陳永成，陳涵，周倩彤，張卓欣*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東廣州 510630；2.中國科學(xué)院華南植物園，廣東廣州 510630）

石荷葉組（sect.IrregularesHaworth）屬于虎耳草科（Saxifragaceae）虎耳草屬（SaxifragaL.），現(xiàn)組內(nèi)有18 種[1-2]，廣泛分布于東亞地區(qū)，以中國和日本為主要分布區(qū)域[3]。石荷葉組植物均為多年生直立草本；掌狀葉基生，具長柄，葉肉內(nèi)多具碳酸鈣結(jié)晶體，葉背具紫紅色斑點(diǎn)或無；聚傘花序圓錐狀，花兩側(cè)對稱[3-5]。其在形態(tài)上頗為獨(dú)特，是廣受歡迎的園藝植物，也常作為中草藥使用[6-9]?；⒍荩⊿. stolonifera）別名石荷葉，喜生于陰暗潮濕處，其葉中含有巖白菜素、槲皮甙、槲皮素和沒食子酸等活性物質(zhì)，具有治療中耳炎、緩解牙痛、解熱排毒、抑菌消炎等功效，是歷史上沿用已久的中草藥材[10-15]。但民間供藥并不嚴(yán)格按照可藥用種類，藥材種類因地而異，存在用藥普遍卻難以鑒別的問題，特別是虎耳草一類可全草入藥的廣布中藥材，在中藥材炮制過程中丟失部分植物體生活特征，更加難以區(qū)分。

HARA 在《Nova Flora Japonica》中詳細(xì)記錄了5種日本產(chǎn)物種，包括8 變種、4 變型[16]。根據(jù)《中國植物志》第34 卷記載，石荷葉組植物在中國有7 種及3 變種[5]。在《Flora of China》第8 卷中，我國的石荷葉組物種修訂為7 種及4 變種[3]。石荷葉組雖然僅是虎耳草屬中的一個較小類群，但是作為虎耳草屬內(nèi)唯一擁有兩側(cè)對稱花的類群，對于研究整個虎耳草屬起源、演化歷史及形態(tài)分類方面具有重大意義。但自石荷葉組劃分以來，石荷葉組內(nèi)種的數(shù)目和劃分一直存在較多爭議。潘錦堂用葉背具紫紅色或褐色斑點(diǎn)作為蒙自虎耳草（S. mengtzeana）的主要分類特征[3,5]。但虎耳草（S. stolonifera）、大橋虎耳草（S. daqiaoensis）、卵心葉虎耳草（S. epiphylla）及一些新發(fā)表的種也具有葉背面斑點(diǎn)[1-2,4]，而石荷葉組葉片背面斑點(diǎn)的形態(tài)性狀、解剖結(jié)構(gòu)及性狀分布卻未見有進(jìn)一步的研究論述。葉背面斑點(diǎn)具有作為石荷葉組種間分類依據(jù)的潛力，并可能具有一定的生物學(xué)意義。

因此，本研究通過對虎耳草屬石荷葉組的葉表皮斑點(diǎn)形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)研究，對組內(nèi)種類的斑點(diǎn)特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為虎耳草屬的形態(tài)學(xué)分類研究、中藥材鑒定提供一定的理論依據(jù)與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

為了驗(yàn)證葉背面具斑點(diǎn)是虎耳草屬石荷葉組在虎耳草科中特有的一種形態(tài)特征，本研究的取樣范圍擴(kuò)大到狹義虎耳草科。實(shí)驗(yàn)材料為虎耳草科植物葉片16 種、3 變種、1 變型，其中亭閣草屬（MicranthesHaworth）植物2 種、金腰屬（ChrysospleniumTourn.ex L.）1 種、峨屏草屬（TanakaeaFranch. & Sav.）1 種、虎耳草屬山羊臭組（Saxifragasect.CiliataeHaworth）植物5 種和1 變種、虎耳草屬石荷葉組（Saxifragasect.IrregularesHaworth）植物7 種和2 變種、1 變型，具體見表1。葉片取材自臘葉標(biāo)本和野外采集的活體材料，均保存在廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院植物標(biāo)本館（CANT）中。

