蘇澤,譚貴良,劉子雄,黃嘉曼,李梅,胡文鋒*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣東 廣州,510642)2(電子科技大學(xué) 中山學(xué)院,廣東 中山,528402)3(中山市食品藥品檢測(cè)所,廣東 中山,528437)

腐乳是極具中國(guó)特色的大豆發(fā)酵食品之一,至今已有1 500年的悠久歷史[1]。腐乳滋味鮮美、風(fēng)味獨(dú)特,廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。腐乳按照色澤風(fēng)味可分為白腐乳、紅腐乳、青(臭)腐乳3大類(lèi)[2]。腐乳的生產(chǎn)環(huán)節(jié)分為前發(fā)酵和后發(fā)酵2個(gè)階段。前發(fā)酵是通過(guò)自然接種或人工接種,培養(yǎng)富含蛋白酶的微生物;后發(fā)酵則是腐乳裝瓶后酶與微生物協(xié)同作用[3],后發(fā)酵階段既是風(fēng)味物質(zhì)[4-5]產(chǎn)生的主要階段,也是有害物質(zhì)生成的主要階段[6-7]。

生物胺(biogenic amines,BAs)是一類(lèi)廣泛存在于食品中的低分子質(zhì)量含氮有機(jī)化合物的總稱(chēng),常見(jiàn)的有組胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺以及亞精胺。雖然人體攝入微量的生物胺能促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)代謝活力、增強(qiáng)免疫力和清除自由基等效用,但過(guò)量攝入生物胺則會(huì)引起頭疼、腹部痙攣、嘔吐等不良生理反應(yīng)[8]。腐乳因富含蛋白質(zhì)、氨基酸,容易累積生物胺。LI等[9]檢測(cè)了64種來(lái)自15個(gè)不同產(chǎn)地腐乳樣品中的生物胺,所有樣品均檢測(cè)出腐胺、酪胺、苯乙胺、色胺以及尸胺等常見(jiàn)生物胺,其中白腐乳總生物胺含量高達(dá)533.54 mg/kg。根據(jù)SANTOS等[10-11]對(duì)生物胺的推薦毒性限量(苯乙胺30 mg/kg、組胺100 mg/kg、酪胺100～800 mg/kg),目前從商品腐乳中檢測(cè)出的苯乙胺(736.64 mg/kg)[12]、組胺(1 186.93 mg/kg)[13]、酪胺(1 730 mg/kg)[14]含量均嚴(yán)重超過(guò)推薦毒性限量。本課題組前期對(duì)不同商品腐乳的研究也發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)腐乳總生物胺含量差異很大(53.59～5 837.10 mg/kg)[15],8個(gè)樣品中有5個(gè)都超過(guò)生物胺推薦最高污染水平1 000 mg/kg[10]。這些結(jié)果表明,腐乳中生物胺含量過(guò)高已影響腐乳成品質(zhì)量及食品安全性問(wèn)題[16]。

生物胺的產(chǎn)生離不開(kāi)微生物對(duì)氨基酸的脫羧反應(yīng),以及適合這些微生物合成氨基酸脫羧酶并發(fā)揮其作用的理化條件。前期對(duì)腐乳產(chǎn)生物胺菌的研究主要集中在微生物群落水平,例如LIANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)紅方腐乳發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)的變化會(huì)影響生物胺的生成,枯草芽孢桿菌和熱帶芽孢桿菌會(huì)在腐乳后發(fā)酵7～28 d時(shí)增加組胺、酪胺、腐胺和尸胺的生成量。本課題組基于宏基因組鳥(niǎo)槍測(cè)序?qū)ξ覈?guó)市場(chǎng)上不同類(lèi)型商品腐乳中產(chǎn)生物胺的微生物群落及重建物種進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)重建物種含有不同種類(lèi)的脫羧酶基因和豐度[15]。

