羅莉,趙芳*,郝莉花,馮琳琳,王琳麗

1(河南省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)研究院,河南 鄭州,450047)2(河南省食品安全數(shù)據(jù)智能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州,450047)

獸藥被廣泛用于動物疾病的預(yù)防和治療、促進(jìn)動物生長等方面,其種類繁多,抗生素是獸藥殘留分析中最常見的殘留類別[1],一直是食品安全關(guān)注的重點(diǎn)?？股厥且活愑糜跉⑺兰?xì)菌或抑制其生長的藥物[2],主要用于人和動物的疾病治療,也作為促生長劑和亞治療劑長期添加于動物飼料中。各國陸續(xù)出臺相關(guān)條例及檢測標(biāo)準(zhǔn),對多種食品中各類抗生素殘留限量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定,這對現(xiàn)有檢測技術(shù)也是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。在抗生素殘留分析中,磺胺類、喹諾酮類及硝基咪唑類藥物類屬高頻次檢測項(xiàng)目,建立這些藥物殘留的快速篩查分析方法有利于提高日常篩查分析通量,增進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測效能,完善肉品質(zhì)量安全控制的技術(shù)支持體系。

目前傳統(tǒng)的抗生素檢測方法比較常用的方法有HPLC[3-4]、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)[5]、微生物抑菌試驗(yàn)(microbial inhibitions test, MIT)[6]等。HPLC和LC-MS法結(jié)合了色譜的分離能力和質(zhì)譜的定性能力,可對復(fù)雜化合物進(jìn)行更精準(zhǔn)、簡便的定性和定量分析,靈敏度比較高[7],但樣品前處理、操作過程較為繁瑣,檢測時(shí)間長,對實(shí)驗(yàn)操作人員技術(shù)要求較高。MIT 法[6]可操作性非常強(qiáng)、成本較低,但靈敏度低、敏感性差,易受其他抗生素干擾[8]。這些方法存在前處理復(fù)雜,操作技術(shù)性強(qiáng),檢測成本高等缺陷。因此,開發(fā)快速、簡便的抗生素篩查方法具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

抗生素殘留快速篩查方法主要有膠體金免疫層析技術(shù)[9]、傳感器法[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11]、原位直接電離質(zhì)譜等方法。這些方法靈敏度高、操作簡便、反應(yīng)時(shí)間短,可實(shí)現(xiàn)藥物殘留的現(xiàn)場快速定量檢測,但易受人為因素干擾導(dǎo)致假陽性或假陰性,且不適合多種待測物的高通量快速檢測。直接離子化質(zhì)譜或原位直接電離質(zhì)譜,可在大氣壓環(huán)境中實(shí)現(xiàn)原位、直接和快速的樣品分析,無需復(fù)雜的樣品制備過程,并可節(jié)省大量的資源和時(shí)間[12-13]。在各種原位質(zhì)譜電離源中,實(shí)時(shí)直接分析(direct analysis in real time, DART)離子源是一種非表面接觸的熱解析大氣壓電離技術(shù),結(jié)合了等離子體技術(shù)的簡單性和靈敏性,可直接分析固體、液體和氣體[14-17]。DART包含了大氣壓電離源類的軟電離特性,與傳統(tǒng)離子源(如電子轟擊電離等)以及電噴霧電離源相比,不僅具有離子化效率高、靈敏度高、準(zhǔn)分子離子峰豐度高、碎片離子少等優(yōu)點(diǎn),還具有較強(qiáng)抗基質(zhì)干擾能力,實(shí)現(xiàn)樣品的原位、無損、低碳、實(shí)時(shí)、直接和快速分析。使用DART源能夠大幅簡化樣品制備過程,使無樣品制備而直接分析成為可能, 極大地縮短了分析時(shí)間,節(jié)省了人力、物力資源,以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室高通量分析[18-20]。

