嚴紅光,羅配琴,林莉,李麗,陳壁,周敏,潘票

1(凱里學院 大健康學院,貴州 凱里,556011)2(貴州茅臺(集團)生態(tài)農業(yè)產業(yè)發(fā)展有限公司,貴州 丹寨,557501)

藍莓屬于杜鵑花科(Ericaeae)越橘屬(Vaccimium)木本灌木,原產北美,目前已人工引種至亞洲、歐洲、南美洲、澳洲[1]。2018年全球藍莓產量達到91.4萬t[2]。我國藍莓主要引種在貴州、山東、吉林等十余個省份,2020年產量已迅速增長至34.72萬t[3]。藍莓果實富含花青素、多酚、維生素E等抗氧化活性物質[4],糖酸比適宜,適合加工成果酒。消費者偏好研究表明,藍莓質量評價與風味評分相關性高[5]。藍莓酒風味特征主要影響因素包括:原料品種[6-8]、種植地風土條件、園藝管理措施、釀造菌種[9]、釀造工藝[10-12]等。

藍莓品種顯著影響其果酒風味特征。LIU等[6]利用湖北黃陂種植的南高種群2個藍莓品種分別發(fā)酵果酒,發(fā)現芳樟醇等9種萜類化合物含量差異顯著,并影響酒的品種香。張杰[4]利用安徽合肥種植的南高和兔眼種群共6個藍莓品種釀酒后,發(fā)現9-癸酸烯乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等酯類化合物含量差異顯著,并影響酒的品種香。不同品種藍莓果實可同化氮源水平不同,導致發(fā)酵果酒后高級醇、酯以及苯衍生物含量不同,也影響酒的品種香[6,8]。劉國華等[7]利用貴州麻江種植的兔眼種群8個藍莓品種釀酒后,根據GC-MS檢出化合物香氣類型,發(fā)現燦爛藍莓酒以植物香為特征,區(qū)別于其他7種以花果香為特征的藍莓酒。包括麻江在內的凱里地區(qū)是“中國藍莓酒之鄉(xiāng)”,栽培的藍莓品種以適應當地喀斯特地貌和氣候條件的兔眼種群藍莓為主[7]。但是相關品種藍莓釀造果酒后,其特征性風味物質的報道仍較少,需要進一步研究。

隨著頂空固相微萃取與氣相色譜聯用(headspace solid phase microextraction-gas chromatography,HS-SPME-GC)[13]、質子轉移反應飛行時間質譜(Proton tromsfer reaction time of flight mass spectrometry,PTR-ToF-MS)[14]、氣相色譜嗅聞測量(gas chromatography olfactometry,GC-O)[15]、電子鼻[16]等分析設備的進步,從藍莓果實中已經檢出100多種揮發(fā)性化合物。經歷百余年人工繁育,藍莓具有復雜的遺傳背景和繁多的雜交品種。目前藍莓品種影響果酒風味特征的認識仍然有待深入[17]。由于頂空氣相色譜離子遷移譜法(headspace solid-gas chromatography-ion mobility spectrum,HS-GC-IMS)具有樣品前處理簡單、充分保持樣品風味特征、分辨率高等特點,目前已經在米酸湯[18]、藍莓酒[9]等發(fā)酵食品風味特征研究方面取得較好應用。

本文選擇栽培于貴州麻江的屬于兔眼種群的園藍、杰兔、頂峰3種有機藍莓釀造果酒。利用GC-MS和GC-IMS協(xié)同分析風味物質成分。研究結果將加深認識藍莓果酒風味物質特征,有利于后續(xù)適宜釀酒品種篩選工作。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

商業(yè)活性釀酒干酵母Angel RV171,湖北安琪酵母股份有限公司;偏重亞硫酸鉀,法國拉曼公司;蔗糖,市售;異戊醇(99.8%)、異辛醇(99.5%)、仲辛醇(99.5%)、己酸(99.5%)、乙酸(99.8%)、辛酸(99.5%)標準品,上海阿拉丁生化科技股份公司;正構烷烴C7-C40標樣,美國o2si公司。

帶氣囊壓榨裝置的果酒小型生產線,河北博釀釀酒設備有限公司;配備頂空自動進樣裝置的FlavourSpec?風味測定儀,德國G.A.S.公司;7890A-5975C氣質譜聯用儀,安捷倫科技(中國)有限公司;固相微萃取取樣操作平臺、固相微萃取纖維頭手動進樣手柄、長度為1 cm涂層為50/30 μm厚度的二乙烯基苯(DVB)/羧基(CAR)/聚二甲基硅氧烷(PDMS)的固相微萃取纖維頭,美國 Supleco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀酒原料選擇

