綦 艷，李錦清，李 聰，許慶鵬

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 順德 528300）

五氯苯酚（又名五氯酚）及其鈉鹽五氯酚鈉（又名五氯酚酸鈉）是持久性環(huán)境污染物[1]，常用作殺蟲劑，皮革、木材防腐劑，農(nóng)業(yè)除草劑以及吸血蟲中間宿主釘螺的滅殺等[2-4]。五氯苯酚及其鈉鹽化學性質(zhì)穩(wěn)定，難降解，可在環(huán)境中擴散傳播和在食物鏈中蓄積[5]，通過環(huán)境或食物鏈進入動植物和人體內(nèi)，當人體內(nèi)五氯苯酚及其鈉鹽蓄積到一定量后可能會導致內(nèi)分泌紊亂、致癌、致畸和誘發(fā)人體器官病變等[6-8]。五氯苯酚及其鈉鹽已成為重點監(jiān)控的環(huán)境污染物之一，被多個國家禁用或限制使用[9]。環(huán)境中五氯苯酚及其鈉鹽的擴散傳播可能造成的食品污染問題也引起了人們的高度重視。我國國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細則（2019年版）將水產(chǎn)品、畜禽肉及其副產(chǎn)品中五氯苯酚及其鈉鹽作為必檢項目，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號[10]規(guī)定食品動物中不得檢出五氯苯酚及其鈉鹽。

五氯苯酚及其鈉鹽的檢測方法以氣相色譜法[11-13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[20-23]為主。五氯苯酚沸點約為310 ℃，難氣化，分子結(jié)構(gòu)中5 個氯原子的作用使得酚羥基極性較強，在氣相色譜柱上保留能力強、難洗脫、色譜峰拖尾、峰形差、靈敏度低，一般采用乙酸酐將五氯苯酚衍生為五氯苯乙酸酯，然后用氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，使之獲得較好的峰形和較高的檢測靈敏度，但衍生化操作繁瑣，衍生條件難控制，而且由于五氯苯酚的酚羥基兩邊有氯基團，對衍生化起阻礙作用，不利于衍生化。LCMS/MS測定五氯苯酚及其鈉鹽無需衍生化，方法簡單、靈敏度高，但容易受到基質(zhì)抑制作用影響，導致定量結(jié)果不準確。為降低基質(zhì)抑制作用，需對樣品進行凈化，常用的凈化方法有陰離子交換固相萃取法或QuEChERS法。陰離子交換固相萃取法步驟多、較繁瑣、效率低，不利于大批量樣品快速檢測，而QuEChERS法具有簡單、快速、經(jīng)濟、高效等優(yōu)點，適用于大批量樣品快速檢測，廣泛應用于食品中農(nóng)藥殘留和獸藥殘留檢測。

奶粉是由液體牛奶經(jīng)濃縮、干燥等加工步驟制成，使牛奶中可能存在的痕量五氯苯酚及其鈉鹽被濃縮富集，對人體的危害性更大。目前鮮見有針對奶粉中五氯苯酚殘留量檢測的標準或文獻報道，相關(guān)風險監(jiān)測尚未開展，因此建立奶粉中五氯苯酚的檢測方法十分必要。GB 23200.92—2016《動物源性食品中五氯酚殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜法》[24]為食品中五氯苯酚的檢測提供了依據(jù)，然而該方法存在前處理步驟繁瑣、耗時長、易受復雜基質(zhì)干擾，回收率低等不足，而且該方法適用范圍未包括奶粉基質(zhì)。因此，本研究建立QuEChERS萃取，Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱凈化，基質(zhì)匹配-同位素稀釋內(nèi)標法結(jié)合LC-MS/MS法測定奶粉中五氯苯酚的分析方法，縮短樣品前處理時間、簡化樣品前處理過程、降低基質(zhì)效應、提高大批量樣品的檢測效率，彌補奶粉基質(zhì)中五氯苯酚檢測方法缺失，以期為開展相關(guān)風險監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純）美國Thermo Fisher公司；甲醇（色譜純）美國Tedia公司；甲酸、乙酸銨（均為色譜純）上海安譜實驗科技股份有限公司；無水硫酸鎂（分析純）天津市致遠化學試劑有限公司；氫氧化鉀、氫氧化鈉（均為分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實驗室用一級水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》要求；五氯苯酚的甲醇標準溶液（質(zhì)量濃度為1000 μg/mL）、五氯苯酚-13C6標準品（純度98.0%）北京曼哈格生物科技有限公司；Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱（300 mg/3 mL）、聚四氟乙烯針式濾頭（polytetrafluoroethylene，PTFE，規(guī)格0.22 μm/13 mm）美國Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Exion LC AD/SCIEX Triple Quad 4500 LC-MS/MS儀（配電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI））美國AB SCIEX公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MV-3000多位渦旋振蕩器 廣東晉元科技有限公司；FV64全自動智能氮吹儀 廣州得泰儀器科技有限公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國Millipore公司；JJ500Y電子天平（精度0.01 g）福州華志科學儀器有限公司；MS105DU電子天平（精度0.1 mg）梅特勒-托利多科技（中國）有限公司；JP-C300超聲波清洗機 廣州吉普超聲波電子設(shè)備有限公司；可調(diào)單道移液器 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 同位素標準溶液的配制