最近,陸續(xù)有從商品腐乳中分離鑒定出產(chǎn)胺菌的報(bào)道。梁靜靜等[18]從24種市售腐乳樣品中分離出20株產(chǎn)胺菌,經(jīng)過(guò)16S rDNA鑒定后均為芽孢桿菌屬。王維亞等[19]從12種不同品牌的江西腐乳中獲取到6株產(chǎn)胺菌(耐熱芽孢桿菌、魯梅利桿菌、耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌和皮脂葡萄球菌),經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些菌產(chǎn)腐胺和酪胺的量最大。但至今未見(jiàn)從腐乳后發(fā)酵環(huán)節(jié)中分離出產(chǎn)胺菌的報(bào)道。

基于此,本研究以廣東典型白方腐乳后發(fā)酵過(guò)程樣品為研究對(duì)象,對(duì)產(chǎn)胺菌進(jìn)行分離、純化和鑒定,并對(duì)典型菌株的產(chǎn)胺特性進(jìn)行研究。目的是了解腐乳生產(chǎn)過(guò)程中的產(chǎn)胺菌種類(lèi)和不同條件對(duì)產(chǎn)胺菌產(chǎn)胺特性的影響,為控制生物胺的產(chǎn)生提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 樣品

白方腐乳后發(fā)酵樣品,廣東省江門(mén)市恩平縣的一家傳統(tǒng)腐乳生產(chǎn)廠。

1.1.2 試劑

LB肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨1%,酵母浸出粉0.5%,胰蛋白胨1%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

產(chǎn)生物胺篩選培養(yǎng)基(g/L):牛肉浸出粉5.0,酵母浸出粉5.0,胰蛋白胨5.0,葡萄糖0.5;吐溫-80 1 mL;NaCl 2.5,FeSO40.04,MnSO40.05,MgSO40.2,K2HPO42,CaCO30.1,檸檬酸銨2,維生素B10.01,5-磷酸吡哆醛0.05,溴甲酚紫0.06,瓊脂18。色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸各5,調(diào)節(jié)pH至5.3;121 ℃滅菌15 min[20]。

標(biāo)準(zhǔn)品:組氨酸、賴(lài)氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、磷酸吡哆醛(均為分析純),美國(guó)Sigma公司;組胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺(純度≥98%),上海阿拉丁試劑有限公司;丹磺酰氯(純度≥98%),分析純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

DNA提取試劑盒,湖南艾科瑞生物工程有限公司;引物:27F/1492R,TD2/TD5,上海生工生物工程股份有限公司;dNTPs、TaqDNA聚合酶,TaKaRa;Sepharose 6B瓊脂糖,北京索萊寶科技有限公司;核酸染液、DNA Marker、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、EDTA,北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限責(zé)任公司;乙酸,天津永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

FA 2004B電子分析天平,上海佑科儀器儀表有限公司;HCB-900V超凈工作臺(tái),青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司;DSX-24L-I高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;LRH-150F生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PB-10酸度計(jì),賽多維斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;BX53生物顯微鏡,奧林巴斯(中國(guó))有限公司;ST 8R高速冷凍離心機(jī)、MAXQ 4000臺(tái)式恒溫冷凍搖床、2720 thermal cycler PCR儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;Waters Alliance 2695高效液相色譜系統(tǒng),蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司;DYY-6C電泳儀,北京六一生物科技有限公司;BIO-RAD GelDoc GO凝膠成像系統(tǒng),伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;VICTOR Nivo酶標(biāo)儀,珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)胺菌的分離純化及形態(tài)觀察

稱(chēng)取25 g腐乳樣品,在無(wú)菌條件下將腐乳溶于225 mL無(wú)菌生理鹽水,使用無(wú)菌玻璃棒進(jìn)行研磨,攪拌均質(zhì),得到10-1濃度的稀釋液。分別從10-1的稀釋液中吸取1 mL,按10-2、10-3、10-4和10-5濃度稀釋后,再?gòu)拿總€(gè)濃度稀釋液中吸取100 μL涂布于產(chǎn)生物胺篩選培養(yǎng)基平板上,于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,觀察平板顏色變化。挑選不同稀釋梯度平板上單個(gè)紫色菌落,用生理鹽水按10-3、10-4和10-5梯度稀釋后得到稀釋菌液,再分別從每個(gè)梯度的稀釋菌液中吸取100 μL涂布于產(chǎn)生物胺篩選培養(yǎng)基平板上,于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,觀察平板顏色變化。按上述純化過(guò)程重復(fù)2～3次,得到單菌落。對(duì)分離菌株用LB肉湯培養(yǎng)基富集后,取單菌液進(jìn)行革蘭氏染色后于顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2 產(chǎn)胺菌的分子生物學(xué)鑒定