杰兔、頂峰成熟果實于2022年7月8日,園藍果實于2022年7月23日采收于貴州麻江龍山鎮(zhèn)中國南方藍莓繁育基地某農業(yè)科技公司大型種植園(26.42 °N,107.74 °E)。種植基地屬中亞熱帶濕潤季風氣候,海拔650 m,年平均降水量1 225 mm,年平均氣溫15.9 ℃,年平均日照時數1 250 h,年平均≤7.2 ℃冷積溫時間600 h。種植基地土層深度80 mm,硅鐵質酸性黃壤,土壤pH值4.9。選擇5年生長勢一致的健壯植株,株行距為1.5 m×2 m,園藝管理措施一致。每個品種隨機手工摘取果皮完全著色、可溶性固形物>12%的成熟果實135 kg。采收后的果實在20 ℃空調房冷卻2 h,去除病腐爛果,隨后迅速運回實驗室立即進行果酒發(fā)酵處理。

1.2.2 樣酒制備

參考課題組前期方法進行[9],略有修改。單品種藍莓果實,于0.3 MPa壓力下氣囊壓榨取汁,榨汁立即加入偏重亞硫酸鉀50 mg/L,6 ℃靜置8 h后,按75%裝罐量泵入清汁至30 L發(fā)酵罐,加入(NH4)2HPO4150 mg/L,利用蔗糖調配含糖量至220 g/L,利用KHCO3調整pH值至3.3,加入0.1%活化好的干酵母在22 ℃控溫完成酒精發(fā)酵,隨后加入偏重亞硫酸鉀40 mg/L,15 ℃下陳釀30 d后取樣。樣酒于-18 ℃保存待測。園藍、杰兔、頂峰3種藍莓釀造的果酒依次編號為YL、JT和DF。重復試驗3次。

1.2.3 樣酒基本理化指標檢測

按照GB/T 15038——2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定樣酒的酒精度、總糖、總酸、揮發(fā)酸、干浸出物、總SO2和游離SO2含量。

1.2.4 HS-SPME-GC-MS測定樣酒揮發(fā)性風味物質

量取8 mL酒樣至15 mL頂空瓶中,加入1.75 g NaCl以及4.095 g/L仲辛醇內標溶液8 μL,200 r/min 40 ℃平衡15 min,隨后用老化好的萃取頭頂空萃取25 min,GC進樣口250 ℃解吸8 min。

GC條件:HP-INNOWax色譜柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm, 美國J&W公司)。進樣口溫度250 ℃,不分流進樣,載氣為1.0 mL/min高純氦氣。初始溫度40 ℃,維持3 min;4～54 min,勻速升至150 ℃;54～62 min,勻速升至230 ℃,維持5 min。

MS條件:接口溫度280 ℃,EI電離源,離子源溫度230 ℃、電壓70 eV,掃描范圍m/z35～500。

1.2.5 HS-GC-IMS測定樣酒揮發(fā)性風味物質

參考課題組前期試驗方法進行[18]。量取1 mL酒樣至20 mL頂空瓶中,500 r/min 45 ℃平衡15 min。進樣體積100 μL,進樣溫度50 ℃。色譜柱為WAX(30 m×0.53 mm ID)。載氣/漂移氣均為高純氮氣,漂移氣150 mL/min維持不變;載氣初流速2 mL/min,維持2 min;2～20 min,載氣提升至100 mL/min,維持10 min。IMS溫度45 ℃,分析時間30 min。

1.2.6 樣酒感官評價

按照GB/T 16291.1—2012《選拔、培訓與管理評價員一般導則 第1部分:優(yōu)選評價員》方法招募和篩選在校食品專業(yè)本科生,經強化訓練后建立10人評價小組(男女生各5名)。按照GB/T 13868—2009《建立感官分析實驗室的一般導則》方法優(yōu)化設置感官評價實驗環(huán)境。參考楊潔等[19]的方法,按照定量描述分析方法建立出6個藍莓酒風味特征屬性(果香、醇香、花香、草香、脂香、化學味),并使用0到5標度進行描述(0沒有感覺、1弱、2稍弱、3中等、4稍強、5強)。藍莓樣酒完全隨機編碼。評價員品嘗每個樣酒前均休息1 min,獨立完成評價任務。評價結果為所有評分的均值。