本研究利用DART離子源串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(triple quadrupole,QQQ)快速篩查豬肉中23種獸藥殘留。通過對豬肉基質(zhì)的溶劑提取和簡單凈化,DART源直接離子化,采用三重四極桿質(zhì)譜分析測定,建立這些藥物殘留的快速篩查分析方法,該方法有利于提高日常篩查分析通量,增進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測效能,提升肉品質(zhì)量安全控制,具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:豬肉,市售;乙腈(色譜純),德國Merck公司;5982-0032萃取鹽包、5982-4950凈化包(含50 mg乙二胺-N-丙基硅烷、150 mg C18EC和900 mg Na2SO4)、0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,美國Agilent公司;PRiME HLB固相萃取小柱,美國Waters公司。

標(biāo)準(zhǔn)品:磺胺類(磺胺喹惡啉、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑),喹諾酮類(環(huán)丙沙星、達(dá)諾沙星、雙氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、奧比沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星),硝基咪唑類(甲硝唑、羥基甲硝唑、洛硝達(dá)唑),100 μg/mL,天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E電子天平,METTLER TOLEDO;Milli-Q去離子水發(fā)生器,美國Millipore公司;QL 866漩渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造公司;SB-25-12DT超聲波發(fā)生器,寧波新芝生物科技有限公司;Velocity 18R Pro 離心機(jī),澳大利亞Dynamica公司;N-Evap 氮吹儀,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

AB 4500三重四級桿液質(zhì)儀,美國AB SCIEX公司;DART SVP離子源、樣品傳動軌道、進(jìn)樣玻璃棒,美國Ion- Sense公司;隔膜泵,德國Vacuubrand公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

市售豬肉均質(zhì)勻漿后制成豬肉空白樣品。

直接提取法:稱取豬肉樣品2.5 g試樣于50 mL塑料離心管中,加入10 mL乙腈,劇烈振蕩2 min。超聲波提取20 min、10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液,40 ℃下氮吹至干。加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)20%乙腈水溶液復(fù)溶,渦旋30 s,超聲波處理5 min充分溶解,過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,得到基質(zhì)提取液,待測。

分散固相萃取凈化法:稱取豬肉樣品2.5 g試樣于50 mL塑料離心管中,加入10 mL乙腈,劇烈振蕩2 min。加入5 g萃取鹽包,渦旋, 10 000 r/min離心5 min。取6 mL上清液于內(nèi)含凈化包的凈化管中,渦旋30 s,4 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液,40 ℃氮吹至干。加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)20%乙腈水溶液復(fù)溶,渦旋30 s,超聲波處理5 min充分溶解,過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,得到凈化包提取液,待測。

固相萃取柱凈化法:稱取豬肉樣品2.5 g試樣于50 mL塑料離心管中,加10 mL乙腈,劇烈振蕩2 min,10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至PRiME HLB凈化小柱上,洗脫收集2 mL上清液,40 ℃氮吹至干。加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)20%乙腈水復(fù)溶,渦旋30 s,超聲波處理5 min充分溶解,過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,得到凈化柱提取液,待測。

1.3.2 儀器參數(shù)

質(zhì)譜條件:掃描模式為全掃描模式;氣簾氣:20 psi;碰撞:Medium;離子源溫度250 ℃;碰撞室脫離電壓6 V;碰撞室入口電壓10 V;DART離子源條件:正離子模式;解離氣體溫度350 ℃;柵網(wǎng)電極電壓 200 V;樣品軌道傳動速度1.0 mm/s;隔膜泵壓力12.0 kPa;工作氣體為高純He(99.999%),預(yù)備氣體為高純度N2(99.999%);進(jìn)樣裝置為玻璃棒進(jìn)樣;用移液槍準(zhǔn)確吸取液體2 μL于玻璃棒中,He打在玻璃棒上,離子化之后進(jìn)質(zhì)譜。待測化合物定量離子對、定性離子對及碰撞能量見表1。

表1 待測化合物定量離子對、定性離子對及碰撞能量Table 1 Quantitative ion pair, qualifier ion pair, and collision energy of the analyte compound