稱取五氯苯酚-13C6標準品約5 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配得五氯苯酚-13C6儲備液質(zhì)量濃度為500 μg/mL，-16～-20 ℃條件下保存。吸取1.00 mL五氯苯酚-13C6儲備液置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配得標準品中間液質(zhì)量濃度為5 μg/mL，-16～-20 ℃條件下保存。吸取1.00 mL五氯苯酚-13C6標準品中間液置于10 mL容量瓶中用甲醇稀釋至刻度，配得五氯苯酚-13C6的標準品使用液質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，-16～-20 ℃條件下保存。

1.3.2 標準曲線的配制

用甲醇將質(zhì)量濃度為1000 μg/mL的五氯苯酚標準溶液逐級稀釋，配制質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標準品中間液和質(zhì)量濃度分別為0.1、0.01 μg/mL的五氯苯酚標準品使用液，-16～-20 ℃條件下保存。精密吸取適量五氯苯酚標準品中間液或標準品使用液以及五氯苯酚-13C6標準品使用液，用空白奶粉基質(zhì)提取液稀釋，配成五氯苯酚-13C6質(zhì)量濃度均為5 μg/L以及質(zhì)量濃度范圍為0.2～150 μg/L的五氯苯酚標準工作曲線，用LC-MS/MS測定。

1.3.3 樣品提取

稱取經(jīng)混合均勻的奶粉樣品2 g（精確至0.01 g）置于50 mL聚丙烯離心管中，加入100 μL質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的五氯苯酚-13C6標準工作液，加入10 mL一級水充分溶解奶粉，然后加入200 μL質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液，搖勻后置于40～50 ℃水浴振蕩器中振蕩水解30 min，冷卻后加入5.0 mL乙腈，用多位渦旋振蕩器以2200 r/min渦旋振蕩5 min，加入500 μL甲酸，搖勻，靜置10 min，加入1 g無水硫酸鎂后立即搖勻，繼續(xù)用多位渦旋振蕩器以2200 r/min渦旋10 min，以8000 r/min離心3 min，收集上層清液（乙腈層）作為待凈化液。

1.3.4 樣品凈化

吸取待凈化液約3 mL轉(zhuǎn)移至Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱中，控制待凈化液流出速率約為1 mL/min，棄去前1.5 mL流出液，收集后段流出液，吸取500 μL流出液置于離心管中，然后加入500 μL一級水，渦旋混勻，用PTFE過濾，供LC-MS/MS檢測。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY BEHC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A：甲醇；流動相B：5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）；柱溫：25 ℃；進樣量：15 μL。梯度洗脫程序：0～1.5 min，55% A、45% B；1.5～2.0 min，55%～85% A、45%～15% B；2.0～8.0 min，85% A、15% B；8.0～9.0 min，85%～55% A、15%～45% B；9.0～10.0 min，55% A、45% B。

1.3.6 質(zhì)譜條件

電離源ESI-；數(shù)據(jù)采集：多反應監(jiān)測（multiple reaction monition，MRM）模式；電噴霧電壓-4500 V；脫溶劑溫度550 ℃；氣簾氣壓力30 psi；霧化氣壓力45 psi；干燥氣壓力45 psi?；衔锉Ａ魰r間、離子對、去簇電壓、碰撞能量、駐留時間見表1。

表1 五氯苯酚和五氯苯酚-13C6質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of pentachlorophenol and pentachlorophenol-13C6

