李夢依 劉英杰 齊靈垚 秦地茂

(西南交通大學附屬醫(yī)院 成都市第三人民醫(yī)院心電血壓研究室 成都市心血管病研究所,四川 成都 610031)

靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE)包括深靜脈血栓(deep vein thrombosis,DVT)和肺栓塞(pulmonary embolism,PE),是繼心肌梗死和卒中之后第三常見的血管疾病[1]。流行病學研究[2-3]表明,隨著增齡,全世界VTE發(fā)病率為(1～2)‰。幾項研究也證實了VTE患者的高死亡率。例如,一項納入了7萬余人的薈萃分析[4]回顧了86項隨機對照試驗,結果表明,即使經(jīng)過治療,VTE仍然可導致9.8%的受試者死亡。盡管存在系統(tǒng)的治療和管理,VTE患者的預后仍然很差,其10年復發(fā)率為30%[5-8]?？紤]到VTE預后不佳,其治療方面一直是當前的研究熱點。

VTE的危險因素較多,如靜坐、吸煙以及外科手術術后。最近,據(jù)報道[9-10],作為腸道微生態(tài)系統(tǒng)中最關鍵的活性成分,三甲胺N-氧化物(trimethylamine N-oxide,TMAO)及其前體與VTE風險密切相關。當腸道菌群的平衡被破壞時,各種致病微生物增殖并產(chǎn)生過量的TMAO,導致血管內(nèi)皮細胞、血小板和先天免疫細胞中的炎癥途徑活化,這將升高VTE風險[11-16]。目前,一些研究人員試圖通過各種途徑解釋TMAO及其前體與VTE的關系。然而,這些研究的樣本量較為有限,而且,多為回顧性研究,存在反向因果關系以及不能評估的混雜因素[17]。

孟德爾隨機化(Mendelian randomization,MR)是探索暴露與結果之間因果關系的一種流行方法。MR分析主要使用基因變異作為暴露的工具變量,以評估暴露對結果的因果影響。此外,MR研究還可以克服觀察性研究的典型缺點,如反向因果關系和潛在混雜因素,使結果更令人信賴[18]。

在本研究中,進行了雙樣本MR分析,以探討TMAO及其前體與VTE的主要組成部分DVT和PE之間的因果關系。

1 方法

1.1 研究設計

本研究采用了雙樣本MR方法[19]。雙樣本MR必須滿足3個假設,即:(1)工具變量與TMAO及其前體密切相關;(2)工具變量不能與DVT和PE相關;(3)工具變量不與影響DVT和PE的混雜因素相關。

1.2 數(shù)據(jù)來源

TMAO及其前體:為了探討TMAO及其前體(肉堿、膽堿和甜菜堿)是否與DVT和PE的發(fā)病風險增加相關,筆者從全基因組關聯(lián)研究的薈萃分析[20]中獲得了與上述腸道代謝產(chǎn)物相關的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)作為工具變量(n=2 076)。然而,該全基因組關聯(lián)研究識別的位點很少達到全基因組顯著性水平,因此本研究提取了具有全基因組顯著閾值(P<5×10-5)的SNP作為工具變量。

DVT和PE:DVT和PE的匯總數(shù)據(jù)來自英國生物銀行。英國生物銀行是一項包括50多萬英國公民的隊列研究。通過MR Base平臺(ukb-b-12040、ukb-b-18366)訪問了英國生物庫的數(shù)據(jù),其中,DVT數(shù)據(jù)包括92 441例患者以及453 692例對照人群,計有9 851 867個SNP位點;而PE的數(shù)據(jù)則包含1 846例患者和461 164例對照人群,計有9 851 867個SNP位點[21]。

1.3 遺傳工具變量

為了滿足第一個MR假設,即SNP與暴露密切相關,在全基因組水平上選擇了與TMAO及其前體顯著相關的工具變量(P<5×10-5,r2<0.001,遺傳距離=10 000 kb)。此外,由于納入的SNP易受弱工具變量的影響,還計算了F統(tǒng)計量。如果F統(tǒng)計量顯著大于10,則表明弱工具變量不太可能影響結果[22]。最后,為了滿足第二個MR假設,即遺傳變異與任何潛在混雜因素無關,在PhenoScanner數(shù)據(jù)庫中進行了查詢,以確定所包含的SNP是否與已知混雜因素(血脂異常和肥胖)相關。如果是,它們則被排除在外。

