陳穎慧 馮奕源 馮煒琦 吳逸卓 魯亞南 于昱

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心血管發(fā)育與再生醫(yī)學(xué)研究所,上海 200092;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,上海 200092;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒心臟中心,上海 200092)

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是人類最常見的出生缺陷[1],每1 000例新生兒中出現(xiàn)8～12例[2-3],其中約30%屬于危重CHD,需在嬰兒期干預(yù),否則易導(dǎo)致急性死亡[4]。CHD包括胎兒發(fā)育過程中發(fā)生的心臟和大血管結(jié)構(gòu)異常[5],其中新生兒血管解剖結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,診斷難度高,易發(fā)生誤診或漏診。血管結(jié)構(gòu)異常的CHD常導(dǎo)致無法供給全身足夠的氧合血液,臨床表現(xiàn)為癥狀迅速進(jìn)展的致命發(fā)紺型,常伴呼吸衰竭和心力衰竭,需早期手術(shù)治療,部分疾病如不接受適當(dāng)?shù)母深A(yù),患者在出生后第一年的死亡率接近80%[6],例如完全性肺靜脈異位連接(total anomalous pulmonary venous connection,TAPVC)、法洛四聯(lián)癥中的主動(dòng)脈騎跨、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位(transposition of great arteries,TGA)以及窗型動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus,PDA)。CHD中大血管結(jié)構(gòu)異常的胚胎學(xué)發(fā)生機(jī)制一直是不斷探索的主題,但由于大多數(shù)CHD呈散發(fā)性,死亡率極高,以往的研究主要是基于散發(fā)病例進(jìn)行生物信息學(xué)分析篩選致病候選基因,例如,Bleyl等[7]通過遺傳連鎖分析發(fā)現(xiàn)人類染色體4q12上的位點(diǎn)參與TAPVC,主要包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體2的位點(diǎn);通過對(duì)3個(gè)獨(dú)立CHD患病家庭的全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing,WES)鑒定出FLT4的新發(fā)突變c.244C>T:p.R82X參與法洛四聯(lián)癥中血管缺陷[8]。但是,CHD往往由多基因?qū)е?病因復(fù)雜,小樣本測(cè)序數(shù)據(jù)只能解釋個(gè)體CHD發(fā)病的部分機(jī)制。大樣本測(cè)序的全面基因組數(shù)據(jù)能為CHD的預(yù)防、診斷和機(jī)制探索提供重要的數(shù)據(jù)支持,但由于某些大血管結(jié)構(gòu)異常發(fā)病率低和早期致死率高,樣本收集困難,血管結(jié)構(gòu)異常CHD相關(guān)高通量測(cè)序的研究報(bào)道非常少。

在之前的研究[9]中,本課題組收集了78例散發(fā)TAPVC以及100例健康兒童外周血行WES,報(bào)道了TAPVC高度相關(guān)的致病基因Vav2;同時(shí),在39例PDA患者和100例健康人外周血WES數(shù)據(jù)中,篩選出Vav2可能與PDA發(fā)病高度相關(guān)[10],上述基于基因拷貝數(shù)變異的分析結(jié)果提示Vav2可能是血管發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子。Vav2是Vav家族的第二個(gè)成員,是一種鳥嘌呤核苷酸交換因子,通過結(jié)合鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)激活Rho GTP酶家族。在一些物種中,Vav家族成員的蛋白表達(dá)隨著系統(tǒng)發(fā)育而變化[11-13],提示Vav家族可能參與胚胎發(fā)育,其中Vav2常表達(dá)于高度血管化的器官,例如心臟和胎盤。研究[14]報(bào)道,Vav2和Vav3在內(nèi)皮細(xì)胞中共同作用,調(diào)節(jié)肝配蛋白A1誘導(dǎo)的體內(nèi)和體外血管生成;此外,Vav2被廣泛報(bào)道為腫瘤中的促血管生成因子[15-16],與血管生成高度相關(guān)。脈管系統(tǒng)早期發(fā)育依賴三個(gè)過程:血管發(fā)生、血管生成以及動(dòng)脈生成,血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖在這些過程中起著重要作用。既往研究[17]報(bào)道,內(nèi)皮細(xì)胞形成的咽中部?jī)?nèi)皮鏈,是肺總靜脈的前體,其排列錯(cuò)位會(huì)導(dǎo)致TAPVC;此外,多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞被報(bào)道可作為研究TGA的重要細(xì)胞模型[18],這些研究提示內(nèi)皮細(xì)胞在此類大血管結(jié)構(gòu)異常疾病發(fā)生機(jī)制中的重要作用。此前研究[19]報(bào)道,Vav2可作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的下游,選擇性激活Rac1介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和屏障功能;糖尿病條件下,Vav2激活Rac1促進(jìn)NADPH氧化酶2的全酶組裝加速毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡[20],Vav2在不同條件下的不同作用,提示Vav2在內(nèi)皮細(xì)胞中的重要功能。