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜方法優(yōu)化

五氯苯酚分子中氯原子存在35Cl和37Cl同位數(shù)，在ESI-下，五氯苯酚和五氯苯酚-13C6分別監(jiān)測到m/z相差為2的多個母離子（Q1）峰，如圖1、2所示。五氯苯酚母離子質(zhì)量數(shù)分別為262.8、264.8、266.8、268.8、270.8；五氯苯酚-13C6母離子質(zhì)量數(shù)分別為268.8、270.8、272.8、274.8、276.8。對上述各個母離子進行碎裂，均未監(jiān)測到任何子離子（Q3）碎片，分析其原因可能是五氯苯酚和五氯苯酚-13C6分子結(jié)構(gòu)對稱（圖1、2），共軛性強，結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，難以碎裂產(chǎn)生特征子離子碎片。

圖1 五氯苯酚母離子（Q1）圖譜Fig.1 Parent ion (Q1) spectrum of pentachlorophenol

圖2 五氯苯酚-13C6母離子（Q1）圖譜Fig.2 Parent ion (Q1) spectrum of pentachlorophenol-13C6

有文獻報道[25]，五氯苯酚碎裂后產(chǎn)生質(zhì)量數(shù)為35的氯離子碎片，但氯離子質(zhì)量數(shù)低，容易受雜質(zhì)離子干擾，同時也難以保證氯離子碎片在每次檢測中都具有穩(wěn)定的重復性。本實驗選擇離子對m/z262.8/262.8、264.8/264.8、266.8/266.8、268.8/268.8作為五氯苯酚監(jiān)測離子，與田春霞等[26]的研究和GB 23200.92—2016一致。通過優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量后m/z264.8/264.8響應最高，但實際樣品檢測中發(fā)現(xiàn)該離子MRM圖顯示雜峰較多，m/z262.8/262.8雜峰最少，如圖3所示。因此，選擇m/z262.8/262.8作為定量離子對，其余離子作為定性離子，符合歐盟EC657/2002對串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜進行化合物定性鑒別要求。由于五氯苯酚和內(nèi)標五氯苯酚-13C6存在相同質(zhì)量數(shù)的母離子m/z268.8、270.8，為避免干擾定量，五氯苯酚-13C6選擇m/z272.8/272.8離子對的峰面積參與計算，其余離子作為定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖3 基質(zhì)匹配標準品（10 μg/L）的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram of matrix matching standard solution (10 μg/L)

2.2 前處理方法選擇與優(yōu)化

2.2.1 提取條件優(yōu)化

五氯苯酚含酚羥基呈酸性，其pKa值為4.93，在酸性條件下呈分子態(tài)，易溶于甲醇、乙腈等有機溶劑；在堿性條件下呈離子態(tài)，溶于甲醇、乙腈，更易溶于水[27]，因此，利用五氯苯酚與五氯苯酚鈉可相互轉(zhuǎn)化的性質(zhì)可提高萃取回收率。由于有機試劑不能溶解奶粉樣品，無法形成分散性好的溶液，因此，只能萃取樣品表面的五氯苯酚，無法有效萃取奶粉顆粒內(nèi)部的五氯苯酚，導致檢測結(jié)果不準確。本實驗先以5 倍于奶粉質(zhì)量的水體積充分溶解奶粉，破壞奶粉顆粒，釋放奶粉中可能存在的待測化合物，然后通過酸水解法或堿水解法使可能以結(jié)合態(tài)形式存在的待測化合物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，再進一步用有機試劑提取，使檢測結(jié)果更準確。甲醇或乙腈均可作為提取試劑和蛋白沉淀劑，但乙腈的萃取回收率和蛋白沉淀效果優(yōu)于甲醇，因此，本實驗選擇乙腈作為提取試劑和蛋白沉淀劑。

為避免同位素稀釋法經(jīng)內(nèi)標折算后不能體現(xiàn)方法的回收率差異，除特殊說明外，本實驗涉及的回收率比較均采用基質(zhì)匹配外標法定量，以此確定最佳的實驗條件，最終形成最優(yōu)的同位素稀釋樣品前處理方法。