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲備液:分別量取1 mL磺胺喹惡啉、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑于10 mL容量瓶中,用乙腈定容并混勻,配置成10 μg/mL磺胺標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲備液。同樣的方法配置喹諾酮類和硝基咪唑類10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)混合中間液:取1 mL標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲備液于10 mL容量瓶中, 用乙腈定容并混勻,配置成1 000 μg/L中間液。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:取10、20、50、80、100 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL,分別將3類混標(biāo)配置成10、20、50、80、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)濃度系列工作液。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

取配置好的系列工作液進(jìn)行測定,將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別測定定量離子相應(yīng)的豐度,以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo),以豐度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,外標(biāo)法定量,數(shù)據(jù)采用Excel處理。前處理過程總基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)計(jì)算參考文獻(xiàn)[19]的方法,ME按公式(1)計(jì)算。

ME/%=B/A×100

(1)

式中:ME,前處理過程總基質(zhì)效應(yīng),%;A,目標(biāo)化合物在純?nèi)軇┗|(zhì)中檢測的峰面積;B,目標(biāo)化合物在陰性樣品處理液基質(zhì)中檢測的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理凈化效果分析

空白豬肉樣品按照1.3.1 節(jié)得到基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液。取100 μL中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL, 按照1.3.2節(jié)對上述3種基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行測定, 每個(gè)樣品測定4次, 最終結(jié)果以平均值計(jì), 并按照1.3.4 節(jié)計(jì)算ME值, 計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 不同凈化方式的ME值Table 2 ME value of different purification methods

圖1、圖2、圖3和圖4分別為標(biāo)準(zhǔn)濃度系列工作液在乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液和凈化柱提取液中的總離子流圖。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)濃度系列工作液在乙腈溶液中總離子流圖(測定4次)Fig.1 Total ion chromatogram of series standard concentration working solution in acetonitrile

圖2 標(biāo)準(zhǔn)濃度系列工作液在基質(zhì)提取液中總離子流圖(測定4次)Fig.2 Total ion chromatogram of series standard concentration working solution in matrix extract

基質(zhì)效應(yīng)ME值可以反應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)的程度。通常ME值>100%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME值<100%為基質(zhì)減弱效應(yīng),ME值=100%則不產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。從表2中可以看出,所有獸藥化合物在凈化柱提取液和凈化包提取液中的ME值均大于在基質(zhì)提取液中的ME值,這說明了基質(zhì)采取2種方法凈化都能夠提高M(jìn)E值,即凈化減少了雜質(zhì)的含量,減小雜質(zhì)與獸藥化合物競爭離子化,因而提高了獸藥化合物的離子化效率。此外,大多數(shù)獸藥化合物在凈化柱提取液中ME值大于凈化包提取液中的ME值,這說明了凈化柱的凈化效果優(yōu)于凈化包,通過凈化柱能夠除掉更多的雜質(zhì),提高了獸藥化合物的離子化效率。

在基質(zhì)提取液中(見表2),19種獸藥化合物(磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、雙氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、奧比沙星、司帕沙星、甲硝唑、羥基甲硝唑、洛硝達(dá)唑)在基質(zhì)中的ME值<100%,4種獸藥化合物(環(huán)丙沙星、達(dá)諾沙星、培氟沙星、沙拉沙星)在基質(zhì)中的ME值>100%。獸藥化合物在基質(zhì)中的ME值<100%,說明了雜質(zhì)與獸藥化合物競爭離子化,因而降低了獸藥化合物的離子化效率。獸藥化合物在基質(zhì)中的ME值>100%,可能的原因是雜質(zhì)與獸藥化合物離子化后,在離子源與質(zhì)譜間的通道被吸附,雜質(zhì)與獸藥化合物競爭吸附,從而抑制了獸藥化合物在通道的損失,增加了獸藥化合物通路,提高了響應(yīng)值。當(dāng)競爭吸附大于競爭離子化的作用,宏觀表現(xiàn)為ME值>100%。