1.4 MR分析

在本研究中,使用了五種MR分析方法,包括逆方差加權法(inverse-variance weighting,IVW)、MR-Egger、MR多效性殘差和異常值檢驗(Mendelian Randomization Pleiotropy RESidual Sum and Outlier,MR-PRESSO)、最大似然比法和加權中值法[23-27]。首先,使用了IVW來估計TMAO及其前體與DVT和PE的關系。其次,使用MR-PRESSO、MR-Egger、最大似然比法和加權中值法進一步對IVW結果進行敏感性分析,以驗證腸道代謝物對DVT和PE的影響。最大似然比法是一種具有低標準誤差的傳統(tǒng)方法,通過最大似然來測量潛在分布參數(shù)[24]。MR-Egger基于InSIDE的假設,對暴露結果進行加權線性回歸,但其易受工具變量的影響[25]。加權中值法可以顯著提高因果效應的檢測能力,并減少Ⅰ型錯誤[26]。MR-PRESSO類似于IVW,其因果估計與其他工具變量顯著不同[27]。如果少于50%的工具變量存在水平多效性,MR-PRESSO可以提供較為準確的分析。最后,為了有效地解釋該MR的結果,進一步計算了相應的OR值以及95%CI。

1.5 水平多效性及異質(zhì)性

本研究使用了不同的方法來評估潛在的影響。CochranQ統(tǒng)計和MR-Egger回歸用于解釋研究中的異質(zhì)性和水平多效性[28]。如果P<0.05,則表明納入的工具變量中沒有偏差和異質(zhì)性。MR-PRESSO也被用作全局、離群值和失真測試的附加多重性控制。最后,“留一法”敏感性分析和漏斗圖法用于評估每個工具變量和結果之間的關系。

所有統(tǒng)計分析均采用R4.1.1軟件進行。顯著性水平設置為0.012 5(0.05除以4個風險因素)。

2 結果

2.1 腸道微生物群和代謝產(chǎn)物的遺傳工具變量

在本研究中發(fā)現(xiàn),rs488419(TMAO)、rs17418675(TMAO)、rs2074755(甜菜堿)、rs16840689(甜菜堿)和rs10883712(甜菜堿)基因座與血脂異常和肥胖密切相關,因此刪除了這些SNP。最后,納入了132個與腸道代謝產(chǎn)物相關的連鎖不平衡、非獨立的SNP(37個與甜菜堿相關,26個與肉堿相關,23個與膽堿相關,46個與TMAO相關)。工具變量解釋的DVT和PE的方差范圍為37.14%～87.70%。此外,所有工具變量的F統(tǒng)計值顯著大于18.77,有效地消除了本研究中弱工具變量的影響。

2.2 MR分析

基于IVW,發(fā)現(xiàn)TMAO每增加1個單位,DVT的相對風險增加0.08%(OR=1.000 8,95%CI1.000 4～1.001 2,P=0.001 3);膽堿濃度每增加1個單位,DVT的相對風險提高0.06%(OR=1.000 6,95%CI1.000 1～1.001 2,P=0.042 0),另外,最大似然法也證實了上述關系。然而,筆者觀察到TMAO及其前體與PE風險無關(表1)。

表1 TMAO及其前體與VTE的因果關系

2.3 水平多效性和異質(zhì)性分析

在MR分析中,較多的工具變量通常會帶來更準確的結果,并為MR提供更好的效能,但它也會導致水平的多效性和異質(zhì)性。因此,使用了一系列方法來評估研究中是否存在顯著的水平多效性和異質(zhì)性。MR-Egger截距和CochranQ檢驗表明,本研究中不存在水平多效性和異質(zhì)性的易感性(P值均>0.05)?！傲粢环ā泵舾行苑治霰砻?納入的SNP對結果沒有顯著影響,表明結果具有顯著的可靠性,漏斗圖顯示不對稱分布的SNP,這表明因果關聯(lián)不太可能受到潛在偏差的影響。MR-PRESSO分析的結果表明,納入的SNP位點沒有任何異常值,與IVW的結果保持一致(圖1～圖4)。