盡管目前尚無關(guān)于Vav2影響心血管發(fā)育的詳細(xì)分子機(jī)制報(bào)道,但關(guān)于Vav2調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能參與血管新生的研究以及本課題組的測(cè)序數(shù)據(jù),均提示Vav2在心血管發(fā)育中可能存在重要作用。為進(jìn)一步研究Vav2與血管發(fā)育的詳細(xì)關(guān)系,本課題組匯總血管發(fā)育異常疾病的WES數(shù)據(jù),從遺傳變異角度出發(fā),通過gene-based負(fù)荷分析和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)-based關(guān)聯(lián)分析等生物信息學(xué)處理,在血管結(jié)構(gòu)異常的PDA患者中篩選得到候選基因Vav2的高度致病突變c.701C>T:p.P234L。本研究主要根據(jù)WES獲得的生物信息,進(jìn)一步研究Vav2新發(fā)突變?cè)谌四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中的功能,并探討其對(duì)可能調(diào)控的下游靶基因的影響,為血管結(jié)構(gòu)異常類CHD發(fā)病遺傳分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院收集確診的血管結(jié)構(gòu)發(fā)育異?；純貉簶?biāo)本117例,同時(shí)收集200例與病例組年齡和性別相匹配的健康兒童血液作為對(duì)照。該研究按照《赫爾辛基宣言》進(jìn)行,已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),樣本采集均獲得了受試者父母或監(jiān)護(hù)人的書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

使用Genome Analysis Toolkit鑒定WES數(shù)據(jù)中Vav2非同義突變(NC_000009.12,NM_001134398),通過參考人群基因組常見數(shù)據(jù)庫gnomAD和ExAC,篩選最小等位基因頻率<0.01的罕見突變,通過Mutation Taster、SIFT、LRT以及PROVEAN等數(shù)據(jù)庫評(píng)估篩選出致病可能性高的Vav2突變位點(diǎn)。Sanger測(cè)序法驗(yàn)證入選病例及對(duì)照樣本DNA序列。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

Vav2過表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照購于吉?jiǎng)P基因生物公司;以野生型質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)突變引物,用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)酶對(duì)模板進(jìn)行定點(diǎn)突變,得到突變質(zhì)粒P234L,突變質(zhì)粒經(jīng)過Sanger測(cè)序確認(rèn)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HUVEC購于美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所,使用含有10%胎牛血清(Biological Industries)和1%青霉素-鏈霉素混合液(Yeasen)的高糖培養(yǎng)基(BasalMedia)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HUVEC接種于6孔板,待細(xì)胞融合度為70%時(shí),使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific)轉(zhuǎn)染空載、Vav2野生型質(zhì)粒、Vav2突變質(zhì)粒(P234L)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 qRT-PCR

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后,根據(jù)說明書使用TRIzol提取RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Takara)將1 000 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA鏈,通過TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Takara)10 μL體系進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參,2^-△△CT法對(duì)mRNA表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,序列見表1。