采用空白奶粉樣品添加五氯苯酚5 μg/kg，比較酸水解法和堿水解法的回收率差異。酸水解法是用甲酸替代氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液，其余步驟按1.3.3節(jié)操作；堿水解法完全按1.3.3節(jié)操作。結(jié)果表明，堿水解法比酸水解法回收率高約25%～35%，且重復性更好。其原因可能是部分五氯苯酚與奶粉中含有羧基（—COOH）或氨基（—NH2）的物質(zhì)相互作用[28]，形成了結(jié)合態(tài)，堿水解法可以將結(jié)合態(tài)、分子態(tài)等形式存在的待測化合物充分轉(zhuǎn)化為易溶于水的五氯苯酚鈉，有利于充分提取，回收率更高，重復性更好；酸水解法對結(jié)合態(tài)存在的待測化合物作用不明顯，回收率偏低。因此，本實驗選擇堿水解法。

2.2.2 QuEChERS方法優(yōu)化

QuEChERS法[29]萃取與固相萃取法相比，更簡單、更高效、成本更低、重復性更好，同時具備萃取和初步凈化樣品作用，避免了固相萃取法步驟繁瑣[30]、耗時長、堵塞柱子以及重復性不穩(wěn)定等缺點，本實驗優(yōu)先選擇QuEChERS法萃取，適用于大批量樣品快速檢測。

QuEChERS萃取常用的鹽析試劑有無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。在優(yōu)化的實驗條件下，比較無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉對五氯苯酚萃取回收率的影響，以基質(zhì)匹配外標法定量計算回收率，結(jié)果表明，無水硫酸鎂作鹽析試劑時，回收率最高。進一步比較無水硫酸鎂添加量為1、2、3、4 g對回收率的影響。結(jié)果表明，當溶解奶粉的水與無水硫酸鎂添加量比例為5∶1（mL/g）時，回收率最佳；當無水硫酸鎂添加量超過該比例時，回收率有所下降，這可能是由于過量無水硫酸鎂加入瞬間局部水分被迅速吸收，形成的顆粒物吸附五氯苯酚。

多次萃取可提高目標化合物的回收率，但前處理耗時長，需要消耗更多有機試劑。本實驗使用同位素稀釋內(nèi)標法檢測，僅需QuEChERS法萃取一次，回收率達到90%以上，操作簡單、顯著縮短樣品前處理時間，有利于大批量樣品快速檢測。

2.2.3 樣品凈化

奶粉樣品含有大量蛋白質(zhì)、約16%脂肪以及約1%～3%磷脂。QuEChERS法同時起到萃取和去除無機鹽、水溶性雜質(zhì)等凈化作用，但脂肪和磷脂也會被乙腈提取出來，這些雜質(zhì)對五氯苯酚檢測起基質(zhì)抑制作用，需進一步凈化。Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱[31]可同時去除乙腈提取液中脂肪和磷脂，有效降低基質(zhì)抑制，與GB 23200.92—2016的MAX固相萃取柱凈化相比，整個凈化過程省略了活化、淋洗、洗脫等步驟，簡化凈化流程，直接收集流出液即完成凈化操作，顯著提高前處理效率，且樣品加標絕對回收率比GB 23200.92—2016高約10%～15%，因此，選擇采用Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱對樣品提取液作進一步凈化。

用空白基質(zhì)提取液配制相同質(zhì)量濃度的標準溶液，分別用尼龍66（材質(zhì)為聚己二酰己二胺）和聚四氟乙烯材質(zhì)的有機系針式濾頭過濾，比較不同材質(zhì)濾頭對五氯苯酚的吸附作用。結(jié)果表明，尼龍66有機系針式濾頭對五氯苯酚有吸附，五氯苯酚損失約30%～35%；聚四氟乙烯有機系針式濾頭對五氯苯酚無吸附。其原因可能是尼龍66濾膜材質(zhì)的胺基（—NH—）與五氯苯酚的酚羥基結(jié)合，使部分五氯苯酚保留在濾膜上，導致五氯苯酚損失，但將過濾后的濾液用同一個濾頭再過濾一次，損失率下降至10%左右，可能是由于再次過濾能將保留在濾膜上的五氯苯酚洗脫下來；聚四氟乙烯不存在與五氯苯酚發(fā)生反應的基團，所以五氯苯酚無損失。因此，選擇使用PTFE材質(zhì)的有機系針式濾頭過濾。

