張苗苗，柯 媛，董同珺，伍修德，肖甚圣，王學(xué)東，丁貝貝

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 武漢 430000）

曲霉屬在自然界分布極廣，廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造業(yè)、現(xiàn)代發(fā)酵業(yè)及生物工程研究中，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義[1]。該屬是引起多種物質(zhì)霉腐的主要微生物之一，會產(chǎn)生有毒次級代謝物，如赭曲霉毒素，污染食品、飼料及中藥，嚴(yán)重危害動物及人類健康[2-3]。作為重要的發(fā)酵工業(yè)菌屬，黑曲霉能導(dǎo)致水分較高的糧食霉變。食品行業(yè)一般通過篩選谷物產(chǎn)品中是否存在這類真菌，并使用抗生素抑制其生長，防止食品腐敗[4]。然而，食品中殘留的抗生素會導(dǎo)致人體耐藥性增加，這在很大程度上限制了臨床治療的選擇，嚴(yán)重影響人類健康[5]。亟待開發(fā)具有生物降解性的新型無毒、高效的抗菌劑，以保障食品品質(zhì)和保護(hù)人類健康。

殼寡糖（COS）是殼聚糖的降解產(chǎn)物，是由2～20 個(gè)氨基葡萄糖通過β-1，4 糖苷鍵鏈接而成的寡聚糖，具有良好的水溶性及生物活性，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[6]。劉芳等[7]研究發(fā)現(xiàn)COS 對原料乳中細(xì)菌總數(shù)和嗜冷菌數(shù)均有顯著的抑制作用，且COS 的濃度和抑菌效果呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了抗菌活性與COS 氨基含量和氨基質(zhì)子化密切相關(guān)。Plascencia 等[8]研究認(rèn)為殼聚糖能夠提高幾丁質(zhì)酶的活性，影響細(xì)胞壁的形成，并且可以聚集孢子，造成細(xì)胞形態(tài)異常，胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，甚至導(dǎo)致微生物死亡。此外，COS 溶解性好、易于吸收，可作為生物保鮮劑應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化妝品等領(lǐng)域，并且有降血脂、抗衰老、提高免疫力等功效，被認(rèn)為是一種潛在的天然抗菌防腐劑[9-10]。

COS 是一種具有生物活性的殼聚糖低聚物，有潛力作為一種天然抗菌防腐劑來改變微生物細(xì)胞膜的通透性，并影響微生物的生長和存活。目前，COS 對腐敗真菌的抑制研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)COS 對黃曲霉和煙曲霉有較好抑制作用[10]。本文通過測定最低抑菌濃度（MIC）、菌絲生長抑制率和孢子萌發(fā)抑制率揭示COS 對黑曲霉、赭曲霉和雜色曲霉的抑菌活性，通過觀測細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)、漿膜損傷、細(xì)胞膜透性、幾丁質(zhì)含量和活性及可溶性蛋白含量變化來評估細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，厘清COS 對黑曲霉、赭曲霉和雜色曲霉的抑菌活性及抑菌機(jī)制，為COS在食品貯藏領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

COS（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.07%，純度≥90%，聚合度為3～6），濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；菌株（GDMCC 3.386 黑曲霉，GDMCC 3.28 赭曲霉，GDMCC 3.473 雜色曲霉），廣東省微生物菌種保藏中心；馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB），上海博微生物科技有限公司；丙二醛含量測試盒（G0110W），蘇州格瑞銳思生物科技有限公司；幾丁質(zhì)酶活性測定試劑盒（BC0820），北京索萊寶科技有限公司；蛋白濃度測定試劑盒（G3522-200T），廣州捷倍斯生物科技有限公司。

1.2 設(shè)備

BXM-75VE 滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HNY-200B 恒溫?fù)u床，天津市歐諾有限公司；HP150MJ-B 霉菌培養(yǎng)箱，武漢瑞華有限責(zé)任公司；SpectraMax M2e 酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices；EVOLUTION220 紫外光光度計(jì)，美國Thermo scientific；Sorvall RC6 plus 離心機(jī)，美國賽默飛世爾；S-3000N 掃描電鏡，日本日立公司；F-4600 熒光光譜儀，日本日立HITACHI；FV1200 激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus。