圖1 “留一法”提示TMAO與DVT的敏感性分析

圖2 漏斗圖提示不對稱分布SNP(TMAO與DVT)

圖3 “留一法”提示膽堿與DVT的敏感性分析

圖4 漏斗圖提示不對稱分布SNP(膽堿與DVT)

3 討論

本研究首次采用MR法探討TMAO及其前體對DVT及PE的影響?；蝾A測的結果表明TMAO和膽堿可能會增加DVT的風險,但可能與PE風險無關。這些發(fā)現(xiàn)表明降低TMAO和膽堿水平可能降低DVT的風險。

作為日常食物的主要來源,膽堿可以在腸道中轉(zhuǎn)化為三甲胺,然后通過門靜脈的血液循環(huán)被人體腸道吸收,最后由肝臟代謝為TMAO,從而參與人體的各種代謝途徑[29]。之前的一些研究[30]中發(fā)現(xiàn),在該過程中,TMAO及其前體(膽堿)與血栓性疾病密切相關。例如,在2011年,一項納入了1 876例受試者的觀察性研究[31]表明,TMAO與急性心肌梗死和外周動脈疾病等血栓性疾病密切相關。隨后,Zhu等[14]發(fā)現(xiàn)TMAO與血栓事件累積負擔增加呈劑量依賴性關系,在調(diào)整心血管疾病史、傳統(tǒng)心血管疾病危險因素、腎功能和藥物使用后,這種關系仍然保持一致。同樣,在本研究中,DVT的相對風險隨著TMAO濃度的增加而增加。然而,TMAO促進血栓形成的機制尚不清楚。一些研究人員推測,這一機制可能是多種因素共同作用的結果。例如,TMAO可以通過改變1,4,5-三磷酸肌醇信號通路來促進血小板高反應性,增強細胞內(nèi)Ca2+儲備的釋放,此外,TMAO還可以激活血小板激動劑如腺苷二磷酸、凝血酶和膠原,并間接增強血小板反應性,從而直接或間接促進血栓形成[32]。最近也有報道[33-34]稱,TMAO可以通過激活血管中的炎癥反應來介導血栓形成,導致血管內(nèi)皮細胞損傷。

在本研究中,基因預測還表明,DVT的相對風險隨著膽堿濃度的增加而增加,這也與先前的研究一致。一項2017年的前瞻性隊列研究顯示,補充膽堿后血栓形成的風險增加,即使受試者服用抗血小板藥和其他相關藥物,血栓形成的潛在風險也并不降低。令人遺憾的是,膽堿促進血栓形成的機制目前尚不清楚,一些研究人員推測其可能與血小板活化有關。例如,膽堿可通過Slc44a2受體介導的線粒體轉(zhuǎn)運代謝為腺苷三磷酸和活性氧[32]。腺苷三磷酸為血小板活化提供能量,其代謝產(chǎn)物腺苷二磷酸可作用于血小板嘌呤能受體,進一步驅(qū)動血小板活化并促進血栓形成[35]。此外,活性氧作為另一種代謝產(chǎn)物,也可能通過調(diào)節(jié)血小板對膠原蛋白的親和力參與血栓形成[32]。

值得注意的是,本研究使用了大型全基因組關聯(lián)研究的數(shù)據(jù),并進行了雙樣本MR分析,因此可有效地避免觀察性研究相關的偏倚,這為確定腸道代謝產(chǎn)物與DVT之間的關系提供了可靠的證據(jù)。此外,使用其他方法進一步驗證了本研究的結果,這也使得結果更為可靠。然而,本研究也有一些局限性。第一,研究僅限于歐洲血統(tǒng)的人群,目前尚不清楚這些結果是否可以應用于其他人群;第二,不能完全排除可能的飲食基因或基因環(huán)境相互作用的影響;第三,由于本研究中OR值接近1,因此更多的研究將有助于探索這一機制。

總之,在本研究中,發(fā)現(xiàn)了TMAO和膽堿可能促進DVT。這提示對于有血栓風險的患者,應該注意TMAO的變化,避免高膽堿飲食。此外,二者之間的確切機制尚不清楚,更多的研究將有助于探索這一機制。