表1 實(shí)驗(yàn)材料表

1.2 試劑與儀器

番紅，分析純，福州飛凈生物科技有限公司；石蠟，化學(xué)純，德國Leica 公司；無水乙醇，分析純，廣州市政欣化工科技有限公司；二甲苯，分析純，廣州嘉樂化工有限公司；固綠染色液，分析純，福州飛凈生物科技有限公司；FAA 固定液，實(shí)驗(yàn)純，蘭杰柯科技有限公司；樹膠，顯微鏡用級別，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；明膠，分析純，江蘇亞泰化工有限公司；甲醛，分析純，蚌埠市精誠化工有限責(zé)任公司；50%戊二醛，分析純，西安天茂化工有限公司。

RM2235切片機(jī)、EM AMW 組織處理儀、EP CPD300 臨界點(diǎn)干燥器、EM ACE600 真空鍍膜儀、M165C 體視鏡，德國Leica 公司；BX43 普通光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司；EVO MA15 掃描電子顯微鏡，德國Zeiss 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

為了清晰、多角度地觀察葉背斑點(diǎn)的表皮及解剖結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)采用徒手切片法、石蠟切片法和葉表皮常規(guī)染色制片法，使用體視鏡、普通光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡用于觀察。

對所采集標(biāo)本進(jìn)行整理分類后，使用體視顯微鏡（10×10）對虎耳草屬石荷葉組各種類進(jìn)行葉表皮斑點(diǎn)形態(tài)觀察及顯微影像拍攝。取新鮮樣本葉片，在原有方法基礎(chǔ)上使用改良的徒手切片法觀察葉片斑點(diǎn)縱切面的結(jié)構(gòu)和顏色[17]。采用石蠟切片法對新鮮葉片的斑點(diǎn)解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)采用葉表皮常規(guī)染色制片法觀察葉表皮特征[18]。撕取葉上表皮（腹面）和葉下表皮（背面）組織染色制片后在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照并測量，之后玻片封邊保存。為了更好地觀察斑點(diǎn)的表皮結(jié)果，本研究使用掃描電子顯微鏡觀察葉表皮微形態(tài)[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過ImageJ-win 64 對所得各標(biāo)本影像內(nèi)的斑點(diǎn)數(shù)量、大小及密度等指標(biāo)進(jìn)行測量，分析時采取統(tǒng)一視野范圍，像素大小為2 448×1 920。測量斑點(diǎn)數(shù)量時，僅將視野范圍內(nèi)完整斑點(diǎn)視為有效斑點(diǎn)進(jìn)行記錄，邊緣斑點(diǎn)不計(jì)入總數(shù)；斑點(diǎn)大小通過測量圖片內(nèi)所有斑點(diǎn)面積后取其平均值參與后續(xù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析過程；斑點(diǎn)密度為1 mm2內(nèi)的斑點(diǎn)個數(shù)（ind）。

獲取實(shí)驗(yàn)所需葉表皮相關(guān)基礎(chǔ)形態(tài)指標(biāo)后，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s 多重比較方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉斑點(diǎn)形態(tài)結(jié)構(gòu)

使用體視鏡、常規(guī)染色制片法和掃描電子顯微鏡觀察葉腹面和背面表皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在有葉背斑點(diǎn)的石荷葉組植物中，無論斑點(diǎn)是什么顏色，斑點(diǎn)內(nèi)均有聚集成群的氣孔（圖1C、E）；斑點(diǎn)處表皮細(xì)胞明顯小于斑點(diǎn)外表皮細(xì)胞（圖1B、E、F、H）。除黑蕊虎耳草、燈架虎耳草、波密虎耳草和青藏虎耳草在葉片上表皮的氣孔有分布外，其余觀察種在上表皮均無氣孔（表2）。

圖1 石荷葉組葉背面斑點(diǎn)解剖結(jié)構(gòu)

