鄧婷婷，黃文勝，曹際娟，于 寧，邢冉冉，張九凱，葛毅強(qiáng)，陳 穎,

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，北京 100045）

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品低水平混雜（low level presence，LLP），即生產(chǎn)、貿(mào)易及加工的農(nóng)產(chǎn)品中，因各種原因?qū)е潞休^低或極低水平未經(jīng)進(jìn)口國(guó)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因成分。LLP有3 個(gè)明顯特征：發(fā)生LLP的轉(zhuǎn)基因作物非經(jīng)進(jìn)口國(guó)批準(zhǔn)，但其安全性已得到其他國(guó)家的認(rèn)可；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品LLP問(wèn)題僅與貿(mào)易有關(guān)；LLP是微量可限定的[1-4]。在農(nóng)產(chǎn)品供應(yīng)鏈的多個(gè)節(jié)點(diǎn)上，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品都可能混雜的可能性，如育種階段的花粉漂移、大宗運(yùn)輸及生產(chǎn)加工過(guò)程中的殘留污染等，完全清除供應(yīng)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)基因成分殘留有現(xiàn)實(shí)難度[5-7]。因此，轉(zhuǎn)基因作物L(fēng)LP從客觀上無(wú)法避免。隨著全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積越來(lái)越大，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的全球貿(mào)易量也在不斷增加，但不同國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品批準(zhǔn)的范圍與進(jìn)度不一[8-9]，農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品LLP事件發(fā)生的頻率越來(lái)越高，LLP事件已占轉(zhuǎn)基因成分混雜事件的50%左右，其中大豆是引發(fā)LLP事件的主要作物之一[10-12]。因此，建立科學(xué)的轉(zhuǎn)基因大豆LLP判定方法，尤其是定量分析方法，將農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的轉(zhuǎn)基因健康及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)降到最低，可以保障我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口的穩(wěn)定與進(jìn)一步的發(fā)展。

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)隨著科技進(jìn)步而快速發(fā)展，目前主要的檢測(cè)手段仍以實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）為主，近年來(lái)數(shù)字PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，數(shù)字PCR由于具有測(cè)量獨(dú)立性與無(wú)需任何校準(zhǔn)物的特點(diǎn)，使得低豐度靶標(biāo)分子的精準(zhǔn)定量成為可能。但無(wú)論是real-time PCR定性檢測(cè)還是數(shù)字PCR定量檢測(cè)，其檢測(cè)極限值仍然存在，超出極限值的誤差不可避免。任何檢測(cè)結(jié)果都會(huì)或多或少偏離真實(shí)值，因此在描述轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果的同時(shí)指出定量結(jié)果的可靠程度非常有必要。CNASCL01-G003:2021《測(cè)量不確定度的要求》規(guī)定，檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)每項(xiàng)有數(shù)值要求的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)定。不確定度作為衡量檢測(cè)結(jié)果可靠程度的重要指標(biāo)，能定量表示檢測(cè)數(shù)據(jù)的分散范圍，有助于判斷“臨界值”的符合性[13-16]。根據(jù)測(cè)量不確定度的定義，測(cè)量結(jié)果的不確定度可以用標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行表征。實(shí)際工作中則可以實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差S作為其估計(jì)值[17-19]。而在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的過(guò)程中，將定值不確定度與均勻性評(píng)估、穩(wěn)定性考察引入的不確定度按照平方和開(kāi)方的方法疊加就給出了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，該合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k得出的不確定度稱為擴(kuò)展不確定度U[20]。而對(duì)于轉(zhuǎn)基因定量的不確定度目前鮮見(jiàn)研究報(bào)道。因此，采用數(shù)字PCR方法研究從轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品LLP定量的整個(gè)過(guò)程并科學(xué)評(píng)估定量結(jié)果的不確定度，建立科學(xué)的LLP判定方法，減少LLP貿(mào)易風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易具有極為重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因大豆（Glycine max）GTS40-3-2等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于歐盟聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）；非轉(zhuǎn)基因大豆等樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存。

ddPCR Super Mix（no dUTP）、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8 Cartridge等試劑和耗材 美國(guó)Bio-Rad公司；RealMaster Mix（with ROX）美國(guó)ABI公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithyl ammonium bromide，CTAB）、氯化鈉（NaCl）北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（disodium ethylenediamine tetraacetic acid，Na2EDTA）美國(guó)Amresco公司；三氯甲烷、無(wú)水乙醇、異丙醇（均為分析純）北京六合通公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QX200TMDroplet Digital PCR系統(tǒng)（包括微滴生成器、封膜機(jī)、PCR擴(kuò)增儀和微滴讀取儀）美國(guó)Bio-Rad公司；7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)ABI公司；研磨機(jī)德國(guó)IKA公司；離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；Qubit核酸蛋白分析儀 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與試劑配制