1.2.5 Western blot

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后,用含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的裂解液收集HUVEC蛋白,濃度測(cè)定后,高溫變性蛋白。取20 μg蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore),經(jīng)過5%牛血清白蛋白(Aladdin)室溫封閉2 h,在4 ℃下與一抗anti-Vav2(Santa Cruz Biotechnology)、anti-GAPDH(Santa Cruz Biotechnology)、anti-Rac1(Proteintech)或anti-Flag(Sigma)4 ℃孵育過夜。第2天用過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(Yeasen)室溫孵育2 h后,經(jīng)過化學(xué)發(fā)光試劑盒(雅酶)顯影蛋白。

1.2.6 細(xì)胞增殖檢測(cè)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后,按照3 000個(gè)/孔將HUVEC接種于96孔板,于培養(yǎng)后的24、48和96 h去除培養(yǎng)基,加入100 μL 10%CCK-8溶液(碧云天),在37 ℃,5%CO2孵育2 h后測(cè)定OD450評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。

1.2.7 劃痕試驗(yàn)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后,待HUVEC密度接近100%,用200 μL無菌槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕,磷酸鹽緩沖液清洗后,加入培養(yǎng)基,鏡下觀察并拍照記錄(0 h),放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),于8 h和24 h后分別鏡下觀察并拍照記錄,以劃痕愈合率(%)評(píng)價(jià)遷移能力。

1.2.8 成管實(shí)驗(yàn)

預(yù)冷96孔板,每孔加入60 μL的基質(zhì)膠(Corning)凝固后,每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,細(xì)胞總數(shù)為2×104個(gè),4 h后鏡下拍照記錄,以成管交點(diǎn)和形成小管直徑評(píng)價(jià)成管能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)值均以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,每組實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立地重復(fù)三次。使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),組間單一協(xié)變量間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sanger測(cè)序結(jié)果和突變保守性分析

Sanger測(cè)序結(jié)果顯示入選病例的第8外顯子區(qū)c.C701T導(dǎo)致第234位氨基酸從脯氨酸變成亮氨酸,該雜合突變位點(diǎn)在正常對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)(圖1A),且入選病例父母否認(rèn)家族性CHD病史。跨物種蛋白序列比對(duì)顯示,該突變位點(diǎn)在脊椎動(dòng)物中高度保守(圖1B),提示該突變可能導(dǎo)致Vav2的功能改變。Mutation Taster網(wǎng)站預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)具有高度致病性;SIFT評(píng)分為0.037,數(shù)值越小,提示引起蛋白質(zhì)功能改變的可能性越大;其中,PROVEAN評(píng)分為-4.42,進(jìn)一步提示該突變可能影響Vav2蛋白功能,該突變具體信息詳見表2。

注:圖A為對(duì)照組和病例組的Vav2測(cè)序峰圖,黑色箭頭指示突變位點(diǎn);圖B為P234L突變?cè)诓煌锓N中的蛋白序列保守性分析;*表示該氨基酸在不同物種間高度保守。

表2 P234L突變的具體信息

2.2 P234L突變對(duì)Vav2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC后,野生型Vav2、突變P234L轉(zhuǎn)染組間Vav2 mRNA表達(dá)量無明顯差異(圖2A)。但與野生型相比,該突變的蛋白表達(dá)量降低(圖2B、圖2C),表明這個(gè)錯(cuò)義突變影響Vav2蛋白表達(dá)。

注:圖A為HUVEC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vav2的mRNA表達(dá),ACTB作為內(nèi)參;圖B為HUVEC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后標(biāo)簽蛋白表達(dá),GAPDH作為內(nèi)參;圖C為HUVEC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vav2蛋白表達(dá)。*表示和空載組相比,P<0.05;**表示和空載組相比,P<0.01;#表示和野生型Vav2組相比,P<0.05;##表示和野生型Vav2組相比,P<0.01;ns表示無顯著性差異。n=4。