DNA提取:按照SteadyPure細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行提取。

PCR擴(kuò)增:采用16S rDNA序列通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:45 μL 1×TSE 101 mix、引物27F和引物1492R各2.0 μL(10 μm)、1.0 μL 模板DNA。PCR擴(kuò)增條件:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,56 ℃復(fù)性10 s,72 ℃延伸10 s/kb,共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min;最后于4 ℃保存。

結(jié)果檢測(cè):將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送樣至深圳市易科吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,以鑒定產(chǎn)胺菌株種屬。

1.2.3 超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法分析離菌株發(fā)酵液中的生物胺

將上述步驟純化得到的菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)8～10 h(對(duì)數(shù)期),取1 mL處于對(duì)數(shù)期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%的磷酸吡哆醛和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的氨基酸(組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸和賴(lài)氨酸),130 r/min搖床培養(yǎng)2 d,取1 mL發(fā)酵液于UPLC分析,平行測(cè)定3次。

生物胺含量的測(cè)定采用柱前衍生化法。樣品前處理方法參考李大偉等[21]的方法稍加修改。取1 mL上述步驟的培養(yǎng)液于15 mL離心管中,加入400 μL 1 mol/L NaOH溶液,然后加入300 μL的緩沖飽和溶液NaHCO3,再加入1 mL提前溶于丙酮的質(zhì)量濃度10 mg/mL的丹磺酰氯溶液,渦旋1 min,然后在避光條件下42 ℃水浴45 min,取出后加入100 μL氨水終止反應(yīng),再于黑暗中靜置30 min,最后用乙腈定容至5 mL。10 000 r/min離心5 min,吸取1～1.5 mL的衍生化溶液過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜打入樣品瓶,用于UPLC檢測(cè)分析。色譜條件參考HU等[15]的方法。

1.2.4 不同環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酪胺菌生長(zhǎng)研究

取70 μL處于對(duì)數(shù)期菌懸液接種于7 mL LB肉湯培養(yǎng)基(添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的磷酸吡哆醛和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%氨基酸,下同)中。37 ℃培養(yǎng)2 d,每12 h取樣,除不同pH值環(huán)境因素外,其余所有培養(yǎng)基的pH值均控制在5.50。不同環(huán)境因素水平:溫度15、25、35 ℃;乙醇體積分?jǐn)?shù)0、5%、10%、15%、20%、25%;氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;pH值4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5;NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、3.0%、6.0%、9.0%。每組設(shè)置空白對(duì)照,分別取樣200 μL測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm。

1.2.5 不同環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酪胺菌產(chǎn)胺特性研究

溫度的影響:取1 mL處于對(duì)數(shù)期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,分別于15、25、35 ℃,130 r/min搖床培養(yǎng)2 d,取1 mL培養(yǎng)液用于UPLC分析,并設(shè)空白對(duì)照。

氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響:取1 mL處于對(duì)數(shù)期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的氨基酸,37 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)2 d,取1 mL培養(yǎng)液用于UPLC分析,并設(shè)空白對(duì)照。

NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響:取1 mL處于對(duì)數(shù)期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、3.0%、6.0%和9.0%的NaCl,37 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)2 d,取1 mL培養(yǎng)液用于UPLC分析,并設(shè)空白對(duì)照。

乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響:取1 mL處于對(duì)數(shù)期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,分別按體積分?jǐn)?shù)0、5%、10%、15%、20%、25%添加乙醇,37 ℃、 130 r/min搖床培養(yǎng)2 d,取1 mL培養(yǎng)液用于UPLC分析,并設(shè)空白對(duì)照。

pH值的影響:取1 mL處于對(duì)數(shù)期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)pH值依次為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.5,37 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)2 d,取1 mL培養(yǎng)液用于UPLC分析,并設(shè)空白對(duì)照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。所有數(shù)據(jù)圖表采用Excel 2016和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行制作分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)胺菌的篩選及形態(tài)學(xué)觀察

添加溴甲酚紫的產(chǎn)生物胺篩選培養(yǎng)基是一種檢測(cè)氨基酸脫羧酶陽(yáng)性微生物的平板篩選方法[22]。產(chǎn)生物胺篩選培養(yǎng)基加入了多種氨基酸和顯色劑溴甲酚紫,當(dāng)微生物利用氨基酸合成堿性的生物胺時(shí),會(huì)使培養(yǎng)基菌落周?chē)鷓H上升從而顯紫色。因此挑選培養(yǎng)基菌落周?chē)仙木赀M(jìn)行分離和純化。

分離和純化后,從發(fā)酵后期45 d的白腐乳樣品中初步篩選出8株產(chǎn)生物胺菌,菌株編號(hào)S1～S8(表1)。對(duì)這些菌進(jìn)行革蘭氏染色和細(xì)胞形態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)除了S5為革蘭氏陽(yáng)性球菌,其余菌株均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌。

表1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定Table 1 Morphological identification of strains

由圖1-a可知,S5菌落中心為白色,菌落較小,呈顆粒狀,邊緣平滑整齊且有紫色物質(zhì)生成。結(jié)合革蘭氏染色結(jié)果及形態(tài)(圖1-b)可以初步判斷此菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌。但是也應(yīng)該看到,溴甲酚紫的顯色反應(yīng)只能指示微生物生長(zhǎng)環(huán)境的pH升高[23],并不能完全證實(shí)該菌就是產(chǎn)胺菌,因此還需要對(duì)初篩的菌株作進(jìn)一步驗(yàn)證。

a-平板菌落形態(tài);b-光學(xué)顯微鏡圖圖1 菌株S5的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain S5

將8個(gè)菌株提取DNA及PCR擴(kuò)增后,進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)分析。結(jié)果顯示,S1、S2、S3、S8等4株為擬蕈狀芽孢桿菌(Bacillusparamycoides)、S4為熱帶芽孢桿菌(Bacillustropicus)、S5為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、S6為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、S7為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(表2)。除菌株S1與參考序列相似性較低外(94.49%),其他7個(gè)菌株與比對(duì)的參考物種的相似性均大于99.7%。

表2 16S rDNA序列 Blast 比對(duì)Table 2 Blast analysis of 16S rDNA sequences

2.2 菌株培養(yǎng)液中的生物胺含量

2.2.1 生物胺回歸方程和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖

由圖2可知,標(biāo)準(zhǔn)品中的8種生物胺和內(nèi)標(biāo)在25 min內(nèi)得到較好分離,各生物胺單標(biāo)的回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表3所示,其線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997,生物胺含量和峰面積之間呈良好的線性相關(guān),說(shuō)明結(jié)果可信。

圖2 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的UPLC色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of biogenic amines BAs standards

表3 生物胺的保留時(shí)間、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Retention time, the regression equations and correlation coefficients of biogenic amines

2.2.2 產(chǎn)胺菌的產(chǎn)胺情況

由表4可知,分離和純化出的8株產(chǎn)胺菌都產(chǎn)腐胺、尸胺和酪胺,腐胺生成量在0.68～5.81 mg/L;尸胺生成量在0.53～9.33 mg/L;酪胺生成量在0.45～87.31 mg/L。其中,S1產(chǎn)色胺,S1、S3和S5產(chǎn)亞精胺,所有菌株均不產(chǎn)組胺。梁靜靜等[18]報(bào)道了分離自商品紅腐乳中5種產(chǎn)胺菌(枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、賴(lài)氨酸芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、熱帶芽孢桿菌)的酪胺生成量在11.56～18.22 mg/L,腐胺生產(chǎn)量在11.56～18.22 mg/L。本研究發(fā)現(xiàn)S5(屎腸球菌)產(chǎn)生物胺總量最高,高達(dá)106.34 mg/L。該菌主要產(chǎn)酪胺和苯乙胺,含量分別占產(chǎn)生物胺總量的82.10%和12.68%。值得注意的是,只有該菌產(chǎn)苯乙胺,含量為13.48 mg/L。菌株S5的生物胺檢測(cè)色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 產(chǎn)胺菌S5中生物胺的UPLC色譜圖Fig.3 UPLC chromatogram of biogenic amines in strains S5