表2 葉斑點(diǎn)與氣孔性狀分布

通過徒手切片及石蠟切片觀察斑點(diǎn)解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，斑點(diǎn)下存在一個較大的氣孔下穴結(jié)構(gòu)（氣室），可能是斑點(diǎn)上面的氣孔群聚在一起而產(chǎn)生；伴有大小不一的晶體聚集在氣室上部，葉背面紫色斑點(diǎn)的色素集中在表皮細(xì)胞層，斑點(diǎn)處細(xì)胞較小（圖1A）。

2.2 葉斑點(diǎn)性狀分布

在石荷葉組中，大橋虎耳草（S. dapiaoensis）、卵心葉虎耳草（S. epiphylla）、蒙自虎耳草（S.mengtzeana）、龍勝虎耳草（S. kwangsiensis）、虎耳草（S. stolonifera）和日本虎耳草（S. nipponica）有斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)，而鏡葉虎耳草（S. fortuneivar.koraiensis）、紅毛虎耳草（S. rufescens）、扇葉虎耳草（S. rufescensvar.flabellifolia）和其他虎耳草科已觀察植物則沒有斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)（表2）。斑點(diǎn)形態(tài)為近橢圓或不規(guī)則形；斑點(diǎn)顏色多樣，主要有淡黃色、淡紫色或紫色、白色、淡褐色。斑點(diǎn)顏色在個體水平會發(fā)生變化，其中虎耳草同一個體或居群有多種顏色的斑點(diǎn)，因此單獨(dú)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。斑點(diǎn)區(qū)域較葉表水平面有凸起、凹陷、平整三種類型（表2）。

根據(jù)石荷葉組具有斑點(diǎn)各種類之間斑點(diǎn)密度差異，對石荷葉組具有斑點(diǎn)的種類進(jìn)行對比（表3）。斑點(diǎn)密度以蒙自虎耳草最小，平均密度為（0.37±0.17） ind/mm2；虎耳草最大，平均密度為（1.88±0.24） ind/mm2；虎耳草葉片上斑點(diǎn)密度顯著大于蒙自虎耳草（P＜0.05），為蒙自虎耳草斑點(diǎn)平均密度的5.08 倍。

表3 虎耳草屬石荷葉組斑點(diǎn)大小與斑點(diǎn)密度

根據(jù)斑點(diǎn)大小及斑點(diǎn)密度差異，將具有斑點(diǎn)特征的石荷葉組各種類進(jìn)行對比（表2，表3）。由表3 可知，6 種具有斑點(diǎn)特征的石荷葉組種類（大橋虎耳草、瓣萼虎耳草、虎耳草、卵心葉虎耳草、蒙自虎耳草、日本虎耳草）在斑點(diǎn)大小這一特征上具有明顯差異。其中，瓣萼虎耳草最小，平均面積為（0.12±0.01） mm2；蒙自虎耳草最大，平均面積為（0.70±0.30） mm2，其斑點(diǎn)顯著大于瓣萼虎耳草（P＜0.05），為萼瓣虎耳草斑點(diǎn)平均面積的5.83 倍。

單獨(dú)對所采集到的虎耳草屬石荷葉組中虎耳草標(biāo)本上新老葉片的斑點(diǎn)大小及斑點(diǎn)密度特征進(jìn)行對比分析（表3），發(fā)現(xiàn)新葉與老葉在斑點(diǎn)大小與斑點(diǎn)密度上具有顯著差異。其中，虎耳草新葉上的斑點(diǎn)大小為0.17 mm2，老葉上斑點(diǎn)大小為0.27 mm2，可知新葉斑點(diǎn)大小顯著小于老葉（P＜0.05）；在斑點(diǎn)密度方面，新葉斑點(diǎn)密度為2.56 ind/mm2，老葉上斑點(diǎn)密度為1.01 ind/mm2，新葉斑點(diǎn)密度顯著大于老葉（P＜0.05）。在同一虎耳草個體中，新葉葉片上斑點(diǎn)顏色呈現(xiàn)出明顯的紫紅色，而老葉上斑點(diǎn)顏色則趨于暗淡，呈淡紅色或淡綠色。