2.3 方法學考察

2.3.1 基質(zhì)效應

除不加同位素內(nèi)標外，按照優(yōu)化的前處理方法對添加五氯苯酚3 μg/kg的奶粉樣品進行6 個平行測定，制得樣品待測液，考察基質(zhì)效應。分別用乙腈、甲醇、空白基質(zhì)提取液配制標準工作曲線，分別對樣品待測液進行外標法定量，計算平均回收率，見表2。結(jié)果表明，以乙腈、甲醇配制的標準工作曲線定量的平均回收率分別為33%、25%；以空白基質(zhì)提取液配制的標準工作曲線定量（基質(zhì)匹配外標法定量）的回收率為63%；表明存在較強的基質(zhì)抑制作用。為降低或消除基質(zhì)抑制作用，本實驗采用空白基質(zhì)提取液與同位素稀釋內(nèi)標法相結(jié)合配制標準工作曲線進行定量，平均回收率為90%，有效降低基質(zhì)抑制作用，使定量結(jié)果更加準確、可靠。由于五氯苯酚未能碎裂形成子離子碎片，實際樣品的提取離子色譜圖顯示雜峰較多（圖4），采用同位素稀釋內(nèi)標法可提高定性鑒別準確度。

圖4 空白奶粉樣品添加15.0 μg/kg標準品的提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of spiked blank sample at 15.0 μg/kg

表2 標準曲線配制方法對回收率的影響Table 2 Influence of standard curve preparation methods on PCP recovery

2.3.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

五氯苯酚的空白基質(zhì)提取液-同位素稀釋內(nèi)標標準工作曲線在質(zhì)量濃度0.2～150 μg/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y＝0.24256x+0.04470，相關(guān)系數(shù)r＝0.9960。以不含五氯苯酚的奶粉樣品添加標準品的方式考察方法檢出限和定量限，分別以定量離子3 倍信噪比和10 倍信噪比響應值對應的含量作為方法檢出限和定量限，方法檢出限和定量限分別為0.5、1.5 μg/kg。在1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)條件下測定，獲得的基質(zhì)匹配標準品（10 μg/L）的提取離子色譜圖（圖3）。

2.3.3 回收率和精密度

在2 g（精確至0.01 g）不含五氯苯酚的奶粉樣品中分別添加質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL五氯苯酚標準溶液30、60 μL，1 μg/mL五氯苯酚標準溶液30 μL（添加水平分別相當于樣品中五氯苯酚含量為1.5、3.0、15.0 μg/kg），然后在每個樣品中添加100 μL質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的五氯苯酚-13C6標準溶液，每個添加水平平行測定6 次，空白基質(zhì)提取液-同位素稀釋內(nèi)標法定量，考察方法回收率和精密度，結(jié)果見表3，平均回收率為90.3%～119.2%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為5.8%～7.5%，回收率和精密度均符合GB/T 27404—2008附錄F之F.1回收率和F.3精密度要求，滿足奶粉中五氯苯酚殘留量檢測要求。1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)條件下測定，獲得的空白奶粉樣品添加15.0 μg/kg標準品的提取離子色譜圖。

2.4 實際樣品測定

采用建立的方法對45 批奶粉樣品（嬰幼兒配方奶粉1 段15 批次，2段10 批次，3段10 批次，中老年奶粉10 批次）進行檢測，均未檢出五氯苯酚。

3 結(jié)論

本實驗建立QuEChERS萃取，Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱凈化，基質(zhì)匹配-同位素稀釋內(nèi)標法結(jié)合LC-MS/MS測定奶粉中五氯苯酚的分析方法。在水浴加熱條件下，采用堿水解法將奶粉中可能以結(jié)合態(tài)、分子態(tài)形式存在的待測化合物充分轉(zhuǎn)化為易溶于水的五氯苯酚鈉，在乙腈存在條件下，用甲酸將五氯苯酚鈉轉(zhuǎn)化為不溶于水、易溶于乙腈的五氯苯酚，再以無水硫酸鎂為鹽析試劑的QuEChERS法萃取，用Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱對樣品提取液作進一步凈化，凈化液與水按1∶1比例混合后，用LC-MS/MS測定，以基質(zhì)匹配-同位數(shù)稀釋內(nèi)標標準工作曲線法定量，本方法具有操作簡單、快速、回收率高、準確可靠等優(yōu)點，彌補了奶粉中五氯苯酚殘留量檢測方法缺失，為開展相關(guān)風險監(jiān)測提供技術(shù)支持。