張艷艷，江賢章*

（1.福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350117；2.工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州 350117）

密碼子是核苷酸三聯(lián)體，而遺傳密碼是指遺傳物質(zhì)存儲(chǔ)遺傳信息的生化指令，由64 個(gè)密碼子組成。遺傳密碼具有簡并性，所有的氨基酸都由2 ～6 個(gè)密碼子以不同的使用頻率進(jìn)行編碼（色氨酸和甲硫氨酸除外），這種現(xiàn)象被稱為密碼子使用偏倚[1]。這種密碼子使用的差異在使蛋白質(zhì)序列保持一致的同時(shí)，也可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的效率與準(zhǔn)確性[2]。造成密碼子使用差異的影響因素有很多，如自然選擇（tRNA豐度、蛋白質(zhì)折疊、基因長度等）、突變壓力（包括GC 含量和堿基的突變位置）以及隨機(jī)遺傳漂變。密碼子使用偏倚在預(yù)測(cè)外源基因的最佳宿主方面具有重要作用，可通過密碼子優(yōu)化來提高外源基因的表達(dá)水平[3]。

類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）屬于紫色非硫細(xì)菌，是目前研究最深入的光合微生物之一，可以產(chǎn)生輔酶Q10 等，已被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，擁有巨大的工業(yè)化開發(fā)潛力[4]。同時(shí)，類球紅細(xì)菌經(jīng)常被用來表達(dá)外源蛋白，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究中。本研究以R. sphaeroides基因組為研究對(duì)象，對(duì)其密碼子使用偏好性進(jìn)行分析，對(duì)在類球紅細(xì)菌中開展合成生物學(xué)研究、改造基盤細(xì)胞、表達(dá)外源基因等具有重要的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 數(shù)據(jù)檢索與處理

在NCBI（美國國家生物信息中心，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）公共數(shù)據(jù)庫中檢索獲得類球紅細(xì)菌2.4.1 基因組，基因組數(shù)據(jù)編號(hào)GCA_000012905.2。主要使用的軟件有Galaxy生物信息學(xué)分析平臺(tái)（https://usegalaxy.org/）、Python 3.9、CodonW 1.4.2、Origin 9.0 等。

1.2 ENC-pot 與PR2-plot 分析

利用Galaxy 的腳本過濾長度小于300 bp 的CDS，收集到3 921 個(gè)CDS。利用中性圖估計(jì)和表征3 個(gè)密碼子（GC1、GC2、GC3）位置之間的密碼子使用模式。以ENC 為縱坐標(biāo)，GC3 為橫坐標(biāo)繪制ENC-plot 進(jìn)行分析。以G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)，A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)繪圖分析[5]。中心點(diǎn)代表無偏度使用時(shí)密碼子的狀態(tài)，其余點(diǎn)與中心點(diǎn)的矢量距離代表其偏倚程度和方向[6]。

1.3 高表達(dá)密碼子分析

RSCU（同義密碼子相對(duì)使用度）代表一個(gè)密碼子的實(shí)際使用頻率與無偏好性時(shí)理論使用頻率間的比值。運(yùn)用CodonW 1.4.2 軟件分析相對(duì)同義密碼子使用度，將RSCU ＞1 的密碼子作為高頻密碼子[7]。根據(jù)ENC 值的大小，取兩極（最大值和最小值）10%的基因建立高、低表達(dá)基因庫，計(jì)算兩庫的差值，將ΔRSCU ≥0.08 的密碼子視為高表達(dá)優(yōu)越密碼子[8]。結(jié)合統(tǒng)計(jì)結(jié)果篩選RSCU ＞1 且ΔRSCU ≥0.08 的密碼子確定為最優(yōu)密碼子[9]。

1.4 密碼子偏好性比較

利用CodonW 分別計(jì)算類球紅細(xì)菌與常見的基盤微生物，如大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）以及釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的密碼子使用頻率并進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子中性分析

構(gòu)建了類球紅細(xì)菌2.4.1基因組編碼序列的中性圖，結(jié)果顯示多數(shù)基因分布在對(duì)角線下方（圖1）。GC12的含量分布在0.389 ～0.741 2，GC3 的含量分布在0.411 ～0.957，基因大多分布在對(duì)角線下方，密碼子中GC12 和GC3 之間相關(guān)系數(shù)r為0.128 5。結(jié)果表明類球紅細(xì)菌基因組密碼子受到突變的影響很弱，而自然選擇壓力是導(dǎo)致密碼子偏好性產(chǎn)生的主要原因。