1.3 方法

1.3.1 COS 對真菌最小抑菌濃度的測定 通過微量稀釋法對COS 的MIC 進(jìn)行評估。首先取10 g COS 溶于20 mL 的無菌水混合制成COS 溶液，再用二倍稀釋法稀釋成500～0.24 mg/mL 至96 孔板。制備一排陰性對照（PDB）和一排陽性對照（PDB+真菌），將孔板于28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，記錄最小抑菌濃度MIC[11]。

1.3.2 COS 對菌絲生長抑制率的測定 先將COS制成MIC、2MIC 濃度的兩種COS 溶液，再往含有90 mL 的PDA 培養(yǎng)基中吸取不同濃度的10 mL COS 溶液，每個(gè)平板培養(yǎng)基中加入1 塊直徑為6.00 mm 的菌餅，菌絲體向下，28 ℃培養(yǎng)箱下3 d，測定菌落直徑[12]，根據(jù)下列公式計(jì)算菌絲抑制率：

1.3.3 COS 對真菌孢子萌發(fā)抑制率的測定 取一支已經(jīng)活化好的菌種，在無菌條件下，用PDB 溶液制成孢子懸浮液，取凹玻片，滴入45 μL 的菌孢子懸浮液和15 μL 不同濃度的COS，并設(shè)置對照。將凹玻片于28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)100 個(gè)孢子[13]，根據(jù)下列公式計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率：

1.3.4 細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的測定 將菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d，收獲菌絲體，用蒸餾水洗滌2 次，棄去上清液，真菌菌體沉淀用2.5%戊二醛溶液固定24 h，冷凍干燥，噴金，最后在掃描電鏡下觀察[14]。

1.3.5 漿膜損傷的測定 將真菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，對照組為未經(jīng)過COS 處理的樣品。收獲菌絲體，用蒸餾水洗滌2次，將細(xì)胞洗凈，棄去上清液，用0.5 mL PBS 重懸，用終質(zhì)量濃度為1 mg/mL PI 溶液在PBS 中室溫黑暗染色30 min，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察每個(gè)樣品[15]。

1.3.6 細(xì)胞膜滲透性的測定 將菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)1～2 d，將菌絲在4℃、10 000 r/min 條件下離心20 min，得到上清液，測定其電導(dǎo)率[11]。

1.3.7 核酸泄露值的測定 將菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d。未經(jīng)COS 處理的樣本作為對照組。在4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，得到上清液，然后，用紫外分光光度計(jì)測定260 nm 時(shí)各菌液的吸光值為核酸泄露值[16]。

1.3.8 幾丁質(zhì)含量的測定 將真菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃條件下接種12 h 后，未經(jīng)過COS處理的樣品作為對照。用蒸餾水洗滌2 次，用0.025%剛果紅在暗光中染色5 min，樣品用熒光光譜儀檢測，選擇540 nm 激發(fā)波長和500～900 nm 發(fā)射光譜進(jìn)行分析[11]。

1.3.9 幾丁質(zhì)酶活性的測定 在無菌條件下，將1 mL 菌懸液直接接種于含有MIC、2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)3 d 后，洗滌，收集菌絲，稱重。然后研磨至糊狀，轉(zhuǎn)入離心管中，8 000 r/min，4 ℃離心25 min，取上清液為所提酶液，用幾丁質(zhì)酶活性測定試劑盒測定。

1.3.10 可溶性蛋白濃度的測定 在無菌條件下，將菌懸液直接接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d，經(jīng)過濾、沖洗菌絲后，再用磷酸緩沖液（0.2 mo1/L，pH 7.5）沖洗3 次，用濾紙吸干后獲得菌絲，再稱取0.5 g 菌絲于研缽中，依次加入2 mL磷酸緩沖液和1 g 石英砂在冰浴中將菌絲研磨至糊狀，轉(zhuǎn)移至離心管中，不足10 mL 通過添加磷酸緩沖液補(bǔ)足，并于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心15 min，未用COS 處理的樣本作為對照組，取上清液于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，再用蛋白濃度測定試劑盒測定。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析與處理 每組試驗(yàn)重復(fù)測定3次，結(jié)果表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。利用Origin 8.5 軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COS 對真菌最小抑菌濃度的影響

