張和平，高廣琦

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室 呼和浩特 010018）

益生菌是一類活性微生物，當攝入量足夠時，對宿主健康有益[1]。近年來，大量研究揭示了益生菌的健康益處，包括有效緩解或改善便秘、腹瀉、炎癥性腸病、腸易激綜合征、食物過敏、心血管疾病以及癌癥等多種代謝性疾病[2]。正因如此，益生菌在保健、醫(yī)療和食品工業(yè)中得到廣泛應用。然而，盡管益生菌市場日益繁榮，我國市場上絕大多數(shù)益生菌產品還是以外國菌株為主。發(fā)展具有自主知識產權的本土菌株，以更精準地維護中國人腸道健康，既是當務之急，也是提高我國益生菌市場競爭力的關鍵。

乳酸菌是益生菌家族的重要成員，廣泛分布于土壤、水體、植被以及人類和動物的腸道等環(huán)境中[3]。目前，我國仍使用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術從自然界分離和篩選具有益生潛力的乳酸菌，再通過高密度發(fā)酵等技術將其商品化。然而，這種方法策略面臨兩大問題：一是篩選過程耗時耗力，投入成本高；二是高密度發(fā)酵和產業(yè)化技術相對滯后。這兩個問題嚴重阻礙了我國益生乳酸菌產業(yè)的發(fā)展。

隨著基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等高通量技術的快速發(fā)展，乳酸菌遺傳、代謝、生長和衰亡機制，以及益生功能相關基因被深入研究。利用這些基因組數(shù)據和人工智能技術，建立更精準的益生乳酸菌篩選技術，將極大地推動益生乳酸菌資源的開發(fā)和產業(yè)化進程。

1 益生乳酸菌篩選技術概述

益生菌發(fā)揮其益生功能的前提，是它們必須能在消化道苛刻的環(huán)境中生存和定植。消化道中高酸度（pH 1.5～4.0）的胃酸、具有抑菌活性的膽汁鹽以及各種消化酶[4]，對乳酸菌來說，既是生存壓力，也是篩選其作為優(yōu)質益生菌的重要指標。聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）在2003 年聯(lián)合發(fā)布的《食品益生菌評價指南》中明確指出，必須對益生菌的耐酸、耐膽鹽能力進行評價。這種評價乳酸菌耐受消化道酸性和膽汁鹽的篩選方法通常在體外進行。一般認為，可用的、具有益生潛質的乳酸菌需要先后在人工胃液（0.3%胃蛋白酶，pH2.5）條件下耐受3 h，在人工腸液（0.1%胰蛋白酶，1.8%膽鹽，pH 8.0）條件下耐受8 h 后仍具有較高的存活率，以此作為耐受胃腸液的衡量標準。

遵循以上標準，國際上已成功篩選出多株益生菌。其中，最出名的是動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12 株（Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12，BB-12）和鼠李糖乳桿菌GG 株（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）。這兩株菌不僅在腸道環(huán)境中表現(xiàn)出出色的生存和定植能力，還被證明具有多種健康益處。比如，BB-12 被報道能夠調節(jié)腸道菌群，提高機體免疫力，緩解特應性濕疹的癥狀，促進嬰幼兒免疫系統(tǒng)的成熟和降低輪狀病毒和呼吸道感染率[5]。LGG 被證明能改善腸胃道功能，緩解便秘和腹瀉癥狀，刺激機體免疫力，預防呼吸道感染和齲齒，排除毒素和促進有益菌生長[6]。

總體來看，傳統(tǒng)的益生乳酸菌篩選技術雖有一定的成效，但效率低、耗時長，并可能遺漏某些有益菌株。隨著現(xiàn)代生物技術，尤其是高通量基因組學技術的發(fā)展，開發(fā)更精準、更高效的篩選技術十分必要。這些創(chuàng)新手段或能加速篩選速度，降低經濟成本，并有機會發(fā)現(xiàn)更多未知的益生菌，推進益生乳酸菌的研究和應用進程。