1.3 數據處理

結合標準品、保留指數(retention index,RI)值,利用GC-MS配置的NIST 17.0數據庫比對物質峰質譜信息,進行定性分析。參考課題組前期建立方法[18],根據GC-MS定性出的物質峰及內標仲辛醇峰面積的比值,計算其物質濃度,進行半定量分析。根據參考文獻中的閾值,計算其物質濃度與閾值比值,進行氣味活度值(odor activity value, OAV)分析。利用GC-IMS配置的NIST和IMS數據庫對檢出的揮發(fā)性風味物質進行定性分析,Gallery Plot插件進行不同樣品譜圖差異比較。利用R語言4.1.3繪制主成分圖。

2 結果與分析

2.1 三種藍莓果酒基本理化指標分析

從表1可見,3種藍莓酒發(fā)酵后酒精度(體積分數)為11.8%～12.2%,符合GB/T 32783—2016《藍莓酒》限量標準(≥5%);總糖含量為4.1～6.2 g/L,3種藍莓樣酒為半干型;總酸含量為7.7～8.4 g/L,符合限量標準(≥4.0 g/L);揮發(fā)酸含量為0.3～0.6 g/L,符合限量標準(≤1.2 g/L);干浸出物含量為18.6～19.7 g/L,符合限量標準(≥16.0 g/L)。貴州麻江龍山鎮(zhèn)3種有機藍莓釀造的果酒符合藍莓酒國家標準。

表1 三種藍莓發(fā)酵果酒理化指標(n=3)Table 1 Physiochemical parameters of three varieties of fermented blueberry wine (n=3)

2.2 三種藍莓果酒風味物質HS-GC-IMS分析

根據揮發(fā)性風味物質IMS保留指數、NIST和IMS數據庫定性結果,使用Gallery Plot插件構建出指紋圖譜,結果見圖1。由于數據庫正在完善,圖1中5種揮發(fā)性物質未能識別,分別以數字1～5表示。其他檢出風味物質分別編號為6～40。從圖1可見,3種藍莓果酒揮發(fā)性風味物質組分特征差異明顯,主要為酯類14種(A區(qū)域),醇類7種(B區(qū)域),酸類4種(C區(qū)域),酮類6種,醛類3種。從圖1可見,JT樣品乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正己醇、2,3-戊二酮、丙酮、2-庚酮、異戊酸相對含量較高。YL樣品中乙酸丙酯、丙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、正丙醇、異丙醇、乙偶姻、2-戊酮、乙酸、丙酸相對含量較高。DF樣品中丁酸乙酯、異丁酸乙酯、己酸乙酯及其二聚體、辛酸乙酯、異丁醛相對含量較高。YUAN等[8]發(fā)現藍莓酒發(fā)酵過程中,酵母通過葡萄糖的合成代謝途徑或相應的氨基酸分解代謝途徑來合成大量酯類、醇類風味物質。

圖1 三種藍莓釀造果酒揮發(fā)性物質指紋圖譜Fig.1 Volatile substance fingerprints of three varieties of fermented blueberry wine注:樣酒編號為縱坐標,風味物質編號為橫坐標;每一橫行代表一個藍莓樣酒選取的全部風味物質信號峰,每一縱列代表相同風味物質在不同藍莓樣酒中的信號峰;物質峰顏色越深則相對含量越大。

2.3 三種藍莓果酒風味物質HS-SPME-GC-MS分析

藍莓果酒揮發(fā)性風味物質成分HS-SPME-GC-MS定性和半定量分析結果見表2。GC-MS條件下3種藍莓樣酒檢出17種酯類、7種醇類、4種酸類、3種酮類、1種萜烯類、3種雜環(huán)類,共35種揮發(fā)性風味物質成分。其中與圖1數字編號相同的15種化合物表示同一種物質,為2種檢測方法共檢出。GC-MS檢出的揮發(fā)性風味物質以酯類、醇類為主,以及少量酮類、酸類物質,與上文GC-IMS檢測結果一致。從表2可見,與YL、DF兩種樣酒相比,只在JT樣酒中檢出的風味物質有9種:己酸甲酯、乙酸己酯、苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯、乙酸異丁酯、3-己烯-1-醇、異戊酸、乙酸、2-莰烯。此外,JT樣酒中另有14種揮發(fā)性風味物質相對含量較高:己酸甲酯、乙酸己酯、苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯、乙酸異戊酯、3-甲基丁酸乙酯、3-己烯-1-醇、異辛醇、異戊醇、苯乙醇、己酸、異戊酸、α-紫羅酮、二叔丁基苯酚。與劉國華等[7]研究結果一致,即JT藍莓酒、酯類、醇類化合物種類最多。