表4 八株產(chǎn)胺菌中生物胺含量 單位:mg/LTable 4 Contents of biogenic amines in eight biogenic amine producing strains

此外,屎腸球菌也從火腿、奶酪中分離得到,被證明具有產(chǎn)酪胺的能力[24-25]。JEONG等[26]從醬曲中分離的屎腸球菌在給與前體物質(zhì)氨基酸的培養(yǎng)條件下,能產(chǎn)生高達(dá)3 397.4 mg/L的酪胺,未產(chǎn)生組胺,這與本研究S5的產(chǎn)胺結(jié)果相似。綜上,菌株S5產(chǎn)不同種生物胺的含量存在很大差異,除溫度、NaCl濃度、pH值等環(huán)境因素影響外,還可能與其編碼不同氨基酸脫羧酶的基因有關(guān)[15]。

2.2.3 不同環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌S5生長(zhǎng)與產(chǎn)胺特性的影響

2.2.3.1 不同環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌S5生長(zhǎng)的影響

選取產(chǎn)生物胺水平最高的S5為研究對(duì)象,測(cè)定不同環(huán)境因素對(duì)其生長(zhǎng)活性的影響。結(jié)果表明,35 ℃的環(huán)境對(duì)S5的生長(zhǎng)最有利,而15 ℃低溫則會(huì)抑制S5的生長(zhǎng)(圖4-a)。當(dāng)環(huán)境中的乙醇體積分?jǐn)?shù)<15%時(shí),S5能正常生長(zhǎng),但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高,對(duì)S5的抑制作用越強(qiáng)(圖4-b)。S5在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.5%的氨基酸中吸光度值變化趨勢(shì)相近,表明此濃度范圍的氨基酸對(duì)該菌生長(zhǎng)不產(chǎn)生明顯影響(圖4-c)。而過(guò)高(pH>8.5)和過(guò)低(pH<5.5)的pH環(huán)境都不利于S5的生長(zhǎng)(圖4-d)。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.0%時(shí),可對(duì)S5的生長(zhǎng)產(chǎn)生一些抑制,當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.0%時(shí),該菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制(圖4-e)。

a-溫度;b-乙醇體積分?jǐn)?shù);c-氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù);d-pH值;e-NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下圖同)圖4 不同環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌S5生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different environmental factors on Enterococcus faecium S5 growth

2.2.3.2 溫度對(duì)屎腸球菌S5產(chǎn)胺特性的影響

當(dāng)培養(yǎng)溫度15 ℃時(shí),S5的酪胺生成量很低,為11.44 μg/mL。但隨著溫度持續(xù)升高,總胺生成量也持續(xù)增加,35 ℃時(shí)達(dá)到最高值77.78 μg/mL(圖5-a)。這可能是由于S5在15 ℃低溫環(huán)境下48 h的生長(zhǎng)明顯低于35 ℃下48 h的生長(zhǎng)(圖4-a),導(dǎo)致15 ℃時(shí)S5產(chǎn)胺水平降低。

2.2.3.3 乙醇對(duì)屎腸球菌S5產(chǎn)胺特性的影響

從圖5-b可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～15%時(shí),S5總胺含量從119.52 μg/mL增加到123.39 μg/mL,可能是低濃度的乙醇能提升S5氨基酸脫羧酶的活力,王俊朋等[27]認(rèn)為少量的酒精對(duì)酶活力有促進(jìn)作用。但是,當(dāng)添加的乙醇體積分?jǐn)?shù)>15%時(shí),總胺和酪胺含量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。高濃度乙醇抑制生物胺的產(chǎn)生,可能與其抑制了菌體的生長(zhǎng)有關(guān),因?yàn)镾5在乙醇體積分?jǐn)?shù)>15%時(shí)生長(zhǎng)緩慢(圖4-b)。