2 基于人工智能的益生乳酸菌精準篩選技術

近年來，得益于測序技術的快速迭代和測序成本的大幅降低，大量乳酸菌基因組序列數(shù)據被上傳并存儲在公共數(shù)據平臺中。目前，美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據庫已公開約6 000 個乳桿菌和雙歧桿菌的基因組序列。同時，一些科研機構還在不斷地收集和建立更大規(guī)模的乳酸菌基因組數(shù)據庫。這些豐富的基因組數(shù)據為乳酸菌科學研究帶來了前所未有的機遇和挑戰(zhàn)。通過利用生物信息學和人工智能技術，研究人員在這海量的基因組數(shù)據中對乳酸菌基因組結構、代謝通路和潛在的功能基因進行全面、深入的分析和挖掘。

在這一領域，Xiao 等[7]及其團隊采用機器學習模型和算法對乳桿菌和雙歧桿菌基因組數(shù)據進行深度解析，并對其腸道定植模式進行準確預測。這不僅為理解益生菌在腸道中的定植行為提供了新的視角，也為挖掘其它益生菌的基因組數(shù)據提供了重要的理論和技術支撐。內蒙古農業(yè)大學研究團隊開發(fā)了一種基于機器學習算法和基因組大數(shù)據的益生乳酸菌篩選和預測平臺。他們對多個益生菌菌株的基因組數(shù)據集進行k-mer 分析，發(fā)現(xiàn)了益生乳酸菌基因組的寡核苷酸組成和特性，并成功建立了益生乳酸菌的預測模型，經降噪處理和k-mer 優(yōu)化，該模型的預測準確率達到97.77%，曲線下面積達到98.00%。在此基礎上，還利用GO、KEGG 和RAST 等數(shù)據庫對益生乳酸菌基因組進行功能注釋，并成功挖掘到與益生特性相關的基因和代謝通路。此外，還發(fā)現(xiàn)益生菌的益生功能并非由單一基因決定，而是由整體的kmer 組成共同影響。為了便于其他科研人員進行益生乳酸菌的快速篩選和研究，該團隊開發(fā)了一個在線且免費的生物信息學篩選工具——iProbiotics[8]。

實際上，在iProbiotics 工具開發(fā)之前，基于基因組數(shù)據篩選益生乳酸菌的理念和方法已有先例。2010 年，內蒙古農業(yè)大學研究團隊成功完成了我國首個乳酸菌——干酪乳桿菌Zhang（Lacticaseibacilluscasei Zhang，LCZ）的全基因組測序。通過對基因組序列進行深度解析，該團隊發(fā)現(xiàn)LCZ 攜帶多個潛在的益生特性基因[9]。在隨后的幾年里，LCZ 的一系列益生功能，如維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)[10]、減輕炎癥反應[11]、緩解過敏癥狀[12]、調節(jié)血脂代謝[13]以及改善急性和慢性腎臟疾病[14]等，在臨床和動物試驗中得到驗證。這項技術的本質是依托乳酸菌種質資源庫，結合公開發(fā)布數(shù)據庫收集的乳酸菌基因組信息，通過生物信息學處理，全面梳理乳酸菌的物種分類、功能基因、培養(yǎng)條件、菌株來源和益生特性等信息，構建乳酸菌基因組大數(shù)據集。利用乳酸菌基因組數(shù)據集中海量的基因、基因結構域和代謝通路注釋結果，基于人工智能方法建立基于菌株基因組特征、代謝特征和生產特性的全新乳酸菌功能基因挖掘方法，明確與益生特性相關的功能基因或位點，構建低噪聲的優(yōu)良益生特性乳酸菌的高通量篩選技術，結合超級計算機平臺優(yōu)化篩選模型的計算效率，為優(yōu)良乳酸菌的篩選提供以數(shù)據為導向的解決方案，挖掘出具有調節(jié)腸道菌群、強化免疫平衡等功能的益生乳酸菌。同時可針對不同乳酸菌菌株耐酸耐膽鹽、抗氧化、抗炎以及降血脂等益生功能的差異性，結合比較基因組學、轉錄組學和代謝組學等多組學聯(lián)用技術解析不同乳酸菌菌株在轉錄水平以及代謝水平的差異，篩選乳酸菌候選益生功能基因。如今，通過使用iProbiotics，內蒙古農業(yè)大學研究團隊從自然發(fā)酵乳制品、自然發(fā)酵食品、母乳、嬰兒糞便等樣品中成功篩選出28 株具有潛在益生特性的乳酸菌。如具有治療急慢性腹瀉[15]、潰瘍性結腸炎[16]、多囊卵巢綜合征[17]功效的乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium lactis V9），具有降解體內有機磷農藥、緩解農藥高暴露誘發(fā)的炎癥反應作用的植物乳桿菌P9（Lactobacillus plantarum P9）[18-19]，具有通過“腸-腦軸”調節(jié)精神健康，緩解阿爾茨海默癥[20]、帕金森[21]等癥狀的乳雙歧桿菌Probio-M8（Bifidobacterium lactis Probio-M8），以及具有免疫調節(jié)、提高抗腫瘤免疫應答作用的鼠李糖乳酪桿菌Probio-M9（Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9）等。這種基于群體基因組學和功能基因精準定位策略的益生乳酸菌人工智能篩選技術，通過超算集群實現(xiàn)了益生菌高效靶向篩選，不僅篩選出具有調節(jié)腸道菌群、強化免疫平衡等功能的益生乳酸菌，而且構建了多維度腸道菌群互作的益生功能評價體系。iProbiotics 的誕生和廣泛應用，標志著我國益生乳酸菌的篩選和評價全面進入基因組時代。