表2 三種藍莓果實釀造果酒樣品揮發(fā)性物質成分含量(n=3)Table 2 Volatile content of three varieties of fermented blueberry wine (n=3)

在JT樣酒中,檢出高含量的乙酸乙酯。魏銘等[17]利用不同酵母菌種發(fā)酵相同品種藍莓,乙酸乙酯含量接近。但FARNETI等[14]研究發(fā)現,乙酸乙酯在部分兔眼、南高種群藍莓果實成熟階段迅速形成,參與構成品種香氣特征。只在JT樣酒中檢出的水楊酸甲酯,被報道為藍莓果實的特征性香氣成分[3]。目前報道的藍莓原料果實中其他酯類特征香氣相對較少,主要包括:乙酸己酯[13]、2-甲基丁酸乙酯[13]、3-甲基丁酸乙酯[15]、以及綠色果實階段形成的苯甲酸乙酯[14]等。FARNETI等[14]研究發(fā)現,雖然藍莓果實中酯類物質含量少于醛類、萜類、酮類等物質,但也參與構成藍莓特征性品種香。

3種藍莓酒中,均檢出較高含量的正己醇、異戊醇、異丁醇和苯乙醇,這可能來源于酵母菌酒精發(fā)酵代謝副產物,構成藍莓果酒發(fā)酵香[6]。JT樣酒中檢出的3-己烯-1-醇以及YL和DF樣酒中檢出的α-松油醇則被認為與藍莓品種香氣特征有關[8,13,15]。3種藍莓樣酒都檢出辛酸、己酸。辛酸、己酸在藍莓綠果階段即大量形成并保持穩(wěn)定,參與構成品種香氣特征[1,14]。在YL樣酒中,檢出較高含量的具有花香、奶酪香特征[5,15]的2-庚酮、具有果香、花香、藍莓香特征[15]的2-壬酮。2-庚酮、2-壬酮在藍莓綠果階段即大量形成,但不同藍莓品種后期代謝降解程度差異顯著[1,5,14]。

藍莓果酒揮發(fā)性物質對其風味貢獻程度與其物質含量、閾值密切相關,據此可以計算出各揮發(fā)性風味物質OAV。由表2數據計算可知,3種藍莓樣酒中OAV值最大的4種揮發(fā)性化合物均為酯類化合物,依次為:乙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯。劉方恬等[11]、魏銘等[17]利用藍莓釀造的果酒中,乙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯均為主要揮發(fā)性風味物質,但是未檢出3-甲基丁酸乙酯。FORNEY等[15]研究認為3-甲基丁酸乙酯主要來源于部分高叢種群藍莓果實,參與構成藍莓品種香氣特征。

維恩圖分析可以直觀反映不同品種藍莓釀酒后共有及特有風味成分。對OAV>1的特征風味成分數量繪制韋恩圖,結果見圖2。3種藍莓樣酒中OAV>1的特征風味成分數量依次為:JT(19種)>YL(17種)>DF(14種),JT樣酒可能擁有更加馥郁的風味特征。3種藍莓樣酒中,JT特有的OAV>1的風味成分種類相對最多,為6種,其中乙酸己酯[13]、苯甲酸乙酯[14]、水楊酸甲酯[3]、3-己烯-1-醇[15]均被認為與藍莓原料品種香氣特征有關。YL樣酒中特有的2-庚酮和2-壬酮則被認為能夠表現出藍莓原料品種風味特征[5,14]。3種藍莓樣酒共有的10種風味成分中,3-甲基丁酸乙酯[15]被報道與藍莓原料品種風味特征相關,乙酸乙酯與藍莓原料品種風味[14]及酒精發(fā)酵產風味物質[17]均有關,其他7種酯類和醇類風味化合物,包括辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、正己醇、異戊醇、苯乙醇可能與藍莓酒酒精發(fā)酵產風味物質有關[7-9]。

圖2 藍莓果酒OAV>1的風味物質韋恩圖Fig.2 Venn diagram of volatile substances based on OAV>1 in fermented blueberry wine

