劉鳳銀，蘇珮韻，林浩標(biāo)，劉 匯，陳嘉儀，盧梓程，穆洪濤，李攻科,

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；2.中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

沙坦類藥物為一類抗高血壓藥物，臨床上主要用于治療高血壓、心衰和冠心病等[1-2]。依據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為聯(lián)苯四氮唑類和非聯(lián)苯四氮唑類[3]，前者的結(jié)構(gòu)式中均含有聯(lián)苯四氮唑環(huán)，主要包括坎地沙坦、氯沙坦羧酸、洛沙坦鉀、奧美沙坦、奧美沙坦酯、厄貝沙坦、纈沙坦和纈沙坦甲酯等，結(jié)構(gòu)見圖1；后者主要包括阿奇沙坦、甲磺酸依普羅沙坦和替米沙坦等。保健食品中的聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物主要來源于非法添加。我國《食品安全法》明確規(guī)定，保健食品不得添加藥品。一些不法分子為使其效果顯著，向降壓類保健食品中非法添加降壓類藥物，而尚未在原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布《保健食品中75 種非法添加化學(xué)藥物的檢測》（BJS 201710）名單中的聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物，成為不法分子為規(guī)避處罰，非法添加的降壓類備選藥物。而非法添加的藥物存在來源不明確、兼容性不明確和添加量不明確等問題，對消費(fèi)者的健康帶來很大的安全隱患。

圖1 8 種聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of eight biphenyl tetrazolium sartans

針對聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物，國外研究者主要關(guān)注于其對環(huán)境生態(tài)的危害問題，開展其在環(huán)境水資源中的殘留檢測及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估研究[4-6]；國內(nèi)研究者主要關(guān)注于降壓類保健食品和中成藥中的非法添加現(xiàn)象[7-8]。采用的檢測方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[7,9]、高效液相色譜法[8,10]等，該類儀器檢測方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高，但儀器設(shè)備昂貴、專業(yè)化要求較高，方法普及受限。因此，建立一種準(zhǔn)確靈敏、快速簡便的分析方法用于降壓類保健食品中聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物非法添加的檢測十分必要?；诳乖?抗體特異性反應(yīng)的免疫分析技術(shù)具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn)，尤其適用于現(xiàn)場篩查和大批量樣品的快速分析，為食品安全提供了重要保障[11-12]?；趶V譜性抗體建立的免疫檢測方法，可通過一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)篩查多種待測物，在分析通量、實(shí)用性、成本方面具有突出優(yōu)勢[13-14]。目前，國內(nèi)外鮮見有關(guān)于聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物免疫檢測方法的報(bào)道。

本研究基于免疫分析技術(shù)，針對聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的共性結(jié)構(gòu)，通過人工抗原的制備和動(dòng)物免疫，制備其廣譜特異性抗體，建立其間接競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測（indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA）法，并用于降壓類保健食品中聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的多殘留檢測，檢測結(jié)果采用LC-MS/MS法確證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保健食品購于國內(nèi)互聯(lián)網(wǎng)商店；SPF級雌性純種新西蘭大白兔購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