3 益生乳酸菌的高密度發(fā)酵及產業(yè)化技術

益生乳酸菌產業(yè)化的關鍵在于生產盡可能多的活菌。乳酸菌的生長和活性受諸多因素的影響，包括培養(yǎng)溫度、pH 值、營養(yǎng)物質供應等。為了更好地控制這些因素，工業(yè)生產常采用高密度發(fā)酵（High Cell Density Fermentation）技術進行乳酸菌培養(yǎng)。高密度發(fā)酵技術可以精準控制培養(yǎng)溫度、實時調節(jié)pH 值，并向生物反應器及時補充營養(yǎng)物質，以創(chuàng)造最佳的乳酸菌生長環(huán)境。目前，該技術能使乳酸菌的菌體密度達到甚至超過靜態(tài)培養(yǎng)的10 倍以上。此外，針對不同的乳酸菌株，開展個性化的優(yōu)化試驗，如優(yōu)化高密度發(fā)酵的培養(yǎng)條件和調整培養(yǎng)基成分，還可以進一步提高乳酸菌活性。董安利[22]使用單因素實驗和正交試驗，優(yōu)化了乳酸乳球菌乳酸亞種BL19（Lactococcus lactis subsp.lactis BL19）高密度培養(yǎng)基中碳源、氮源、營養(yǎng)因子和緩沖鹽，使BL19 的活菌數(shù)提高了6.07倍。蘇馨[23]不僅優(yōu)化了嗜酸乳桿菌IMAU81186（Lactobacillus acidophil IMAU81186）的培養(yǎng)基成分，還調整了溫度、接種量和pH 值等培養(yǎng)條件，使IMAU81186 的活菌數(shù)提高了7.03 倍。

在益生乳酸菌產業(yè)化過程中，另一大挑戰(zhàn)是如何長期保持菌株活性。由于大多數(shù)益生菌怕水、怕氧、怕熱，工業(yè)生產常采用真空冷凍干燥（Vacuum Freezing Technology）技術把益生菌細胞中95%的水分在低溫和低氧條件下去除，從而使益生菌變成一種極端“干燥” 的狀態(tài)并進入深度休眠。這種狀態(tài)可以暫停益生菌的生命活動，直到水分重新進入細胞，活性才會恢復。因此，真空冷凍干燥技術既保持了益生菌的活性，又提高了其在長期儲藏中的穩(wěn)定性。然而，冷凍干燥過程中的極寒環(huán)境會引起菌體應激反應，導致菌體失活。如何提高乳酸菌在冷凍干燥過程中的存活率，仍然是益生乳酸菌產業(yè)化過程中需要突破的技術瓶頸[24]。通過改變培養(yǎng)條件提高菌株凍干存活率是該領域的研究熱點，例如在針對植物乳植桿菌LIP-1 的研究中，利用亞細胞損傷鑒定流程發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入氨基酸和堿基類物質影響菌株的冷凍干燥存活率。不同的培養(yǎng)條件促使菌株通過增加細胞膜蛋白，調整細胞膜脂肪酸組成成分，增加細胞壁肽聚糖及表層蛋白含量的途徑減少細胞膜和細胞壁的損傷，或通過代謝堿基為DNA 合成提供原料和調節(jié)胞內pH 的方式減少DNA 損傷，以及通過合成生物膜和應激蛋白，使菌株自身獲得更高的冷凍干燥存活率[25]。