最小抑菌濃度（MIC）可用于定量表示抑菌劑的抑菌性能，COS 對3 種真菌的最小抑菌濃度（MIC）見表1。由表可知，COS 對被試菌的MIC 范圍在15.6～31.2 mg/mL 之間，COS 對赭曲霉、雜色曲霉的MIC 值為15.6 mg/mL，而對黑曲霉的MIC值為31.2 mg/mL，這與前人的研究結(jié)果有相似之處。錢建瑛等[17]研究發(fā)現(xiàn)，40 mg/mL 的COS 對大腸桿菌抑菌活性有56%。穆曉麗[18]研究發(fā)現(xiàn)COS對米曲霉有抑制作用，COS 質(zhì)量濃度為12 g/L 時(shí)抑菌效果最好。從表1 也可知，COS 質(zhì)量濃度在32 mg/mL 以上時(shí)可以有效的抑制3 種真菌的生長，但3 株腐敗真菌對COS 的敏感程度不同，該現(xiàn)象可能與菌株的自身活力有關(guān)，即COS 對不同真菌的抑菌效果不同，說明COS 對不同菌種的抑制作用是一致而特異的。

表1 COS 對真菌的最小抑菌濃度（MIC）Table 1 MICs of COS against fungi

2.2 COS 對菌絲生長抑制率的影響

COS 對不同真菌菌絲生長抑制如表2 所示。由表2 可知，COS 對3 種真菌的菌絲生長均有抑制作用，且COS 對真菌菌絲生長的影響隨著COS濃度的增加而逐漸增大，即存在濃度依賴性。當(dāng)COS 濃度為MIC 時(shí)，對3 種真菌菌絲生長抑制率都在30%以上，其中對雜色曲霉的菌絲生長抑制作用最明顯，達(dá)到40%，原因可能是雜色曲霉的生長活性最弱；當(dāng)COS 濃度為2MIC 時(shí)，對3 種真菌菌絲生長抑制作用明顯，抑制率都在55%以上，對黑曲霉菌絲生長抑制率最明顯達(dá)到82%以上。馬增新等[19]也研究發(fā)現(xiàn)，COS 對4 種青霉菌菌絲生長均具有抑制作用，且存在濃度依賴性，隨濃度的升高抑制作用加強(qiáng)。周國春[20]研究發(fā)現(xiàn)，200 μg/mL COS 處理組對交鏈孢菌絲生長抑制率有7.94%。胡國元等[21]研究得出COS 對煙草赤星病病原菌（鏈格孢菌）有明顯的抑制作用，抑菌率可達(dá)到80%以上。顧麗嬙[22]研究發(fā)現(xiàn)，COS 濃度對灰霉病菌的抑制作用呈正相關(guān)，1 500 mg/L COS 對灰霉病菌菌絲生長的抑制率均在80%以上，菌絲直徑明顯增粗，間隔變多。臧珉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，COS濃度增加，抑制率提高，5 g/L COS 對棉花枯萎病菌的抑制率達(dá)到20%，對煙草赤星菌菌絲生長的抑制率為14%。

表2 COS 對真菌菌絲生長抑制率Table 2 Inhibitory rate of COS on hypha growth of fungi

2.3 COS 對真菌孢子萌發(fā)抑制率的影響

COS 對3 種真菌孢子萌發(fā)影響結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，COS 對不同真菌孢子萌發(fā)的影響不同，當(dāng)COS 濃度為MIC 時(shí)，對3 種真菌孢子均有抑制作用，對雜色曲霉的孢子萌發(fā)抑制能力最強(qiáng)，與菌絲生長抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。COS 隨著濃度的增加對3 種真菌抑制作用稍加明顯，當(dāng)COS濃度為2MIC 時(shí)，對這3 種真菌孢子萌發(fā)抑制率也都在36%以上，表明2MIC 的COS 能有效地抑制孢子萌發(fā)，這可能是菌株經(jīng)過COS 處理后，引起芽管產(chǎn)生畸形，芽管長度與對照組相比較短，使萌發(fā)率下降。COS 對真菌孢子萌發(fā)抑制率與菌絲生長抑制率結(jié)果類似。馬增新等[19]研究發(fā)現(xiàn)，COS對4 種青霉菌孢子萌發(fā)均具有抑制作用，且隨著COS 濃度的升高，抑制效果逐漸增強(qiáng)。顧麗嬙[22]研究發(fā)現(xiàn)，在1 500 mg/L 的質(zhì)量濃度下，COS 對灰霉病菌的產(chǎn)孢抑制率為83.82%，抑制孢子萌發(fā)率達(dá)52.97%。周國春[20]研究發(fā)現(xiàn)，在50～500 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，COS 對交鏈孢菌孢子萌發(fā)抑制作用強(qiáng)于產(chǎn)孢作用。隨著COS 濃度的增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)。100 μg/mL COS 處理組的孢子萌發(fā)抑制率在50%以上，500 μg/mL COS 處理組對孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到了100%。本研究中，COS 對孢子萌發(fā)的抑制作用要小于對菌絲的抑制作用，這可能是因?yàn)殒咦雍途z對COS 的敏感程度不同。