2.3 野生型Vav2和P234L突變對(duì)HUVEC增殖能力的影響

通過CCK-8檢測(cè)野生型Vav2及突變P234L對(duì)HUVEC增殖能力的影響,與空載組相比,野生型Vav2轉(zhuǎn)染組HUVEC在24、48和72 h增殖率明顯升高(P<0.01);突變P234L轉(zhuǎn)染組在24、48及72 h不影響HUVEC增殖(圖3)。

注:**表示和空載組相比,P<0.01;#表示和野生型Vav2組相比,P<0.05;##表示和野生型Vav2組相比,P<0.01;ns表示無顯著性差異。n=3。

2.4 野生型Vav2和P234L突變對(duì)HUVEC遷移和成管能力的影響

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC后,劃痕試驗(yàn)結(jié)果提示,野生型Vav2轉(zhuǎn)染后能促進(jìn)HUVEC在24 h內(nèi)的劃痕愈合(上調(diào)約40%,P<0.05),而P234L突變轉(zhuǎn)染組不影響HUVEC遷移能力(圖4A)。一致的是,與空載組相比,野生型Vav2轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后,可促進(jìn)HUVEC成管能力(上調(diào)約30%,P<0.05);與野生型Vav2轉(zhuǎn)染組相比,P234L突變轉(zhuǎn)染HUVEC減弱了Vav2誘導(dǎo)的HUVEC成管能力(圖4B)。

注:圖A為HUVEC劃痕試驗(yàn)0、8和24 h代表性圖片;圖B為HUVEC成管實(shí)驗(yàn)4 h代表性圖片。*表示和空載組相比,P<0.05;#表示和野生型Vav2組相比,P<0.05;ns表示無顯著性差異?？潭瘸?200 μm;n=3。

2.5 Vav2過表達(dá)對(duì)下游Rac1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

qRT-PCR和Western blot結(jié)果提示野生型Vav2、突變P234L轉(zhuǎn)染HUVEC后并不影響Rac1本底表達(dá)(圖5A、圖5B),與文獻(xiàn)報(bào)道一致,提示Vav2可能調(diào)控下游Rac1結(jié)合GTP激活而非本底表達(dá)。通過對(duì)Vav2蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析,P234L突變位于Vav2催化DH結(jié)構(gòu)域,這決定了Vav2催化下游Rho GTP酶家族激活(圖5C),提示P234L突變可能是通過影響Vav2催化下游Rac1激活進(jìn)而影響Vav2在HUVEC發(fā)揮功能,需進(jìn)一步檢測(cè)Rac1-GTP活性形式揭示該突變對(duì)下游的影響。