如表2所示,凈化柱提取液中,只有10種喹諾酮ME值>100%;凈化包提取液中,9種喹諾酮ME值>100%(雙氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)諾沙星、培氟沙星、沙拉沙星)。這一方面可能是由于不同前處理方式的凈化效果和去除雜質(zhì)種類不一致,導(dǎo)致目標(biāo)化合物受到的基質(zhì)干擾程度存在差異。另一方面可能是喹諾酮類化合物基本骨架均為氮雜雙并環(huán),但不同化合物的分子和空間結(jié)構(gòu)存在一定差異,可能導(dǎo)致其受到基質(zhì)影響不同。

2.2 獸藥分子結(jié)構(gòu)與基質(zhì)效應(yīng)特性分析

獸藥分子結(jié)構(gòu)與原位電離的基質(zhì)效應(yīng)包含了2個(gè)層面,競爭吸附和競爭離子化。從圖5可知,系統(tǒng)聚類分析譜系圖中橫坐標(biāo)表示臨界值,臨界值越小,則表明相似度越高。該圖將23種獸藥化合物依據(jù)基質(zhì)提取液、凈化柱提取液、凈化包提取液3種條件下ME值綜合判斷,分為兩大類,其中一類是喹諾酮類,另一類是磺胺硝基咪唑類。喹諾酮類競爭吸附效應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢,磺胺硝基咪唑類競爭離子化效應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢。

圖5 23種獸藥與其ME值的聚類分析譜系圖Fig.5 Cluster analysis pedigree of 23 kinds of veterinary drugs and their ME values

2.3 檢出限

空白豬肉樣品按照1.3.1節(jié)得到基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液。取10 μL中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL,按照1.3.2節(jié)對上述3種基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行測定,每個(gè)樣品測定4次,最終結(jié)果以平均值計(jì),另取空白基質(zhì)檢測,各化合物定量離子對響應(yīng)結(jié)果見表3。

表3 23種獸藥檢出限加標(biāo)及空白基質(zhì)定量離子對響應(yīng)Table 3 Limit spike and blank matrix quantitative transition responses of 23 kinds of veterinary drugs

從表3可以看出,10種磺胺、10種喹諾酮、3種硝基咪唑類藥物在10 μg/L均有響應(yīng),在0 μg/L時(shí), 基質(zhì)提取液、凈化柱提取液和凈化包提取液均沒有響應(yīng)。因此,使用上述任何一種前處理方法,23種獸藥化合物均能夠在10 μg/L檢出。其中,磺胺類、喹諾酮類和硝基咪唑類化合物的基質(zhì)提取液經(jīng)過凈化柱或凈化包凈化后,響應(yīng)都有不同程度的提升,說明凈化能夠明顯提高這23種獸藥化合物的響應(yīng)。如果考慮到檢測成本和檢測效率,可以選擇凈化包作為23種獸藥化合物的凈化方法。

2.4 精密度

取10、20、50、80、100 μL中間液分別用乙腈、基質(zhì)提取液、凈化包提取液、凈化柱提取液定容至1 mL,配置10、20、50、80、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)濃度系列,按照1.3.2節(jié)對上述3種基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行測定4次,最終結(jié)果以平均值計(jì),精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)計(jì),23種獸殘的檢測精密度結(jié)果見表4。

表4 23種獸藥檢測精密度(RSD)Table 4 Detection precision (RSD) of 23 kinds of veterinary drugs

研究分別測定了磺胺類、喹諾酮類和硝基咪唑類獸藥。如表4所示,獸藥殘留在不同基質(zhì)中RSD值最低36.25%,最高112.36%,差異較大,RSD平均值63.49%。基質(zhì)提取液的RSD平均值為66.82%,基質(zhì)提取液經(jīng)過凈化后,RSD平均值由81.23%降低至48.50%(凈化柱)和57.42%(凈化包),說明凈化后重現(xiàn)性明顯提高。