坎地沙坦（純度98%）天津希恩思生化科技有限公司；氯沙坦羧酸（純度98%）上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；洛沙坦鉀（純度99%）上海安耐吉化學(xué)有限公司；奧美沙坦酯（純度≥98%）、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（純度99%）上海源葉生物科技有限公司；纈沙坦（純度95%）上海麥克林生化科技有限公司；奧美沙坦（純度≥98%）、纈沙坦甲酯（純度95%）、阿奇沙坦（純度≥99%）、甲磺酸依普羅沙坦（純度≥99%）、替米沙坦（純度≥98%）、厄貝沙坦（純度≥98%）、N-羥基琥珀酰亞胺（純度99%）、1,3-二環(huán)己基碳二亞胺（純度99%）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、N,N-二甲基甲酰胺（無水級99.8%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體 美國Earthox公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，純度高于98%）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA，純度高于98%）上海昂一生物科技有限公司；弗氏完全和不完全佐劑 美國Sigma公司；96 孔微孔板 廈門怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司；針筒式有機(jī)過濾器（0.22 μm）天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-Max 2300A2光吸收型全波長酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司；TOM-3PW自動(dòng)洗板機(jī) 上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海雷磁儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Neofuge 13R高速冷凍離心機(jī)上海力申科學(xué)儀器有限公司；UNIQUE-R20實(shí)驗(yàn)室多功能純水系統(tǒng) 銳思捷科學(xué)儀器有限公司；LCMS-8050超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀 日本島津公司；Amicon Ultra-0.510 kDa超濾離心管 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原合成與結(jié)構(gòu)鑒定

采用活潑酯法，將坎地沙坦與BSA偶聯(lián)制備免疫原坎地沙坦-BSA，將坎地沙坦、氯沙坦羧酸、奧美沙坦和纈沙坦分別與OVA偶聯(lián)，制備包被原坎地沙坦-OVA、氯沙坦羧酸-OVA、奧美沙坦-OVA和纈沙坦-OVA。人工抗原合成路線圖如圖2所示。具體偶聯(lián)方法：將0.05 mmol半抗原溶于500 μLN,N-二甲基甲酰胺中，攪拌中加入0.1 mmol 1,3-二環(huán)己基碳二亞胺和0.1 mmolN-羥基琥珀酰亞胺，4 ℃磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后取上清液；攪拌中，將上清液逐滴滴加到溶解有適量載體蛋白的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）溶液中，4 ℃磁力攪拌反應(yīng)12 h；4 ℃、12000 r/min離心10 min，取上清液。4 ℃用PBS透析3 d得人工抗原，-20 ℃分裝貯存。上述半抗原與BSA、OVA的物質(zhì)的量比分別為100∶1、60∶1。

圖2 人工抗原合成技術(shù)路線圖（以坎地沙坦-BSA為例）Fig.2 Scheme for preparation of artificial antigen (taking candesartan-BSA for example)

在220～320 nm波長間分別對載體蛋白、人工抗原和半抗原進(jìn)行紫外掃描，比較三者的紫外吸收光譜曲線，判定人工抗原是否制備成功。免疫原用超濾管脫鹽，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MADLI-TOF MS）法測定其分子質(zhì)量，計(jì)算偶聯(lián)比。

1.3.2 動(dòng)物免疫與抗體特性評價(jià)

將上述制備的免疫原免疫2 只2.5 kg雌性新西蘭大白兔，采集抗血清。免疫方法：將免疫原（500 μg/只）與等劑量的弗氏佐劑混合乳化，采用皮內(nèi)、皮下、肌肉多點(diǎn)注射免疫；首次免疫后，于第31、52、73天以同樣方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫。首次免疫采用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫采用弗氏不完全佐劑。于第80天心臟采血，將血室溫靜置0.5～1 h，4 ℃、12000 r/min離心15 min，收集上清液獲得抗血清，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用ic-ELISA法，在包被原和目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度均為1 μg/mL時(shí)，測定同源和異源不同包被模式下抗血清的效價(jià)和抑制率。抑制率按照式（1）計(jì)算：

式中：A450nm效價(jià)孔為在一定包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)下，不含目標(biāo)分析物的測試孔的吸光度；A450nm抑制孔為在特定包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)下，含有一定濃度目標(biāo)分析物測試孔的吸光度。