低含量轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-4樣品的制備：取0.5 g轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到49.5 g非轉(zhuǎn)基因大豆中，充分混合均勻并研磨至60 目，制成轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的樣品，再取0.5 g含1%轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的樣品加入到49.5 g非轉(zhuǎn)基因大豆中，充分混合均勻并研磨至60 目，制成轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的樣品，按照此方法再依次制成含0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的樣品。

CTAB提取緩沖液（20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L Na2EDTA，pH 8.0）：稱取5 g CTAB、20.45 g NaCl、3.03 g Tris和1.86 g Na2EDTA，溶于200 mL去離子水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，用濃HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，最后加去離子水定容至250 mL，121 ℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

CTAB沉淀液（5 g/L CTAB、40 mmol/L NaCl）：稱取0.5 g CTAB和0.234 g NaCl加入去離子水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）：量取1 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和0.2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），加去離子水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液：稱取121.1 g Tris置于1 L燒杯中，約加入800 mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓瑧?yīng)使溶液冷卻至室溫后用濃HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，最后加去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，備用。

0.5mol/L EDTA（pH 8.0）緩沖液：稱取186.1 g Na2EDTA·2H2O，置于1 L燒杯中，約加入800 mL去離子水，充分?jǐn)嚢?，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0（約20 g NaOH），最后加去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因組DNA提取

樣品采用GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸純化提取方法》中改良的CTAB法[21]提取基因組DNA，提取過(guò)程中將樣本量增加2 倍，蛋白酶K量增加2.5 倍，去蛋白的步驟重復(fù)1 次，溶解沉淀的緩沖液體積減少至原來(lái)1/2。利用核酸蛋白分析儀分別測(cè)定提取的樣品DNA溶液的濃度及質(zhì)量后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)歐盟標(biāo)準(zhǔn)方法（JRC，2017）合成大豆凝集素基因（Lectin）和GTS-40-3-2品系特異性基因引物探針，根據(jù)GB/T 38164—2019《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[22]方法合成黃牛Cytb基因引物探針（表1），相關(guān)序列及其標(biāo)記由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2定量引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probes used for quantitative analysis of GTS-40-3-2

1.3.4 擴(kuò)增體系和反應(yīng)參數(shù)

數(shù)字PCR擴(kuò)增體系：分別向0.2 mL PCR管中加入2×ddPCR Super Mix（no dUTP）10 μL，終濃度為0.4 μmol/L的正向引物和反向引物，0.2 μmol/L熒光標(biāo)記探針，5 μL DNA模板，利用ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。

數(shù)字PCR擴(kuò)增參數(shù)：根據(jù)儀器要求，將配制好的數(shù)字PCR混合液，加入Droplet Generator DG8 Cartridge的加樣孔中，在其另一側(cè)加入ddPCR Droplet Generation Oil后放入QX200TMDroplet Digital PCR微滴生成器中，由儀器自動(dòng)生成微滴。將生成的微滴移至PCR板中進(jìn)行加膜密封后放置于PCR擴(kuò)增儀中，按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性5 min（1 ℃/s），1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min（1 ℃/s），50 個(gè)循環(huán)；98 ℃延伸10 min（1 ℃/s），1 個(gè)循環(huán)；12 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物放入微滴讀取儀中進(jìn)行熒光檢測(cè)，記錄陽(yáng)性和陰性微體系數(shù)量及其比值。根據(jù)比值分別計(jì)算數(shù)字PCR體系中的大豆Lectin基因和GTS-40-3-2品系特異性基因拷貝數(shù)（copies/μL）。

real-time PCR擴(kuò)增體系和參數(shù)：0.2 mL PCR反應(yīng)管中加入2×RealMaster Mix（with ROX）10 μL，終濃度為0.4 μmol/L的正向引物和反向引物、0.2 μmol/L的探針、5 μL DNA模板，利用ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。real-time PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s；60 ℃退火延伸45 s；45 個(gè)循環(huán)。