磺胺類、喹諾酮類和硝基咪唑類獸藥相比,喹諾酮類RSD平均值94.61%,明顯高于磺胺類38.42%和硝基咪唑類57.45%,并且單獨(dú)比較每一種提取液,喹諾酮類RSD仍高于磺胺類和硝基咪唑類。造成這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是喹諾酮類具有明顯的吸附效應(yīng),喹諾酮的吸附效應(yīng)增強(qiáng)了信號,提高了響應(yīng)值,但重現(xiàn)性變差。

因此采用原位質(zhì)譜技術(shù)檢測肉品中喹諾酮類時(shí),凈化柱提取液RSD明顯低于其他基質(zhì)的RSD,因此在檢測肉品中喹諾酮時(shí),采用凈化柱凈化,能夠獲得較好的精密度。對于磺胺類和硝基咪唑類,提高凈化程度對精密度的改善不明顯,采用凈化包凈化即可。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了肉品中獸藥殘留的高通量、快速、準(zhǔn)確檢測方法。以豬肉為基質(zhì),通過原位電離技術(shù)實(shí)現(xiàn)檢樣中23種獸藥的多獸殘快速測定,實(shí)現(xiàn)肉品中多獸藥殘留檢測的突破。研究中通過比較基質(zhì)提取液、凈化柱提取液、凈化包提取液3種條件下基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行綜合判斷,發(fā)現(xiàn)獸藥分子結(jié)構(gòu)與原位電離的基質(zhì)效應(yīng)包含了競爭吸附和競爭離子化兩個(gè)方面。喹諾酮類競爭吸附效應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢,磺胺硝基咪唑類競爭離子化效應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢。DART-QQQ在檢測上無論采用固相萃取柱凈化或者凈化包凈化,或不采取凈化方式,23種化合物在10 μg/L均能夠正常檢出,其中,磺胺類、喹諾酮類和硝基咪唑類化合物的基質(zhì)提取液經(jīng)過凈化柱或凈化包凈化后,能明顯提高這23種獸藥化合物的響應(yīng)。采用原位質(zhì)譜技術(shù)檢測肉品中喹諾酮類時(shí),凈化柱提取液RSD明顯低于其他基質(zhì)的RSD,因此在檢測肉品中喹諾酮類時(shí),采用凈化柱凈化,能夠獲得較好的精密度。對于磺胺類和硝基咪唑類,提高凈化程度對精密度的改善不明顯。

本文建立的方法實(shí)現(xiàn)了磺胺類、喹諾酮類和硝基咪唑類三大類23種化合物同時(shí)快速測定,并且DART-QQQ檢測能夠達(dá)到與GB/T 21316—2007《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、SN/T 2624—2010 《動物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》和GB/T 21312—2007《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》一樣的靈敏度級別。此外,采用DART-QQQ檢測三大類化合物節(jié)省了大量的檢測時(shí)間,單次樣品測定時(shí)間小于 30 s,可以大幅縮短分析周期。傳統(tǒng)HPLC檢測需要較長的色譜分離過程才能將其分開,單次進(jìn)樣分析一般需要 10～40 min,HPLC-MS/MS檢測也需10 min左右。

由于獸藥種類多,衍生物復(fù)雜,本研究領(lǐng)域仍有更多的化合物檢測方法需要建立,通過這三大類23種獸殘的高通量、快速、準(zhǔn)確測定,該方法具有通用性及可擴(kuò)展性。另一方面,獸殘?jiān)毁|(zhì)譜檢測的精密度遜于液相質(zhì)譜,因此對篩選出的不合格樣品仍需要液相質(zhì)譜進(jìn)行檢驗(yàn)。但不可否認(rèn)原位質(zhì)譜在獸藥殘留的高通量、快速、準(zhǔn)確檢測優(yōu)勢。因此,采用DART-QQQ檢測豬肉中23種獸藥殘留,作為快檢和對市售不合格豬肉的篩查,方法準(zhǔn)確性、靈敏度好,并且能夠擴(kuò)展更多種類獸藥高通量篩查,在多獸藥高通量快檢領(lǐng)域有至關(guān)重要的作用。