1.3.3 ic-ELISA建立

參照楊武英等[15]的ic-ELISA實(shí)驗(yàn)步驟，采用棋盤滴定法確定最佳包被原濃度和抗血清稀釋倍數(shù)；通過單因素試驗(yàn)，考察理化因素緩沖液pH值（5.4、6.4、7.4、8.4）、緩沖液離子濃度（5、10、20、40 mmol/L）、競爭反應(yīng)時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對ic-ELISA檢測性能的影響。以目標(biāo)分析物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，吸光度A450nm為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線，計(jì)算最大吸光度Amax、半抑制濃度IC50及Amax/IC50。選取Amax較大、IC50較小、Amax/IC50較大且曲線擬合度好的反應(yīng)條件作為最佳工作條件。

1.3.4 交叉反應(yīng)率評價(jià)

選取7 種聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物和3 種非聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。分別繪制每種藥物的抑制曲線，計(jì)算其對應(yīng)的IC50、檢出限IC10。交叉反應(yīng)率按式（2）計(jì)算：

1.3.5 樣品前處理

參照王超等[16]的方法并適當(dāng)調(diào)整。具體如下：固體樣品（片劑、硬膠囊和茶葉）取10 次服用劑量用磨粉機(jī)磨粉后，過30 目篩；液體樣品（軟膠囊）取10 次服用劑量的內(nèi)容物混勻。準(zhǔn)確稱取1 次服用劑量的樣品于50 mL容量瓶中，加入40 mL甲醇超聲提取15 min，冷卻后甲醇定容，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，得提取液。用PBS或甲醇適當(dāng)稀釋后分別采用ic-ELISA法和LC-MS/MS法測定。

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

選取4 種劑型的空白樣品（經(jīng)LC-MS/MS法測定不含有8 種目標(biāo)分析物），按照1.3.5節(jié)樣品前處理步驟，制備空白基質(zhì)溶液。將空白基質(zhì)溶液用PBS稀釋100、500、1000 倍后作為稀釋液，分別配制一系列濃度梯度的坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行ic-ELISA實(shí)驗(yàn)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，與以PBS作為稀釋液繪制的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對。

1.3.7 LC-MS/MS法確證

色譜條件：色譜柱Endeavorsil C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；流速0.25 mL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，15% A、85% B；1～3 min，15%～40% A、85%～60% B；3～6 min，40%～60% A、60%～40% B；6～8 min，60%～85% A、40%～15% B；8～12 min，85% A、15% B；12～15 min，85%～50% A、15%～50% B；15～19 m i n，50%～15% A、50%～85% B；19～20 min，15% A、85% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式；霧化氣流量3 L/min；加熱氣流量10 L/min；干燥氣流量10 L/min；加熱塊溫度400 ℃；接口電壓4.0 kV；接口溫度300 ℃；脫溶劑管溫度250 ℃；多反應(yīng)選擇監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM），采用分段采集（利用軟件的自帶功能，根據(jù)每個(gè)目標(biāo)分析物的保留時(shí)間自動(dòng)設(shè)置MRM事件時(shí)間）。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用ChemDraw pro 18繪制化學(xué)結(jié)構(gòu)式；采用Origin pro 2018繪制抑制曲線；采用Excel 2010繪制表格。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原合成與結(jié)構(gòu)鑒定

采用紫外掃描判定人工抗原是否偶聯(lián)成功。由于結(jié)構(gòu)不同，載體蛋白和半抗原在紫外下有各自不同的特征吸收峰，偶聯(lián)后兩者的共軛結(jié)構(gòu)相互作用，若人工抗原相較于載體蛋白的紫外吸收光譜發(fā)生明顯偏移，則說明人工抗原合成成功[17]。半抗原、載體蛋白和人工抗原的紫外吸收光譜見圖3。可以看出，人工抗原的光譜曲線明顯區(qū)別于相應(yīng)的載體蛋白，說明人工抗原合成成功。

