杜敬彩，趙剛，李自云，許國(guó)峰，張成虎*

（1.山東泓達(dá)生物科技有限公司，山東臨沂 276400；2.山東沂蒙山酒業(yè)有限公司，山東臨沂 276400）

衣康酸學(xué)名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸，是不飽和二元有機(jī)酸。因?yàn)橐驴邓岱肿觾?nèi)含一個(gè)不飽和雙鍵，化學(xué)性質(zhì)活潑，可進(jìn)行自聚合，也能與其他有機(jī)物共聚。衣康酸具有兩個(gè)羧基，還可以與醇發(fā)生酯化反應(yīng)。平臺(tái)化合物是指可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為價(jià)值更高的目標(biāo)化工產(chǎn)品的基礎(chǔ)化學(xué)物，2004 年，衣康酸被美國(guó)能源部評(píng)選為12 種最具發(fā)展?jié)摿Φ纳锘脚_(tái)化合物之一[1]。衣康酸酯類是生產(chǎn)腈綸、樹脂、塑料、橡膠、藥物、表面活性劑、無毒食品包裝材料、除草劑、除垢劑、粘著劑、除臭劑、紙張等的工業(yè)原料，廣泛用于化工行業(yè)[2-3]。因此，衣康酸是化學(xué)合成工業(yè)的重要原料，也是化工生產(chǎn)的重要原料。

衣康酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和生物法，相比化學(xué)法生產(chǎn)衣康酸，生物發(fā)酵法具有原料來源豐富、成本較低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、工藝技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，因此生物發(fā)酵法是目前衣康酸生產(chǎn)的主流方向。近年來報(bào)道的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸的主要菌種包括土曲霉[4]（Aspergillus terreus）、玉米黑粉菌[5]（Ustilago maydis）、黑曲霉[6]（Aspergillus niger），這些菌株產(chǎn)生的衣康酸可自主分泌到胞外。目前，土曲霉（Aspergillus terreus）仍然是應(yīng)用最廣泛的衣康酸工業(yè)生產(chǎn)菌株，但菌種產(chǎn)量較低、產(chǎn)酸不穩(wěn)定成為制約衣康酸生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要因素。因此，利用傳統(tǒng)誘變育種或基因重組對(duì)菌種進(jìn)行改良已成為衣康酸生產(chǎn)領(lǐng)域的重要研究方向。

傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法可以促進(jìn)誘發(fā)突變，提高突變率，并且因其便捷、快速、有效等優(yōu)點(diǎn)，迄今為止仍是國(guó)內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變方法不同對(duì)菌株產(chǎn)生的誘變效應(yīng)也不同。如紫外誘變是一種常用的物理誘變因素，可使DNA 形成嘧啶二聚體[7]，而亞硝基胍（NTG）是烷化劑的一種，被喻為“超誘變劑”[8]，它主要在DNA 鏈的復(fù)制區(qū)引起GC →AT 的轉(zhuǎn)換，即使在致死率很低的條件下也能使微生物產(chǎn)生高頻率的突變。單一誘變方法雖可得到高產(chǎn)菌株，但突變概率偏低；復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，比單一誘變效果好[9]。

本研究采用亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變對(duì)本實(shí)驗(yàn)室一株產(chǎn)衣康酸菌株進(jìn)行菌種選育，加大菌株突變率，有效提高高產(chǎn)菌株的選育效率，并對(duì)高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

土曲霉KYK-031，本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）傳代斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，胰蛋白胨1.0 g/L，玉米漿3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 自然。

（2）種瓶培養(yǎng)基：葡萄糖40.0 g/L，硫酸銨5.0 g/L，玉米漿2.5 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硝酸調(diào)pH 值至3.0。

（3）搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖130.00 g/L，硫酸銨5.00 g/L，玉米漿2.50 g/L，硫酸鎂1.00 g/L，磷酸二氫鉀0.50 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，硫酸鋅0.01 g/L，氯化鈣0.50 g/L，硝酸調(diào)pH 值至3.0。

（4）初篩顯色平板培養(yǎng)基：葡萄糖100.00 g/L，硫酸銨5.00 g/L，玉米漿2.50 g/L，硫酸鎂1.00 g/L，磷酸二氫鉀0.50 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，硫酸鋅0.01 g/L，溴甲酚綠0.10 g/L，瓊脂20.00 g/L。

1.1.3 試劑

亞硝基胍，分析純，上海源葉生物科技有限公司；溴甲酚綠，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨，生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米漿，生化試劑，魯洲生物科技（山東）有限公司；瓊脂，生化試劑，上海沃凱藥業(yè)有限公司；酚酞，分析純，天津市北辰區(qū)方正試劑廠；其余試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 儀器與設(shè)備

ZWY-2112B 型恒溫?fù)u床、ZXDP-B2270 型電熱恒溫培養(yǎng)箱和ZHJH-C1112C 型超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZM-80L-Ⅱ型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SBA-40E 型生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單孢子懸液制備