2.3 氣孔結(jié)構(gòu)特征

觀察虎耳草科18 種植物的氣孔長軸取向，其中龍勝虎耳草、扇葉虎耳草、虎耳草、燈架虎耳草、波密虎耳草、山地虎耳草、青藏虎耳草、蒼山虎耳草、峨屏草均為統(tǒng)一朝向，其余均為無規(guī)則（表2）。所觀察的虎耳草科植物的氣孔外形除波密虎耳草的氣孔器為圓形外，其余均為橢圓形（表2，圖1G）。

根據(jù)DILCHER 對植物氣孔器排列類型的定義，無規(guī)則型氣孔復(fù)合體的描述為保衛(wèi)細(xì)胞周圍的鄰近細(xì)胞和一般的表皮細(xì)胞無差異；平列型為兩個副衛(wèi)細(xì)胞完全圍繞著保衛(wèi)細(xì)胞，其長軸與保衛(wèi)細(xì)胞的長軸平行[20-21]。據(jù)此，本文觀察的石荷葉組氣孔復(fù)合體類型是平列型（圖1D、G）。

3 討論與結(jié)論

3.1 葉下表皮斑點(diǎn)的形態(tài)特異性

虎耳草葉片解剖圖像（圖1A、B）表明斑點(diǎn)下存在一個由氣孔復(fù)合成氣孔群產(chǎn)生的較大氣室，這可能是葉表皮斑點(diǎn)凹凸不平的原因。特別是在干燥標(biāo)本上，一般可以觀察到凹入的斑點(diǎn)，可能是葉表皮干燥變形后陷入氣室導(dǎo)致，說明斑點(diǎn)凹凸情況必須要使用新鮮葉片進(jìn)行觀察。在鮮葉上，有的葉片斑點(diǎn)對比下表皮表現(xiàn)為較淺的綠色，也可能是復(fù)合的氣孔下穴內(nèi)有氣體和聚集的晶體，導(dǎo)致反射的光線更多，使斑點(diǎn)顏色泛白。

而紫色或紅色斑點(diǎn)是由表皮細(xì)胞中的色素積累形成的（圖1A）。在同一種虎耳草中，斑點(diǎn)顏色也呈現(xiàn)出不同的顏色，這可能與葉片采摘時間、標(biāo)本保存環(huán)境（溫度、保存時間）及葉片葉齡有關(guān)[22-26]。

虎耳草新葉上斑點(diǎn)顯著小于老葉，而新葉斑點(diǎn)密度則顯著大于老葉，可能與葉片年齡有關(guān)，即隨著葉齡的增大，斑點(diǎn)也隨之增大，進(jìn)而導(dǎo)致單位面積內(nèi)虎耳草葉片上斑點(diǎn)密度降低[26-27]。

在本研究中，斑點(diǎn)中的氣孔復(fù)合體以DILCHER葉表皮特征體系和王宇飛對該體系的翻譯中的術(shù)語稱為平列型氣孔器[20-21]，在其他虎耳草科及相關(guān)物種的葉表皮研究中，該類型被認(rèn)為是無規(guī)則型[28-31]。本研究結(jié)合SEM 和葉表皮染色制片方法，可以更加清晰地觀察到細(xì)胞的界限，因此可以觀察到兩個平行于氣孔的副衛(wèi)細(xì)胞，與前人研究結(jié)果不同。王慧等[28]認(rèn)為由于虎耳草的氣孔復(fù)合體在斑點(diǎn)內(nèi)，而斑點(diǎn)外面表皮細(xì)胞較大，以往對氣孔器術(shù)語在定義虎耳草類群時值得商榷。因此，后續(xù)可以進(jìn)行表皮細(xì)胞發(fā)生觀察，以了解氣孔復(fù)合體分化順序。