2.4 三種藍莓果酒風味特征及其物質差異分析

對3種藍莓果酒感官評價結果繪制雷達圖(圖3),3種藍莓果酒均表現出較強的果香和醇香,稍弱的花香及弱的草香、脂香、化學味風味特征。JT樣酒果香和草香相對最濃郁,YL樣酒醇香和脂香相對最濃郁,DF樣酒花香、化學味特征相對最濃郁。相同釀酒菌種和發(fā)酵工藝條件下,隨著釀酒原料品種不同,藍莓果酒風味特征形成具有較大差異[6-7]。

圖3 藍莓果酒感官評價圖Fig.3 Sensory evaluation of fermented blueberry wine

深入研究GC-IMS結果,并根據化合物信號強度進行主成分分析(圖4-a),PC1(50.296%)和 PC2(23.237%)累積方差貢獻率為73.533%,圖4-a中3種藍莓樣酒獲得有效區(qū)分,表明藍莓品種對藍莓酒整體香氣產生影響。第一主成分(PC1)能夠將YL與另外2種藍莓樣酒區(qū)分。乙酸丙酯、丙酸乙酯、異戊酸乙酯、異丙醇、正丙醇、乙酸、丙酸、2-戊酮、丙酮等風味物質對PC1正端貢獻較大。第二主成分(PC2)能夠將另外2種樣酒DF與JT區(qū)分。2,3-戊二酮、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯等對PC2正端貢獻較大;異丁酸乙酯、辛酸乙酯、異丁醇等對PC2負端貢獻較大。

a-GC-IMS;b-GC-MS圖4 藍莓果酒GC-IMS和GC-MS檢出風味物質主成分分析Fig.4 PCA results of volatile aroma compounds identified and quantified by GC-IMS and GC-MS in blueberry wine注:圖4中數值編號與圖1和表2中化合物編號一致。

對OAV>1的揮發(fā)性化合物的SPME-GC-MS數據進行主成分分析(圖4-b),PC1(60.54%)和PC2(36.492%)累積方差貢獻率為97.032%,圖4-b中3種藍莓樣酒獲得有效區(qū)分。PC1能夠將JT與另外2種藍莓樣酒區(qū)分。2-庚酮、2-壬酮、鄰異丙基甲苯、2-甲基丁酸乙酯、正己醇等風味物質對PC1正端貢獻較大。PC2能夠將另外2種樣酒DF與YL區(qū)分。3-己烯-1-醇、水楊酸甲酯、苯甲酸乙酯、乙酸己酯、己酸甲酯、異戊酸、α-紫羅酮、乙酸異戊酯等風味物質對PC2正端貢獻較大。乙酸香葉酯、糠醛、丁酸乙酯對PC2負端貢獻較大。

圖4-a中大量揮發(fā)性風味物質集中在圖中心位置。圖4-b中大量揮發(fā)性風味物質位于PC1和PC2的正負兩端。這可能是因為GC-IMS對低含量揮發(fā)性風味物質較GC-MS敏感[18],且圖4-b中選擇對OAV>1的揮發(fā)性化合物進行的主成分載荷因子分析。

3 結論

為研究不同藍莓品種釀造果酒風味物質特征,利用HS-GC-IMS以及HS-SPME-GC-MS法分別進行揮發(fā)性風味物質分離鑒定。采用HS-SPME-GC-MS技術共檢出35種揮發(fā)性風味物質。其中JT、YL、DF樣酒分別檢出27、24、20種物質。采用HS-GC-IMS技術檢出35種揮發(fā)性物質組分,其中15種揮發(fā)性物質組分與GC-MS鑒定結果一致。GC-IMS指紋圖譜、GC-MS結果進行的韋恩圖分析、感官評價以及主成分分析結果均表明3種藍莓果酒存在一定的風味特征差異。3種藍莓果酒檢出的風味物質中,水楊酸甲酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、苯甲酸乙酯、3-己烯-1-醇、α-松油醇、辛酸、己酸、2-庚酮、2-壬酮可能與藍莓品種風味有關,乙酸乙酯與藍莓原料品種風味及酒精發(fā)酵產風味物質均有關,辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、正己醇、異戊醇、苯乙醇可能與酒精發(fā)酵產風味物質有關。采用HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS方法協(xié)同分析,獲得了更加全面的藍莓酒揮發(fā)性風味物質研究結果。下一步需要繼續(xù)研究不同風土條件和園藝管理措施對相同品種藍莓釀酒品質特征的影響。