甘油管菌種接種新鮮斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6 ～7 d，待長(zhǎng)出孢子，取出斜面加入6 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.0），用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管立即通過帶濾紙漏斗過濾，調(diào)整孢子懸液的濃度為106個(gè)/mL，得到單孢子懸液[10]。

1.2.2 亞硝基胍（NTG）溶液的制備

使用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.0）配制1 mg/mL亞硝基胍溶液，于暗處振蕩溶解后備用。

1.2.3 亞硝基胍誘變

亞硝基胍溶液與單孢子懸液以1 ∶1 的體積比例混合，30 ℃振蕩20 ～60 min，20 min 時(shí)取樣1 次，之后每10 min 取樣1 次，取樣后立即稀釋1 000 倍終止反應(yīng)；梯度稀釋后，于初篩顯色平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)3 d 后計(jì)數(shù)。未處理的單孢子懸液與pH 6.0的磷酸緩沖液以1 ∶1 的體積比例混合，梯度稀釋后于初篩顯色平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)3 d 后計(jì)數(shù)。

根據(jù)處理前后的孢子數(shù)按公式（1）計(jì)算致死率。根據(jù)Hc 值（變色圈直徑與菌落直徑的比值），處理后的單菌落比處理前的單菌落Hc值高的為正突變菌株，按公式（2）計(jì)算正突變率。

式中：B0和By分別為每1 mL 未處理和誘變處理孢子液中孢子數(shù)；J為每1 mL 對(duì)照組菌液中菌株數(shù)。

1.2.4 紫外誘變

取單孢子懸液8 mL 至直徑為9 cm 的無菌培養(yǎng)皿中，置于磁力攪拌器上，15 W 紫外線下30 cm 處。在正式照射前，應(yīng)先開啟紫外燈預(yù)熱10 ～20 min，待光波穩(wěn)定后，開啟皿蓋和磁力攪拌，分別照射1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min。操作全過程在紅燈下進(jìn)行，避免白熾光。誘變單孢子懸液放入黑暗冰箱中保存1 h，抑制突變體中的修復(fù)酶活，提高誘變突變率。取未照射的制備孢子液和照射后冰箱保存的孢子液各1 mL，梯度稀釋至合適濃度，取0.1 mL 單孢子懸液均勻涂布于初篩顯色平板，于37 ℃避光培養(yǎng)3 d。計(jì)算致死率和正突變率。

1.2.5 亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變

以亞硝基胍和紫外線誘變的最佳參數(shù)進(jìn)行復(fù)合誘變。取經(jīng)亞硝基胍誘變的單孢子懸液8 mL 至直徑為9 cm 的無菌培養(yǎng)皿中，進(jìn)行紫外誘變，稀釋分離后涂布于初篩顯色平板，于37 ℃避光培養(yǎng)3 d。根據(jù)孢子液中活孢子數(shù)和Hc 值，以未經(jīng)處理的單孢子懸液為對(duì)照，計(jì)算致死率和正突變率。

1.2.6 篩選方法

（1）平板初篩

衣康酸單菌落生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生衣康酸，滲透進(jìn)周圍培養(yǎng)基中，導(dǎo)致pH 降低，初篩顯色平板在溴甲酚綠酸堿指示劑的作用下，藍(lán)綠色的平板上產(chǎn)生黃色變色圈，根據(jù)初篩顯色平板上的Hc 值，選取10%的高產(chǎn)菌株傳代于試管斜面培養(yǎng)基，37 ℃下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d 進(jìn)入復(fù)篩。

（2）搖瓶復(fù)篩

將平板初篩獲得菌株斜面孢子接種瓶培養(yǎng)基，37 ℃下200 r/min 回旋式搖床培養(yǎng)36 h，按10%接種量轉(zhuǎn)接搖瓶培養(yǎng)基，500 mL 三角瓶裝液量為60 mL，每株菌株做3 個(gè)平行，在37 ℃下200 r/min 回旋式搖床培養(yǎng)3 d。

（3）誘變篩選路線

根據(jù)選定誘變條件，確定如下誘變路線[11]。第一輪：以土曲霉HYK-031 為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后，初篩顯色平板上根據(jù)Hc 值從500 株顯色菌株進(jìn)行初篩，選取50 株Hc 值較大菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，篩選出5 株高產(chǎn)菌株。第二輪：分別以5 株高產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，每株出發(fā)菌株經(jīng)亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后，分別從初篩顯色平板上長(zhǎng)出的100 株顯色菌株（共500 株）中進(jìn)行初篩，選取50 株Hc 值較大菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，篩選出5 株高產(chǎn)菌株。第三輪：與第二輪步驟相同。第四輪：與第三輪步驟相同。

1.2.7 高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性考察

將亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后復(fù)篩選育的衣康酸高產(chǎn)菌株，連續(xù)傳5 代，并將5 代全部進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，根據(jù)發(fā)酵結(jié)果確定高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.8 分析方法

（1）衣康酸含量檢測(cè)