3.2 葉下表面斑點(diǎn)的分類學(xué)意義

本研究發(fā)現(xiàn)，8 種虎耳草屬石荷葉組植物中，只有紅毛虎耳草和鏡葉虎耳草沒有葉下表皮斑點(diǎn)，因此《中國植物志》用斑點(diǎn)區(qū)分蒙自虎耳草的論點(diǎn)應(yīng)進(jìn)行修訂[5]。同時，斑點(diǎn)特征（表2、3）有明顯的種間特性，可用于石荷葉的組下分類和物種劃分。

本研究對虎耳草屬石荷葉組具有斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)種類的種間斑點(diǎn)大小關(guān)系進(jìn)行比較得知，石荷葉組種間斑點(diǎn)大小存在顯著差異。除紅毛虎耳草與鏡葉虎耳草無斑點(diǎn)外，石荷葉組各種類間斑點(diǎn)從大到小依次為蒙自虎耳草>大橋虎耳草>卵心葉虎耳草>虎耳草>日本虎耳草>瓣萼虎耳草。其中，蒙自虎耳草的斑點(diǎn)大小為0.70 mm2，顯著大于同組其他種類虎耳草；瓣萼虎耳草斑點(diǎn)大小為0.12 mm2，顯著小于同組其他種類。故斑點(diǎn)大小可以作為虎耳草屬石荷葉組中部分種類（如蒙自虎耳草及瓣萼虎耳草）的分類特征。而石荷葉組各種類間斑點(diǎn)大小可能與其種類自身特性及其生存環(huán)境有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

石荷葉組具有斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)植物種間斑點(diǎn)密度從大到小依次為虎耳草>日本虎耳草>瓣萼虎耳草＞卵心葉虎耳草>大橋虎耳草>蒙自虎耳草。其中，虎耳草葉表皮斑點(diǎn)密度最大，為1.88 ind/mm2，顯著大于實(shí)驗(yàn)所測得石荷葉組其余種類；蒙自虎耳草斑點(diǎn)密度最小，為0.37 ind/mm2，其密度與除虎耳草以外該研究內(nèi)石荷葉組其他種類無顯著差異。在本研究中，斑點(diǎn)密度特征僅可用作區(qū)別虎耳草與蒙自虎耳草的分類特征。

以上所述斑點(diǎn)特征均可以用于虎耳草與近緣種的園藝種和中藥材鑒定。

3.3 斑點(diǎn)與氣孔群的生物學(xué)意義

多數(shù)蛾蝶類昆蟲傾向于在健康葉片上產(chǎn)卵，從而為后代提供更好的生存環(huán)境。部分植物能夠通過改變?nèi)~片部位的形態(tài)來抵御有害昆蟲的侵害，如生長于厄瓜多爾的一種彩葉芋（Caladium steudneriifolium）能夠通過在葉子上產(chǎn)生白色斑紋來模擬病株和蟲害后的形態(tài)，以避免害蟲的啃噬侵害[32]。石荷葉組具有斑點(diǎn)種類可能也通過類似的機(jī)制進(jìn)化出葉表面斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)，從而躲避昆蟲侵害，避免葉片受到損傷，但后續(xù)需要進(jìn)一步的生理學(xué)研究驗(yàn)證該推測。

植物氣孔的分布受環(huán)境影響較大，一般來說，氣孔密度會隨著環(huán)境中水分減少而增加，氣孔面積會隨著環(huán)境中水分減少而呈現(xiàn)小型化發(fā)展[33-35]。氣孔分布面積小而密集能使其在適應(yīng)不同類型氣候時具有更高的靈活性和更廣的適應(yīng)范圍，而氣孔群符合上述植物為適應(yīng)環(huán)境變化所需的氣孔分布類型要求[36]。因此，本研究推測氣孔群作為虎耳草屬石荷葉組的獨(dú)特性狀，可能是使得石荷葉組植物既能夠在低海拔潮濕涼爽的半陰生環(huán)境中有較好的長勢，也能夠在高山、高海拔地區(qū)中生存的重要因素之一。