圖3 人工抗原的紫外吸收光譜圖Fig.3 UV spectra of artificial antigens

采用MADLI-TOF MS測定BSA和免疫原坎地沙坦-BSA的分子質(zhì)量，計(jì)算偶聯(lián)比。從圖4可知，BSA相對分子質(zhì)量為66433，坎地沙坦-BSA相對分子質(zhì)量為68672?？驳厣程古cBSA通過酰胺鍵偶聯(lián)，BSA分子上偶聯(lián)1 個(gè)坎地沙坦分子，相對分子質(zhì)量增加422.5，計(jì)算得到坎地沙坦-BSA的偶聯(lián)比為5.3。

圖4 BSA（A）及坎地沙坦-BSA（B）質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of BSA (A) and candesartan-BSA (B)

2.2 抗體特性評價(jià)

不同包被模式下，抗血清記作PAb-坎地沙坦的效價(jià)和抑制率測定結(jié)果見表2，其中包被原質(zhì)量濃度和待測物質(zhì)量濃度均為1 μg/mL。同源包被模式下，PAb-坎地沙坦的效價(jià)為243000，對坎地沙坦的抑制率為65%，對其他3 種待測物無抑制；以纈沙坦-OVA作為包被原的異源包被模式下，PAb-坎地沙坦的效價(jià)為9000，對坎地沙坦、氯沙坦羧酸、奧美沙坦和纈沙坦4 種待測物均呈現(xiàn)了很高的抑制率，分別為92%、93%、92%和91%；以氯沙坦羧酸-OVA和奧美沙坦-OVA作為包被原時(shí)，PAb-坎地沙坦的效價(jià)為9000，但抑制率很低或抑制率為0%?？赡茉蚴抢i沙坦分子結(jié)構(gòu)中不含苯并咪唑或咪唑結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)上的差異使得纈沙坦-OVA作為包被原時(shí)，對抗體的親和力較小，提高了抗體對游離藥物的檢測靈敏度[18]。實(shí)驗(yàn)以抗血清PAb-坎地沙坦、包被原纈沙坦-OVA建立ic-ELISA法。

表2 不同包被模式下抗血清PAb-坎地沙坦的效價(jià)及抑制率Table 2 Titers and inhibition rates of antiserum PAb-candesartan under heterologous and homologous coating modes

2.3 ic-ELISA法建立

最佳工作條件：包被原質(zhì)量濃度為4 μg/mL，抗血清稀釋倍數(shù)為1∶15000，反應(yīng)體系為PBS（pH 7.4，10 mmol/L），競爭反應(yīng)時(shí)間為30 min。在最佳工作條件下建立坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。緩沖溶液體系中，方法對坎地沙坦的檢出限IC10為0.012 ng/mL，IC50為0.18 ng/mL，線性范圍IC20～I(xiàn)C80為0.032～1.02 ng/mL。

圖5 ic-ELISA法檢測坎地沙坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）Fig.5 Standard curve for the detection of candesartan by ic-ELISA (n =3)

2.4 交叉反應(yīng)率評價(jià)

在以纈沙坦-OVA作為包被原的異源包被模式下，抗血清PAb-坎地沙坦對10 種沙坦類藥物的交叉反應(yīng)率見表3。免疫半抗原坎地沙坦為聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物，含有聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物含有的共性結(jié)構(gòu)聯(lián)苯四氮唑結(jié)構(gòu)，故以其作為免疫半抗原制備的抗血清PAb-坎地沙坦對其他7 種聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物均呈現(xiàn)了較好的異源親和能力，對氯沙坦羧酸、洛沙坦鉀、奧美沙坦、奧美沙坦酯、厄貝沙坦、纈沙坦和纈沙坦甲酯的交叉反應(yīng)率分別為109%、27%、495%、32%、55%、21%、7%；非聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的分子結(jié)構(gòu)中不含有聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物，抗血清PAb-坎地沙坦對阿奇沙坦、甲磺酸依普羅沙坦和替米沙坦的交叉反應(yīng)率低于0.1%，說明該抗血清對聯(lián)苯四氮唑結(jié)構(gòu)具有特異性識(shí)別能力?？寡錚Ab-坎地沙坦對8 種聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的IC50在0.04～2.4 ng/mL之間，具有良好的廣譜特異性。