發(fā)酵完畢，取出搖瓶加水恢復(fù)至原體積60 mL，取發(fā)酵液用濾紙進(jìn)行過濾后，稱取濾液0.2 g，精確到0.2 mg，用約50 mL 水溶解并全部移入250 mL 錐形瓶中，加酚酞指示液2 ～3 滴，以0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至淡粉色，并保持30 s不褪色為終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V1，同時(shí)做空白試驗(yàn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V2。衣康酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)W按公式（3）計(jì)算。

式中，c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的準(zhǔn)確濃度，mol/L；65.05 為衣康酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；m為試樣的質(zhì)量，g。

（2）糖酸轉(zhuǎn)化率

生物傳感分析儀檢測(cè)初始糖濃度和殘?zhí)菨舛龋撬徂D(zhuǎn)化率按公式（4）計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2007 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)和方差的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝基胍誘變時(shí)間的確定

對(duì)出發(fā)菌株土曲霉KYK-031 進(jìn)行亞硝基胍誘變后，計(jì)算致死率和正突變率，結(jié)果如圖1 所示。亞硝基胍在500 μg/mL 濃度下，隨著亞硝基胍誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸升高，正突變率則先上升后下降。當(dāng)亞硝基胍誘變時(shí)間為40 min 時(shí)，正突變率達(dá)到最高（15%），此時(shí)的致死率為81.6%。因此，選擇亞硝基胍誘變時(shí)間為40 min。

圖1 NTG 誘變的影響

2.2 紫外誘變時(shí)間的確定

對(duì)出發(fā)菌株土曲霉KYK-031 進(jìn)行了紫外誘變后，計(jì)算致死率和正突變率，結(jié)果如圖2 所示。在相同紫外照射強(qiáng)度下，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)致死率逐漸升高，正突變率則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)紫外誘變時(shí)間為2 min 時(shí)，正突變率達(dá)到最高（17.3%），此時(shí)的致死率為75.2%。因此，選擇紫外誘變時(shí)間為2 min。

圖2 紫外誘變的影響

2.3 亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變

對(duì)出發(fā)菌株土曲霉KYK-031 進(jìn)行亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變，選擇亞硝基胍誘變濃度為500 μg/mL，亞硝基胍誘變時(shí)間為40 min，15 W 紫外線照射時(shí)間為2 min，亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后，進(jìn)行致死率和正突變率的計(jì)算。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，致死率達(dá)到93.5%，正突變率也達(dá)到了26.1%，比單一誘變正突變率高。

表1 亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變對(duì)土曲霉的影響

2.4 高產(chǎn)菌株的篩選

以土曲霉KYK-031 為出發(fā)菌株，進(jìn)行三輪亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后，根據(jù)平板初篩和搖瓶復(fù)篩結(jié)果，篩選出5 株衣康酸高產(chǎn)菌株KYK-1035、KYK-1165、KYK-1352、KYK-1483 和KYK-1494，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量結(jié)果如圖3 所示。KYK-1035 菌株搖瓶發(fā)酵衣康酸產(chǎn)量最高，為73.7 g/L，比出發(fā)菌株（41.8 g/L）提高了76.3%，糖酸轉(zhuǎn)化率為63.4%。

圖3 土曲霉突變株產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率

2.5 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性

篩選出的衣康酸高產(chǎn)菌株要符合生產(chǎn)菌株穩(wěn)定性的要求。對(duì)篩選出的衣康酸高產(chǎn)菌株KYK-1035傳代5 次，對(duì)5 代菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，KYK-1035 菌株搖瓶發(fā)酵衣康酸的產(chǎn)量維持在72.4 ～73.9 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率維持在62.6%～63.6%，衣康酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率都較穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性良好。

表2 土曲霉突變株KYK-1035 的遺傳穩(wěn)定性

3 結(jié)論

通過對(duì)衣康酸出發(fā)菌株土曲霉KYK-031 進(jìn)行傳統(tǒng)的化學(xué)、物理誘變，獲得高產(chǎn)衣康酸菌株。分別對(duì)亞硝基胍誘變和紫外誘變的致死率和正突變率進(jìn)行研究，確定了亞硝基胍在500 μg/mL 濃度下的最佳誘變時(shí)間為40 min，15 W 紫外誘變的最佳誘變時(shí)間為2 min。最佳誘變條件下對(duì)土曲霉KYK-031 進(jìn)行亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變，比單一誘變的正突變率更高。進(jìn)行三輪亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變后，篩選出一株衣康酸高產(chǎn)菌株KYK-1035，搖瓶發(fā)酵衣康酸產(chǎn)量水平為73.7 g/L，比出發(fā)菌株（41.8 g/L）提高了76.3%，糖酸轉(zhuǎn)化率為63.4%。對(duì)KYK-1035 菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證，該菌株穩(wěn)定性良好，為今后的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。后期將繼續(xù)對(duì)該菌株進(jìn)行逐步放大優(yōu)化，使其作為生產(chǎn)菌株更適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。