1.3.5 real-time PCR方法定性檢測(cè)限的確定

將含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2的樣品基因組DNA模板10、100、1000 ng加入real-time PCR擴(kuò)增體系中，每個(gè)樣品重復(fù)20 次，確定95%置信區(qū)間下能穩(wěn)定檢出的最低DNA添加量和定性檢測(cè)限。每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中添加黃牛DNA（20 copies/反應(yīng)）作為內(nèi)參照，ddH2O為空白對(duì)照。

1.3.6 數(shù)字PCR方法的定性檢測(cè)限和定量檢測(cè)限的確定

按1.3.3節(jié)方法分別對(duì)含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2的樣品進(jìn)行數(shù)字PCR定量，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行檢測(cè)。

1.3.7 數(shù)字PCR方法定量精密度和重復(fù)性

為驗(yàn)證所建立的ddPCR方法對(duì)低含量轉(zhuǎn)基因大豆的定量精密度，在重復(fù)性條件下，用同樣的方法、相同的測(cè)試環(huán)境下進(jìn)行數(shù)字PCR定量實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品平行檢測(cè)10 次。根據(jù)內(nèi)外源基因的拷貝數(shù)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）及相對(duì)誤差，以判別其精密度和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 real-time PCR檢測(cè)模板添加量和定性檢測(cè)限

將含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2的樣品基因組DNA模板10、100 ng及1000 ng加入real-time PCR擴(kuò)增體系中擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中添加的內(nèi)參照黃牛DNA均被檢出且Ct值無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明即使擴(kuò)增體系中DNA模板含量高達(dá)1000 ng，PCR也未受抑制。含0.1%和0.05%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2的樣品分別添加10 ng和100 ng模板即可檢出。含0.01%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2的樣品需要將模板量添加至1000 ng時(shí)才可檢出GTS-4-3-2品系特異性基因，而低于此含量后，0.005%和0.001%的樣品GTS-4-3-2品系特異性基因檢出率極低（表2）。即95%置信區(qū)間下，當(dāng)模板添加量為1000 ng時(shí)，LLP轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2的realtime PCR定性檢測(cè)限為0.01%，低于其他報(bào)道中的realtime PCR檢測(cè)方法[23-24]。表明即使擴(kuò)增體系中DNA模板含量高達(dá)，PCR也未受抑制。

表2 不同樣品real-time PCR檢測(cè)20 次重復(fù)陽(yáng)性結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Results of different samples being tested positive 20 times by real-time PCR

2.2 數(shù)字PCR的定性檢測(cè)限和定量檢測(cè)限

分別對(duì)含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2的樣品進(jìn)行數(shù)字PCR定量時(shí)，在內(nèi)外源基因陰性對(duì)照及空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增的情況下，所有轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2樣品Lectin基因定量結(jié)果的3 次重復(fù)RSD值均在5%以內(nèi)，表明所有操作精密度較好，定量結(jié)果較為可靠。含0.1%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2樣品定量結(jié)果為0.104%，相對(duì)誤差和3 次重復(fù)RSD分別為4.015%和18.533%，小于目前國(guó)際通用的定量方法要求。含0.05%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2樣品的相對(duì)誤差和3 次重復(fù)RSD分別為42.305%和61.171%，不符合轉(zhuǎn)基因定量中相對(duì)誤差在25%以內(nèi)的要求，結(jié)果僅可作為樣品中轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2品系LLP的含量參考。而3 次重復(fù)定量的0.01%樣品均出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果（表3）。表明本研究建立的數(shù)字PCR方法對(duì)LLP轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2樣品的定量檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1%，定性檢測(cè)限則可達(dá)0.01%。

表3 不同含量轉(zhuǎn)基因大豆樣品數(shù)字PCR定量檢測(cè)結(jié)果Table 3 Quantitative results of different contents of GTS-40-3-2 by digital PCR