表3 ic-ELISA法對沙坦類藥物的檢出限、IC50、線性范圍及交叉反應(yīng)率檢測結(jié)果（n=3）Table 3 Detection limit,IC50,linear range and cross-reactivity of ic-ELISA for sartans (n =3)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

基質(zhì)成分引起的基質(zhì)效應(yīng)（待測物響應(yīng)增強(qiáng)或響應(yīng)抑制）會(huì)嚴(yán)重影響定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[19-20]。ELISA實(shí)驗(yàn)中常用的基質(zhì)效應(yīng)消除方法有標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋法[21-22]、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法[23-24]、基質(zhì)多重凈化法[25-27]等?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法是利用空白基質(zhì)提取液作為待測物的稀釋液，建立校正曲線，可同等程度地補(bǔ)償目標(biāo)分析物在樣品提取液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)強(qiáng)度差異，是一種常用的基質(zhì)效應(yīng)消除方法。但由于不同樣品的基質(zhì)性質(zhì)差異較大，在實(shí)際檢測中為保證檢測的準(zhǔn)確性，需要針對每種待測樣品基質(zhì)制備其空白提取液及基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，工作量大，不適用大批量不同類型樣品的檢測?；|(zhì)多重凈化法是采用多種凈化方法，如固相萃取[28]、磁富集[29]和液相色譜分離法[30]等，盡可能地將除目標(biāo)分析物之外的其他基質(zhì)成分去除，以消除其可能帶來的基質(zhì)干擾。該方法往往對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高，操作較為繁瑣，耗時(shí)長，適用于對靈敏度要求較高的樣品檢測。標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋法是通過用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液對樣品提取液進(jìn)行一定程度的稀釋，將樣品中的基質(zhì)成分降低到較低水平，進(jìn)而減弱或消除其帶來的基質(zhì)效應(yīng)。該方法操作簡便，不需要復(fù)雜的樣品前處理方法，也不需要每次檢測時(shí)針對每種樣品基質(zhì)制備空白提取液，在實(shí)際檢測應(yīng)用中可操作性強(qiáng)。

鑒于建立的ic-ELISA法對8 種目標(biāo)分析物的靈敏度IC50在0.04～2.4 ng/mL之間，靈敏度遠(yuǎn)高于其在保健食品中的實(shí)際含量水平，為提高實(shí)驗(yàn)的簡便性，本實(shí)驗(yàn)探究采用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋法消除基質(zhì)效應(yīng)的可行性。鑒于不同劑型的降壓類保健食品的輔料差別較大，故實(shí)驗(yàn)考察片劑、硬膠囊、軟膠囊和茶葉4 種不同劑型樣品的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見圖6。4 種樣品基質(zhì)采用簡單的甲醇提取法對樣品進(jìn)行前處理后，提取液經(jīng)PBS稀釋1000 倍后的標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線趨勢一致，兩者基本重合，基質(zhì)效應(yīng)均可忽略。因此，樣品提取液用PBS稀釋至少1000 倍后用于ic-ELISA測定。

圖6 4 種不同樣品基質(zhì)對ic-ELISA性能的影響Fig.6 Effects of four different sample matrices on ic-ELISA performance