表3 COS 對真菌孢子萌發(fā)影響Table 3 Effects of COS on spore germination of fungi

2.4 COS 對真菌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響

掃描電鏡試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示，各組供試菌對照組的真菌菌絲形狀規(guī)則且完整，菌絲飽滿且比較均勻一致，對于黑曲霉、雜色曲霉，在COS 濃度為MIC 時(shí)，菌絲變得皺縮畸形，干癟，甚至出現(xiàn)菌絲斷裂，出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象，在COS 濃度為2MIC時(shí)，菌絲表面粗糙有突起，出現(xiàn)菌絲斷裂、內(nèi)容物外滲的現(xiàn)象；對于赭曲霉，在COS 濃度為MIC 和2MIC 時(shí)，菌絲表面粗糙有突起，內(nèi)容物也有外滲的現(xiàn)象。表明COS 對這3 種腐敗真菌有明顯損傷作用。該結(jié)果與周國春[20]的研究結(jié)果相似，通過掃描電鏡觀察到菌絲經(jīng)過COS 處理后，菌絲干癟，發(fā)生皺縮，且有菌絲斷裂現(xiàn)象，表面凹凸不平，菌絲破壞嚴(yán)重，且隨著濃度的增大，菌絲的破壞程度増加，這可能是濃度越大，菌絲與COS 的接觸機(jī)會越多，COS 對菌絲的破壞也就越大。

圖1 COS 對真菌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of COS on the cell microstructure of fungi

2.5 COS 對真菌漿膜損傷的影響

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）可穿過受損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并與DNA 特異性結(jié)合，發(fā)出紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細(xì)胞膜，只能染死細(xì)胞，因此，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞不能著色，壞死細(xì)胞呈紅色熒光[14]。所以本研究中我們采用的是PI 染色的方法，再通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察真菌細(xì)胞染色后熒光強(qiáng)度來反映COS 對3 種真菌漿膜損傷的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 COS 對真菌漿膜損傷的影響Fig.2 Effects of COS on serosal membrane injury of fungi

由圖2 可知，相對于對照組，經(jīng)COS 處理的3種真菌都能觀察到熒光信號，并且可以看到COS濃度為2MIC 的處理組熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于COS 濃度為MIC 的處理組，因此說明COS 對真菌的細(xì)胞膜有一定的影響，會破壞細(xì)胞膜的完整性，也使得真菌有不同程度的死亡，并呈濃度依賴性，隨COS濃度越高，對細(xì)胞膜的完整性破壞越嚴(yán)重，菌的死亡率越高。王瑩[24]通過激光共聚焦研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)50 ku 的殼聚糖進(jìn)入黑曲霉內(nèi)部時(shí)，細(xì)胞膜破壞，與本文研究結(jié)果一致。

