色素短梗霉基因組進行測序,因三代組裝需要預(yù)估基因組大小,因此,首先通過二代數(shù)據(jù)進行基因組預(yù)組裝共得到44 Mbp基因組大小。之后考察了不同組裝軟件對產(chǎn)黑色素短梗霉基因組的組裝效果,在一般的默認(rèn)選項下,Canu軟件得到了較好的組裝效果。對該組裝結(jié)果通過二代數(shù)據(jù)修正并去重后得到包含26 個contigs、N50為2204220、GC值為50.09%、大小為42 Mb的較高質(zhì)量基因組組裝結(jié)果。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對該組裝結(jié)果進行結(jié)構(gòu)注釋,共找到6202 個基因。產(chǎn)黑色短梗霉屬于出芽短梗霉的亞種,其在不同環(huán)境中也會呈現(xiàn)出酵母狀與菌絲體狀的不同形態(tài)[25]。將基因組組裝與注釋結(jié)果與酵母和絲狀真菌的模式生物基因組進行比較;其中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因組大小為12.15 Mb,編碼6016 個蛋白,GC含量為38.15%[26];構(gòu)巢曲霉基因組大小為30.30 Mb,編碼10008 個蛋白,GC含量為50.10%[27]。因此,產(chǎn)黑色素短梗霉基因組組成更偏向構(gòu)巢曲霉,且本實驗室先前通過無參轉(zhuǎn)錄組注釋發(fā)現(xiàn)很多與構(gòu)巢曲霉同源的基因[28]。因構(gòu)巢曲霉是絲狀真菌的模式生物,該結(jié)果提示產(chǎn)黑色素短梗霉可能同樣適用構(gòu)巢曲霉的分子轉(zhuǎn)化方法。

        本研究通過Illumina NovaSeq 6000平臺對產(chǎn)黑色素短梗霉進行了大約35 GB下機文件大小的高通量測序,該測序量的測序深度較大,理論測序深度為1000×。通過二代組裝軟件進行組裝后,最終組裝出N50值為908694的基因組,該結(jié)果僅達(dá)到三代測序組裝結(jié)果N50的41.4%,因此,考慮到組裝結(jié)果以及建庫與測序成本[29],三代測序進行組裝輔以二代測序進行基因組修正的測序方法更具有性價比。

        通過COG、KEGG與GO數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果表明,產(chǎn)黑色素短梗霉中基因表達(dá)主要位于核糖體、線粒體以及過氧化物體等細(xì)胞器中,其中,有研究表明線粒體中的三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)體中的乙醛酸循環(huán)以及細(xì)胞質(zhì)中的還原性三羧酸途徑與PMLA的生物合成有關(guān)[7,30-31]。功能注釋結(jié)果中出現(xiàn)了大量與過氧化物體有關(guān)的基因,而能夠產(chǎn)生蘋果酸的乙醛酸循環(huán)體也屬于一類過氧化物體。因此,該結(jié)果說明在產(chǎn)黑色素短梗霉中可能存在乙醛酸循環(huán)體。實驗室先前研究發(fā)現(xiàn)乙醛酸體中的MASY可通過乙醛酸途徑生成蘋果酸,相比于線粒體中存在的蘋果酸/天冬氨酸穿梭體系,乙醛酸循環(huán)體中蘋果酸可能可以直接通過單層乙醛酸體膜進入細(xì)胞質(zhì)中而被非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthase,NRPS)聚合成PMLA[28]。透射電鏡結(jié)果也顯示,在加入CaCO3的高產(chǎn)PMLA組中,菌體內(nèi)部出現(xiàn)了較多的圓形細(xì)胞器,提示菌體中存在乙醛酸循環(huán)體的可能。antiSMASH注釋結(jié)果表明在產(chǎn)黑色素短梗霉中存在4 個NRPS基因簇,該結(jié)果也同樣反映出NRPS蛋白聚合蘋果酸形成PMLA的可能性。同時,注釋出的與黑色素合成的pks基因簇可解釋該菌種在生長過程中逐漸變黑的現(xiàn)象。

        實驗室先前研究表明[28],PCKA、MASY和NRPS基因在PMLA高產(chǎn)組中發(fā)生了較大幅度的上調(diào)。因此,通過對基因組注釋得到的PCKA和MASY的編碼區(qū)進行了蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測,并將預(yù)測結(jié)果與PDB上已有的晶體結(jié)構(gòu)進行比對。比對結(jié)果表明,蛋白預(yù)測結(jié)果與已有晶體結(jié)構(gòu)基本吻合,且保守結(jié)構(gòu)域相似,提示預(yù)測蛋白與其他菌株中已存在蛋白可能具有相似的功能。PCKA是糖異生途徑的限速酶,一般情況下催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸,但有研究表明PCKA在真菌細(xì)胞質(zhì)中可反向催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸[23]。而細(xì)胞質(zhì)中的草酰乙酸會進一步轉(zhuǎn)化為PMLA的前體物質(zhì)蘋果酸。MASY可催化乙醛酸循環(huán)中的第二部反應(yīng),將乙醛酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸[24],而乙醛酸體的單層膜結(jié)構(gòu)可能使蘋果酸被動運輸進入細(xì)胞質(zhì),進而被細(xì)胞質(zhì)中存在的NRPS蛋白聚合成為PMLA[28]。本實驗沒有對NRPS蛋白預(yù)測的原因是因為其氨基酸序列較長(5000 aa左右),軟件無法預(yù)測,其次是在PDB上還沒有找到近似的蛋白晶體結(jié)構(gòu),比對較為困難。

        本研究對產(chǎn)黑色素短梗霉進行二代、三代基因組測序并組裝得到最優(yōu)組裝結(jié)果,后通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對基因組進行結(jié)構(gòu)注釋,將得到的結(jié)構(gòu)注釋結(jié)果進行不同數(shù)據(jù)庫的功能注釋。同時對產(chǎn)黑色素短梗霉進行了透射電鏡拍攝,電鏡結(jié)果提示菌株中存在乙醛酸循環(huán)體結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可能與PMLA合成有關(guān),最終,實驗通過對PMLA合成相關(guān)的PCKA和MASY蛋白進行結(jié)構(gòu)預(yù)測并與PDB上已有電鏡結(jié)果進行比對。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黑色素短梗霉中這兩種蛋白與PDB上已有晶體結(jié)構(gòu)基本一致,且這兩種蛋白功能最終都與蘋果酸代謝有關(guān)。本實驗結(jié)果可為產(chǎn)黑色短梗霉菌株的PMLA代謝提供一定的參考,相關(guān)的測序下機文件以及組裝的基因組文件已上傳至國家生物信息中心(PRJCA011444),為后續(xù)的菌株開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

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