2.6 添加回收率測定

將8 種聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，進(jìn)行LC-MS/MS法測定，當(dāng)信噪比為3時(shí)，計(jì)算得到LC-MS/MS法對坎地沙坦、氯沙坦羧酸、洛沙坦鉀、奧美沙坦、奧美沙坦酯、厄貝沙坦、纈沙坦和纈沙坦甲酯的檢出限分別為0.2、0.6、0.1、0.2、0.5、0.3、0.3 ng/mL和0.03 ng/mL。8 種目標(biāo)分析物在5～100 ng/mL范圍內(nèi)，均呈線性關(guān)系。保健食品中添加的藥物需達(dá)到一定劑量后，才能發(fā)揮有效的藥物作用；如果劑量過小，其被人體吸收后不能達(dá)到有效濃度，便無法發(fā)揮藥效[16]。目前已報(bào)道的聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物在保健食品中的檢出量為1.8～88.2 mg/g[10]。鑒于此，為適應(yīng)可能非法添加有聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的保健食品其實(shí)際含量水平，實(shí)驗(yàn)選取0.1、1、10、100 mg/g四個(gè)添加水平，測定8 種目標(biāo)分析物在片劑、硬膠囊、軟膠囊和茶葉4 種劑型的降壓類保健食品中的添加回收率。結(jié)果顯示，8 種目標(biāo)分析物ic-ELISA法的平均回收率為80.6%～120.0%之間變異系數(shù)在0.3%～14.0%之間，具有良好的回收率和重復(fù)性；LC-MS/MS法的平均回收率在81.0%～118.4%之間，變異系數(shù)在0.1%～8.4%之間。兩者檢測結(jié)果的相關(guān)性見圖7，8 種目標(biāo)分析物的相關(guān)系數(shù)r均不低于0.97。ic-ELISA法和LC-MS/MS法測定結(jié)果一致性良好，說明實(shí)驗(yàn)所建立的ic-ELISA法準(zhǔn)確性良好。

圖7 ic-ELISA法和LC-MS/MS法測定結(jié)果相關(guān)性曲線Fig.7 Correlation of LC-MS/MS results with ic-ELISA results

2.7 盲樣檢測

選取14 份不同劑型的降壓類保健食品，其中片劑2 份、硬膠囊3 份、軟膠囊4 份和茶葉5 份，同時(shí)采用ic-ELISA法和LC-MS/MS法進(jìn)行檢測，均未檢出目標(biāo)分析物。從每種樣品基質(zhì)中隨機(jī)選取一份樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收測試，加標(biāo)量為0.10 mg/g，結(jié)果見表4，兩種方法的添加回收率均較好，一定程度說明了本次盲樣檢測實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可信度高。

表4 ic-ELISA法和LC-MS/MS法盲樣檢測結(jié)果比較（n=3）Table 4 Comparison of blind analysis results by ic-ELISA and those by LC-MS/MS (n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用免疫分析技術(shù)，針對聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選取坎地沙坦作為通用半抗原，制備免疫原免疫動(dòng)物并進(jìn)行抗體特性評價(jià)，以纈沙坦-OVA作為包被原時(shí)，抗血清PAb-坎地沙坦取得了較好的效價(jià)和廣譜特異性，通過工作條件優(yōu)化，建立了針對聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物多殘留檢測的ic-ELISA法，對坎地沙坦、氯沙坦羧酸、洛沙坦鉀、奧美沙坦、奧美沙坦酯、厄貝沙坦、纈沙坦和纈沙坦甲酯8 種聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的IC50分別為0.2、0.2、0.7、0.04、0.6、0.3、0.9、2.4 ng/mL，對3 種非聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的交叉反應(yīng)率小于0.1%。

對片劑、硬膠囊、軟膠囊和茶葉4 種不同劑型降壓類保健食品，采用甲醇超聲提取，標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋法消除基質(zhì)效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)添加量為0.1、1、10、100 mg/g時(shí)，8 種目標(biāo)分析物的添加回收率為80.6%～120.0%，變異系數(shù)為0.3%～14.0%；采用LC-MS/MS法對添加回收檢測結(jié)果進(jìn)行確證，兩者測定結(jié)果相關(guān)系數(shù)r不低于0.97，一致性良好。本研究所建立的ic-ELISA法具有準(zhǔn)確、快速、樣品前處理簡單、可多殘留檢測的優(yōu)點(diǎn)，可用于降壓類保健食品中聯(lián)苯四氮唑沙坦類藥物的快速篩查。