2.3 數(shù)字PCR定量方法的精密度和重復(fù)性

為驗(yàn)證所建立的ddPCR方法對(duì)低含量轉(zhuǎn)基因大豆的定量檢測(cè)精密度，在重復(fù)性條件下，用同樣的方法、相同的測(cè)試環(huán)境下，很短的時(shí)間間隔內(nèi)得到測(cè)試結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品平行檢測(cè)6 次。含0.1%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2六個(gè)平行樣品的定量結(jié)果分別為0.102%、0.081%、0.104%、0.112%、0.094%和0.118%，所有樣品的3 次重復(fù)RSD在11.28%～22.75%之間，與實(shí)際含量的相對(duì)誤差值在-10.55%～24.12%之間（圖1a）。

圖1 轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2樣品6 次重復(fù)定量結(jié)果Fig.1 Quantitative results of six replicates of GTS-40-3-2

含0.1%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2樣品的相對(duì)誤差和RSD均小于常規(guī)定量要求的25%，表明該方法即使在對(duì)低含量的樣品進(jìn)行重復(fù)定量時(shí)，其精密度和穩(wěn)定性均較為理想。含0.05%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-4-3-2六個(gè)平行樣品定量結(jié)果分別為0.026%、0.063%、0.046%、0.025%、0.033%、0.027%、0.034%，所有樣品的3 次重復(fù)RSD在43.98%～67.54%之間，與實(shí)際含量值的偏差在-50.00%～26.00%之間（圖1b），定量精密度和定量值波動(dòng)范圍超過(guò)國(guó)際通用定量要求，但在日?？刹僮鞯那疤嵯拢部蓪?shí)現(xiàn)半定量，對(duì)LLP樣品的篩查檢測(cè)和出入境貿(mào)易可以提供一定參考依據(jù)。

2.4 轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2LLP定量的不確定度

日?？山邮艿牟僮鞣秶鷥?nèi)，本研究分別對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于0.1%和0.05%的轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2樣品進(jìn)行LLP定量研究，因此以下將分開(kāi)計(jì)算這兩種不同含量樣品的定量不確定度。

根據(jù)ISO導(dǎo)則35、ISO/TS 21748:2017和我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[25-28]，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品LLP檢測(cè)的不確定度進(jìn)行評(píng)定。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品LLP定量檢測(cè)過(guò)程帶來(lái)的合成不確定度由兩部分組成，第一部分是通過(guò)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出的A類不確定度；第二部分是通過(guò)對(duì)測(cè)量影響因素的分析，以非統(tǒng)計(jì)分析方法評(píng)定的B類不確定度。

2.4.1 A類不確定度

由于數(shù)字PCR為終點(diǎn)計(jì)數(shù)的絕對(duì)定量，傳統(tǒng)realtime PCR定量方法中需考慮的內(nèi)外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線不確定度、樣品批內(nèi)Ct值不確定度、PCR擴(kuò)增效率的不確定度等都無(wú)需考慮。因此其A類不確定度表示為：

式中：μa為標(biāo)準(zhǔn)不確定度；為n次含量測(cè)定值的算術(shù)平均數(shù)，n≥6；x為每次含量測(cè)定值；i為測(cè)定序號(hào)；n為平行測(cè)量次數(shù)。

由2.4節(jié)可計(jì)算出6 次重復(fù)的含0.1%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2定量的A類相對(duì)不確定度uAr0.1%為0.1152，而6 次重復(fù)的0.05%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2定量的A類相對(duì)不確定度應(yīng)uAr0.05%為0.5359。

2.4.2 B類相對(duì)不確定度

采用的數(shù)字PCR儀器為Bio-Rad QX200微滴式數(shù)字PCR，因此B類不確定度的來(lái)源主要有微滴體積引入的測(cè)量不確定度、配制樣品時(shí)天平變動(dòng)性引入的不確定度、數(shù)字PCR儀器校準(zhǔn)引入的不確定度。

2.4.2.1 微滴體積引入的測(cè)量不確定度

本研究采用的數(shù)字PCR儀器微滴體積引入的測(cè)量不確定度u體積為常數(shù)1.40%。

2.4.2.2 配制樣品時(shí)天平變動(dòng)性引入的不確定度

天平變動(dòng)性產(chǎn)生的不確定度：由天平的檢定證書(shū)可知其變動(dòng)性為0.1 mg，按照矩形分布，則樣品凈質(zhì)量為2 次稱量操作所得。每次稱質(zhì)量均為獨(dú)立觀測(cè)結(jié)果，故計(jì)算兩次為：