2.2.3.4 氨基酸對(duì)屎腸球菌S5產(chǎn)胺特性的影響

圖5-c顯示當(dāng)氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%～0.5%時(shí),S5的生物胺含量呈先增加后減少的趨勢(shì),在氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%時(shí)總胺含量達(dá)到峰值120.17 μg/mL,當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5%時(shí)總胺含量降低至101.56 μg/mL。本研究結(jié)果與梁靜靜等[18]研究的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)胺菌產(chǎn)胺特性的影響趨勢(shì)一致。原因可能與脫羧作用的“臨界點(diǎn)”有關(guān),當(dāng)培養(yǎng)液中的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)>0.3%后,S5的總胺和酪胺含量不增反減,這反映出氨基酸濃度對(duì)S5產(chǎn)胺的有限促進(jìn)作用[28]。

2.2.3.5 pH對(duì)屎腸球菌S5產(chǎn)胺特性的影響

圖5-d顯示出S5合成生物胺的最佳pH在6.5～7.5,峰值pH 6.5的總胺和酪胺含量分別為110.85和105.93 μg/mL。過(guò)低或過(guò)高的pH會(huì)抑制S5氨基酸脫羧酶的活性,減少其產(chǎn)胺量。一定的酸性條件下可以刺激S5酪胺脫羧酶的活性,已有研究證實(shí)酸性條件可誘導(dǎo)編碼酪氨酸脫羧酶(tdcA)和編碼酪氨酸-酪胺反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(tyrP)影響產(chǎn)胺菌酪胺的表達(dá)量[29]。此外,S5在不同pH值條件下的產(chǎn)胺量趨勢(shì),與其在此培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)也基本一致(圖4-d)。

2.2.3.6 NaCl對(duì)屎腸球菌S5產(chǎn)胺特性的影響

NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)<3.0%對(duì)S5的產(chǎn)胺性能影響較小,隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,達(dá)到6.0%～9.0%時(shí),S5的產(chǎn)胺量持續(xù)下降。當(dāng)NaCl濃度為9.0%時(shí),S5產(chǎn)總胺和酪胺量最低,分別為75.88、70.12 μg/mL(圖5-e)。高NaCl濃度主要通過(guò)高濃度的Na+抑制S5酪氨酸脫羧酶活性[30-31],從而影響生物胺的形成。

3 結(jié)論

本研究首次從白方腐乳后發(fā)酵環(huán)節(jié)中分離純化出8株產(chǎn)胺菌,經(jīng)16S rDNA序列鑒定,4株為擬蕈狀芽孢桿菌,其余4株分別為熱帶芽孢桿菌、屎腸球菌、解淀粉芽孢桿菌以及枯草芽孢桿菌。通過(guò)超高效液相色譜技術(shù)對(duì)這8株產(chǎn)胺菌的產(chǎn)胺特性進(jìn)行定性定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株S5(屎腸球菌)產(chǎn)胺能力較強(qiáng)(106.34 mg/L),酪胺產(chǎn)生量高達(dá)87.31 mg/L。對(duì)菌株S5不同環(huán)境因素中的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)胺能力進(jìn)行系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)不同的環(huán)境因素(如溫度、氨基酸、NaCl、乙醇和pH值)對(duì)該菌生長(zhǎng)活性和產(chǎn)胺能力有很大影響。在溫度<15 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)>15%、氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)<0.5%、pH>7.5、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)>6.0%條件下,S5產(chǎn)胺量降低,進(jìn)一步提示腐乳生產(chǎn)過(guò)程中可以通過(guò)對(duì)上述環(huán)境條件的調(diào)節(jié)來(lái)控制生物胺的產(chǎn)生。