近年來，基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組等多組學技術逐漸成為突破益生乳酸菌產業(yè)化瓶頸的關鍵技術。借助多組學技術，研究人員深入探究了乳酸菌在冷凍干燥過程中的應激響應和生理適應機制，找到了與乳酸菌抗寒和生物膜組分調節(jié)相關的基因和蛋白[26-29]，這為開發(fā)乳酸菌冷凍干燥保護技術奠定了重要的理論基礎。王昊乾等[30]從乳清蛋白水解物中篩選出一種具有較強抗氧化活性的多肽，能夠作為凍干保護劑減少真空冷凍干燥過程中對乳雙歧桿菌Probio-M8 的細胞損傷，顯著提高菌種存活率至（88.31±0.02）%，同時還能夠降低胞內活性氧水平并保護細胞活力。此外，通過建立LCZ 不同生長時期的蛋白質表達譜，不同發(fā)酵條件和發(fā)酵階段關鍵基因的表達分析，發(fā)現(xiàn)菌株生長特性與葡萄糖轉運、糖酵解和分子伴侶蛋白等13 個功能基因的表達相關，明確了這些基因在菌株生長中的重要作用，構建了菌株差異化的代謝通路，發(fā)明了不同菌株精準營養(yǎng)的高密度發(fā)酵技術，液體培養(yǎng)活菌數(shù)提高至3.0×1010CFU/mL，突破了高密度發(fā)酵的技術瓶頸，菌體生物量提高了1 個數(shù)量級。此外，通過研究乳酸菌在培養(yǎng)過程中的代謝調控網絡[31-36]，研究者發(fā)現(xiàn)了乳酸菌特殊的營養(yǎng)需求，以及其對某些營養(yǎng)物質吸收和代謝途徑的缺陷[37-39]。基于單細胞層面探索了高密度發(fā)酵和冷凍干燥過程中菌體受損和衰亡的機理，發(fā)現(xiàn)了還原型輔酶Ⅰ氧化酶和氧損傷修復蛋白編碼基因顯著高表達的規(guī)律，明確了細胞膜氧化損傷是益生乳酸菌高密度發(fā)酵、冷凍干燥和儲存過程中菌株衰亡的主要原因。通過添加谷胱甘肽和蛋白水解抗氧化肽，并進行菌體微包膜隔氧干燥處理，維持細胞不飽和脂肪酸比例，減輕自由基對細胞組分的破壞，保護菌體細胞膜完整性，研創(chuàng)了微包膜高效保護的乳酸菌冷凍干燥技術，使活菌得率提高至90%以上，生產出的發(fā)酵劑（制劑）活菌數(shù)在1.5×1012CFU/g 以上[40]。這些發(fā)現(xiàn)為進一步優(yōu)化高密度培養(yǎng)基成分，提高菌體密度提供了新的思路。

4 結語

隨著消費者對健康飲食認知的提升，益生乳酸菌產品逐漸為大眾所知，并得到廣泛的認可。作為全球人口最多的國家，中國益生乳酸菌產業(yè)有巨大的增長潛力，未來或有望成為全球最大的益生菌消費市場。然而，我國當前的益生乳酸菌篩選及產業(yè)化技術落后，也缺乏自主知識產權的益生菌菌株。鑒于此，繼續(xù)提高益生乳酸菌篩選及產業(yè)化技術方面的投入，發(fā)展具有自主知識產權的本土菌株，才能更好地維護中國人腸道健康。此外，也要重視并加強技術創(chuàng)新，充分利用好大數(shù)據以及人工智能等現(xiàn)代技術，著力解決益生乳酸菌產業(yè)化過程中的技術瓶頸，以實現(xiàn)中國益生乳酸菌產業(yè)的高質量、可持續(xù)發(fā)展。