2.6 COS 對真菌細(xì)胞膜滲透性的影響

滲透壓決定著細(xì)胞內(nèi)外的水平衡，水能通過半透膜出入細(xì)胞，蔗糖與蛋白質(zhì)等大分子則不能通過，因此可以通過測定溶液電導(dǎo)率的變化來了解細(xì)胞膜滲透性的變化[15]。COS 作用于3 種真菌后電導(dǎo)率的變化結(jié)果如表4 所示，由表可知，經(jīng)COS 處理后，各組腐敗真菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率均升高，且處理組溶液的電導(dǎo)率隨COS 濃度的增大而增大，其中黑曲霉組由0.10 ms/cm 升高至0.98 ms/cm，赭曲霉組由0.04 ms/cm 升高至0.52 ms/cm，雜色曲霉組由0.12 ms/cm 升高至0.59 ms/cm，相比較而言，黑曲霉的變化最明顯。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，COS 對真菌的細(xì)胞膜滲透性有作用，提高了細(xì)胞膜通透性，菌絲體內(nèi)部的一些重要離子如鉀離子和鈉離子會泄漏，外滲進(jìn)入到培養(yǎng)液中，更多的小分子，如電解質(zhì)被釋放[25]，這些離子的流失會影響細(xì)胞內(nèi)多種生物酶的合成和工作，使細(xì)胞的代謝活動受阻，此外，離子的流失也會影響細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，使細(xì)胞破裂，最終導(dǎo)致菌體死亡[26]。Liu等[27]研究也發(fā)現(xiàn)殼聚糖的抑菌作用是通過增加菌膜的通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外滲實(shí)現(xiàn)的。對于黃曲霉，經(jīng)MIC 及2MICCOS 溶液處理后，電導(dǎo)率與對照組相差較大，電導(dǎo)率的增加更為顯著，即COS易導(dǎo)致黃曲霉細(xì)胞內(nèi)成分的泄漏，可能是抗菌成分與胞質(zhì)膜相互作用所致[28]。這3 種真菌的電導(dǎo)率改變不一樣可能與同一COS 處理時(shí)不同成分和細(xì)胞膜結(jié)合位點(diǎn)的作用有關(guān)[29]。

表4 COS 對真菌電導(dǎo)率的影響Table 4 Effects of COS on the electrical conductivity of fungi

2.7 COS 對真菌核酸泄露值的影響

細(xì)胞膜是多數(shù)抑菌劑的作用位點(diǎn)，抑菌劑與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用導(dǎo)致細(xì)胞膜的功能發(fā)生改變，通過測定260 nm 處的吸光度值，可以對COS對真菌的細(xì)胞膜的通透性進(jìn)行推測[12]。在260 nm下，通過測定不同溶度的COS 溶液處理后的真菌菌液的吸光值，了解COS 溶液對真菌核酸泄露的影響，吸光值越大說明核酸泄露越多。

COS 對3 種真菌核酸泄露的影響結(jié)果如表5所示。從表5 可以看出，與對照組相比，COS 濃度為MIC、2MIC 的處理組菌液吸光值都增大了，其中，當(dāng)COS 濃度為MIC 時(shí)，黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉菌液吸光度值分別增大了0.149，0.084，0.110，當(dāng)COS 濃度為2MIC 時(shí)，黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉菌液吸光度值分別增大了0.242，0.124，0.183，即菌液的吸光值與COS 濃度成正比。吸光度增大可能原因是加入多糖后，可以增加菌體細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞溶出物顯著增加，對膜結(jié)構(gòu)造成不可修復(fù)的傷害，多糖濃度越高，傷害越大[30]。有研究表明，殼聚糖的低聚物能進(jìn)入大腸桿菌內(nèi)部[24]，殼聚糖存在的大量陽離子基團(tuán)NH3+能夠與菌外膜上帶負(fù)電的脂多糖、磷脂、脂蛋白等反應(yīng)，進(jìn)而改變外膜的結(jié)構(gòu)使得外膜的通透性增加[12]。

表5 COS 對真菌核酸泄露的影響Table 5 Effects of COS on nucleic acid leakage of fungi

2.8 COS 對真菌幾丁質(zhì)含量的影響

幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞質(zhì)的重要組成部分，對維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性有重要作用，在正常情況下，幾丁質(zhì)的組成和降解過程是在動態(tài)平衡下進(jìn)行的，這種平衡的紊亂會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。COS 對真菌幾丁質(zhì)含量的影響結(jié)果如圖3，由圖3 可知，當(dāng)黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉經(jīng)過MIC 濃度的COS 處理后，與對照組相比，其幾丁質(zhì)含量分別下降了56.87%，56.34%和39.55%，當(dāng)COS 的濃度為2MIC 時(shí)，跟對照組相比，幾丁質(zhì)含量分別下降了88.12%，81.54%和84.03%，結(jié)果表明，不同濃度的COS 對真菌的幾丁質(zhì)含量有顯著的抑制作用，并且?guī)锥≠|(zhì)含量呈濃度依賴性下降，推測可能原因是，COS 破壞了真菌的幾丁質(zhì)組成和降解過程的動態(tài)平衡，對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性有破壞作用，產(chǎn)生紊亂并導(dǎo)致真菌細(xì)胞的死亡。