3 討論

CHD作為一類嚴(yán)重的先天畸形,妊娠期會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)和新生兒死亡等,對(duì)于存活患兒,身高、體重及智力發(fā)育會(huì)滯后于同齡健康兒童,是影響兒童身心健康的重大公共衛(wèi)生事件。大血管結(jié)構(gòu)異常的CHD進(jìn)展快速、臨床癥狀嚴(yán)重,例如,TAPVC和TGA缺乏足夠的氧合血液的供應(yīng),患兒出生后如不給予及時(shí)治療將無法存活。但新生兒血管解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,不易辨認(rèn),誤診或漏診率高,延誤治療時(shí)機(jī)。由于此類疾病低發(fā)病率和高致死率,樣本收集困難,動(dòng)物模型少,目前關(guān)于大血管結(jié)構(gòu)異常CHD發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚。CHD是由環(huán)境和遺傳因素共同作用,具有不完全外顯率和可變的表達(dá)特性,遺傳學(xué)相關(guān)研究能幫助探究此類CHD發(fā)病的分子機(jī)制且有助于臨床對(duì)此類疾病的產(chǎn)前診斷和早期發(fā)現(xiàn)。前期研究中117例血管結(jié)構(gòu)發(fā)育異?；颊叩腤ES結(jié)果提示Vav2與此類血管結(jié)構(gòu)異常的CHD高度相關(guān)[9-10]。在本研究中,通過生物信息學(xué)手段處理前述WES的數(shù)據(jù),篩選出Vav2未曾被報(bào)道的新發(fā)罕見突變c.701C>T:p.P234L,擬從遺傳變異角度進(jìn)一步厘清Vav2在血管發(fā)育中的重要功能。Mutation Taster在線預(yù)測(cè)提示這個(gè)突變位點(diǎn)為高度“致病性”位點(diǎn),且該位點(diǎn)在人類、獼猴、褐家鼠等脊椎動(dòng)物上高度保守,提示這個(gè)突變可能引起重要的功能改變。qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,P234L突變不影響Vav2 mRNA表達(dá),但蛋白的表達(dá)量較野生型有下調(diào),轉(zhuǎn)錄和翻譯的差異提示這個(gè)位點(diǎn)引起的單個(gè)氨基酸改變可能會(huì)影響Vav2蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中,內(nèi)皮細(xì)胞在構(gòu)建組織化的血管網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。因此,筆者在HUVEC中進(jìn)一步探究Vav2罕見新發(fā)突變P234L的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,Vav2能促進(jìn)HUVEC增殖、遷移以及成管,具有促進(jìn)血管生成的作用;而P234L突變能改變Vav2在內(nèi)皮細(xì)胞中促進(jìn)HUVEC增殖、遷移和成管的積極功能,筆者的研究結(jié)果提示Vav2可能是胚胎發(fā)育過程中參與血管發(fā)育的重要分子,該突變可能是血管結(jié)構(gòu)異常的CHD發(fā)病的分子機(jī)制之一。

Vav2作為一類鳥嘌呤核苷酸交換因子,通過結(jié)合GTP激活Rho GTP酶家族(主要包括Rac1、Cdc42和RhoA),這些成員在GTP結(jié)合的活性形式下能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)重要生物學(xué)功能,包括細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白激酶激活等[21]。Rac1作為Vav2廣泛報(bào)道的下游,Vav2往往與Rac1相互作用后,通過促進(jìn)Rac1結(jié)合GTP形成Rac1-GTP活性形式發(fā)揮功能,進(jìn)而調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的遷移[22]。但是,Vav2是否通過激活Rac1影響內(nèi)皮細(xì)胞功能進(jìn)而調(diào)節(jié)CHD發(fā)生尚不清楚。qRT-PCR以及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,野生型Vav2以及突變P234L過表達(dá)均不會(huì)影響Rac1的本底表達(dá),結(jié)合之前的研究結(jié)果,Vav2更可能是通過催化GTP與Rac1結(jié)合發(fā)揮作用。通過對(duì)Vav2蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析,P234L突變位于Vav2催化下游Rho GTP酶家族與GTP結(jié)合的DH結(jié)構(gòu)域,P234L突變極有可能是通過影響Vav2催化下游Rac1激活進(jìn)而影響Vav2在HUVEC發(fā)揮功能,需進(jìn)一步檢測(cè)下游Rac1-GTP活性形式來研究該突變對(duì)下游的影響。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Vav2錯(cuò)義突變c.701C>T:p.P234L能改變Vav2蛋白序列,影響Vav2蛋白表達(dá),改變Vav2促進(jìn)HUVEC增殖、遷移和成管的能力,此突變可能是通過改變Vav2蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響下游Rac1激活而非本底表達(dá)導(dǎo)致Vav2的功能改變。Vav2在HUVEC中的功能提示Vav2對(duì)血管發(fā)育可能至關(guān)重要,P234L突變對(duì)Vav2功能的影響可能會(huì)導(dǎo)致心血管發(fā)育的異常,進(jìn)而導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)異常的CHD發(fā)生,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為血管結(jié)構(gòu)異常的CHD發(fā)生機(jī)制以及臨床早期診斷提供進(jìn)一步理論依據(jù)。