天平的最大允差產(chǎn)生的不確定度：由天平檢定證書(shū)可知其最大允差為0.15 mg，按照矩形分布，則u1最大允差同樣，樣品凈質(zhì)量為兩次稱量操作所得。每1 次稱質(zhì)量均為獨(dú)立觀測(cè)結(jié)果，故計(jì)算兩次為：

稱量10、1、0.5 g大豆產(chǎn)生的相對(duì)不確定度分別為：

合成稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度：

2.4.2.3 數(shù)字PCR儀器校準(zhǔn)引入的不確定度

根據(jù)儀器校準(zhǔn)證書(shū)可知，本實(shí)驗(yàn)所用的Bio-Rad QX200微滴式數(shù)字PCR校準(zhǔn)不確定度u校準(zhǔn)為2.03%。

本研究中數(shù)字PCR定量GTS40-3-2的B類不確定度由上述3 個(gè)分量組成，其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度則表示為：

0.1%及以上轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2定量的合成相對(duì)不確定度應(yīng)為：

含0.05%的轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2定量的合成相對(duì)不確定度應(yīng)為：

取包含因子k=2（置信區(qū)間95%），則結(jié)果報(bào)告為0.1%轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2定量擴(kuò)展不確定度為23.56%，0.05%的轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2定量的擴(kuò)展不確定度為107.29%。

3 結(jié)論與討論

有效的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)方法無(wú)疑是對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行LLP檢測(cè)和實(shí)施標(biāo)識(shí)制度最直接的技術(shù)保障。數(shù)字PCR步驟繁瑣，檢測(cè)通量比real-time PCR低，因此在轉(zhuǎn)基因成分定性檢測(cè)中，仍然不及real-time PCR優(yōu)勢(shì)明顯。但數(shù)字PCR技術(shù)由于將含有DNA模板的微量樣品進(jìn)行稀釋以及分液，分布到大量的獨(dú)立反應(yīng)室中進(jìn)行擴(kuò)增，極大降低了反應(yīng)間的相互抑制，提高了反應(yīng)效率。數(shù)字PCR可以對(duì)樣品進(jìn)行絕對(duì)定量分析，比real-time PCR僅依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線確定轉(zhuǎn)基因成分含量更加準(zhǔn)確。因此，本研究開(kāi)展了從DNA提取到定量全過(guò)程的系統(tǒng)性轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2的LLP檢測(cè)研究，定性檢測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)基因LLP時(shí)仍然推薦real-time PCR方法，定性檢測(cè)限基本與數(shù)字PCR一致，可低至0.01%。定量檢測(cè)時(shí)數(shù)字PCR優(yōu)勢(shì)明顯，可對(duì)含0.1%轉(zhuǎn)基因的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量，即使是低至0.05%的轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2樣品仍可進(jìn)行半定量，其定性和定量靈敏度低于已發(fā)表文章中的檢測(cè)限，也低于國(guó)內(nèi)外的現(xiàn)行標(biāo)識(shí)最低閾值[23-24,29-30]。且本研究采用的檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室和人員要求較為寬松，因此建立的定量方法在轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2的LLP檢測(cè)中具有比realtime PCR更大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)于LLP的定量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中考慮測(cè)量值的不確定度非常有必要。采用數(shù)字PCR檢測(cè)時(shí)，不受標(biāo)準(zhǔn)樣品、內(nèi)外源基因拷貝數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及PCR擴(kuò)增效率的不確定度影響，因而定量結(jié)果更為可靠。本研究對(duì)0.1%和0.05%的GTS-40-3-2品系轉(zhuǎn)基因大豆原料進(jìn)行定量檢測(cè)的擴(kuò)展不確定度分別為23.56%和107.29%。在實(shí)際檢測(cè)中，若樣品為加工食品時(shí)，則還需考慮樣品的基質(zhì)效應(yīng)及食品加工過(guò)程中帶來(lái)的DNA斷裂、降解等產(chǎn)生的不確定度。對(duì)于這些因素，目前的科學(xué)手段還無(wú)法描述，因此在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，難以給出加工食品LLP定量的不確定度。