圖3 COS 對真菌幾丁質(zhì)的影響Fig.3 Effect of COS on fungi chitin

2.9 COS 對真菌幾丁質(zhì)酶活性的影響

幾丁質(zhì)酶能夠催化細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)水解為幾丁寡糖，破壞細(xì)胞器，從而抑制真菌的生長[12]。通過測定COS 處理的幾種真菌培養(yǎng)液中幾丁質(zhì)酶活性可以推測COS 對真菌的抑菌方式。本試驗(yàn)測定了菌體胞內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活性，不同濃度COS對真菌幾丁質(zhì)酶活性結(jié)果如圖4 所示。

圖4 COS 對真菌幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.4 Effect of COS on chitinase activity of fungi

由圖4 可以看出，與對照組相比，這3 種腐敗真菌經(jīng)COS 處理后其菌體胞內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活性顯著增大，且隨著COS 濃度的增加而增大，呈正相關(guān)關(guān)系。其中經(jīng)過不同濃度的COS 處理后黑曲霉菌體胞內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性由對照組的24.16 U/g升高到54.49 U/g，赭曲霉由對照組的27.82 U/g 升高到47.28 U/g，雜色曲霉由對照組的17.82 U/g 升高到41.20 U/g，黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉在MIC處理后幾丁質(zhì)酶活性較對照組分別增加了46.9%，33.5%，52.6%。研究結(jié)果表明，隨著COS 濃度的增加，幾丁質(zhì)酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)幾丁質(zhì)酶解，最終導(dǎo)致細(xì)胞表皮變薄，阻礙其生長[5]。有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖作為幾丁質(zhì)酶的底物，能激活真菌內(nèi)的幾丁質(zhì)酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞變形使其繁殖受阻[24]，與本研究結(jié)果一致。

2.10 COS 對真菌可溶性蛋白濃度的影響

可溶性蛋白是細(xì)胞重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用[16]。本試驗(yàn)分別用0、MIC、2MIC 不同濃度的COS 溶液來處理幾種真菌，觀察其對真菌可溶性蛋白的影響，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 COS 對真菌可溶性蛋白濃度的影響Fig.5 Effects of COS on the concentration of soluble proteins in fungi

從圖5 可以看出，3 種真菌在經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，處理組的菌絲蛋白濃度均與對照組不同，經(jīng)各種濃度的COS 作用的菌絲體之間以及與對照組菌絲體間的可溶性蛋白質(zhì)含量差異顯著。與對照組相比，經(jīng)COS 處理后真菌菌絲內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)大量外滲，且COS 濃度越高，外滲量越高，菌絲體內(nèi)濃度越低，即隨COS 濃度的增大，菌絲體內(nèi)可溶性蛋白濃度呈降低的趨勢，其中，經(jīng)過不同濃度的COS 處理后黑曲霉的可溶性蛋白濃度由對照組的1.07 μg/μL 降低到0.60 μg/μL，赭曲霉由對照組的1.08 μg/μL 降低到0.74 μg/μL，雜色曲霉由對照組的1.55 μg/μL 降低到0.95 μg/μL，黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉MIC 處理組可溶性蛋白濃度較對照組分別降低了32.0%，24.6%，18.1%，2MIC 處理組可溶性蛋白濃度較對照組分別降低了44.4%，31.4%，38.5%。這說明MIC、2MIC 的COS 使得細(xì)胞已經(jīng)破損，使其可溶性蛋白的合成受到影響，或者是因?yàn)镃OS 破壞了菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使可溶性蛋白通過細(xì)胞膜滲出，造成3 種真菌菌絲可溶性蛋白質(zhì)的嚴(yán)重流失。

3 結(jié)論

本文探討了COS 對黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉的抗菌活性及機(jī)理。研究得到結(jié)論如下：COS 對供試菌的抑菌質(zhì)量濃度范圍在15.6～31.2 mg/mL，COS 處理導(dǎo)致菌絲體變形、膜透性增加、漿膜損傷和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物滲漏，COS 還呈劑量依賴性地減少幾丁質(zhì)的產(chǎn)生，增強(qiáng)幾丁質(zhì)酶的活性，并導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)大量外滲。這些特性表明COS 可以通過破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜以及破壞正常的細(xì)胞代謝來抑制食物腐敗真菌生長。此外，COS 對人和動物無毒，在食品工業(yè)中的應(yīng)用前景廣闊。