圖1 中性繪圖分析

2.2 ENC-plot 分析密碼子偏好性

由圖2 可知，大部分基因的ENC 觀察值落在曲線下方，偏好性顯著，表明類球紅細(xì)菌密碼子的偏好性主要受自然選擇壓力的影響。為更準(zhǔn)確地估計(jì)觀測(cè)ENC 值和期望值之間的偏差，計(jì)算了（ENCexp-ENCobs）/ENCexp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ENC 值略小于GC3s 的預(yù)期ENC 值，說明突變可能是類球紅細(xì)菌2.4.1 進(jìn)化史上的一個(gè)影響較弱的因素，自然選擇壓力可能在影響密碼子使用模式中發(fā)揮重要作用。

圖2 ENC-plot 曲線

2.3 PR2-plot 分析

利用PR2-plot 繪圖分析了類球紅細(xì)菌2.4.1 基因中氨基酸家族中密碼子第三位堿基A 與T 或G 與C 之間的關(guān)系，結(jié)果如圖3 所示，大部分基因分布在圖的右上方（直線表示中位數(shù)），表明密碼子第3 位A的使用頻率高于T，G 的使用頻率高于C。理論上，如果密碼子的使用模式僅受到突變的影響，則A 與T、G 與C 堿基使用頻率相等。然而，圖3 結(jié)果顯示A 和T、G 和C 的使用存在不均衡，表明類球紅細(xì)菌2.4.1基因組密碼子的使用模式除了受到突變的影響外，還可能受到其他因素，如選擇壓力等的影響。

圖3 PR2-plot 分析

2.4 最優(yōu)密碼子分析

為了分析類球紅細(xì)菌2.4.1 基因組中不同氨基酸的相對(duì)密碼子的使用度，確定同義密碼子的使用模式以及C/G 末端密碼子的首選程度，本實(shí)驗(yàn)計(jì)算了RSCU 值，繪制了RSCU 堆積圖（圖4）。分析表明RSCU ＞1 的密碼子有27 個(gè)，其中G 或C 結(jié)尾的密碼子占85.19%，以G 結(jié)尾的有10 個(gè)，以C 結(jié)尾的有13 個(gè)，說明類球紅細(xì)菌偏愛使用以G 或C 結(jié)尾的同義密碼子。以ENC 值為偏好性標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建高、低表達(dá)庫，分別計(jì)算高表達(dá)和低表達(dá)基因中各密碼子的RSCU 值和ΔRSCU 值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔRSCU 值＞0.3 的共有19 個(gè)密碼子是高表達(dá)優(yōu)越密碼子。選取高表達(dá)優(yōu)越密碼子與高頻密碼子結(jié)合分析，將其共有的密碼子定義為最優(yōu)密碼子，共有15 個(gè)（CUC、CUG、AUC、GUG、CCG、ACC、GCC、CAG、AAC、AAG、GAC、GAG、UGC、UGA 和GGC）。在這15個(gè)最優(yōu)密碼子中，除了UGA 是終止密碼子外，其余密碼子全都以G 或C 結(jié)尾，進(jìn)一步表明了類球紅細(xì)菌中的密碼子使用偏向于G 或C 結(jié)尾的同義密碼子。

圖4 相對(duì)密碼子使用堆積圖

2.5 與其他基盤微生物密碼子偏好性的比較

將類球紅細(xì)菌基因組密碼子使用頻率分別與常見的基盤微生物，如大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌及釀酒酵母的密碼子使用頻率進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中分別有27 個(gè)和26 個(gè)密碼子使用頻率與類球紅細(xì)菌2.4.1 密碼子使用頻率差異倍數(shù)大于2 或者小于1/2，而密碼子使用頻率差異倍數(shù)大于3 或者小于1/3 的密碼子分別有16 個(gè)（占25.0%）和17 個(gè)（占26.6%）。以類球紅細(xì)菌為基盤細(xì)胞，表達(dá)來自大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌的基因時(shí)，需注意對(duì)Glu、Arg、Pro、Ser 以及Gly 等幾個(gè)氨基酸密碼子的優(yōu)化。釀酒酵母中有38 個(gè)密碼子的使用頻率與類球紅細(xì)菌密碼子使用頻率差異倍數(shù)大于2 或者小于1/2（占59.4%），有27 個(gè)密碼子的使用頻率差異倍數(shù)大于3 或者小于1/3（占42.2%），有9 個(gè)密碼子使用頻率差異倍數(shù)大于10 或者小于1/10。結(jié)果說明類球紅細(xì)菌與釀酒酵母的密碼子使用頻率差異較大，在表達(dá)類球紅細(xì)菌中表達(dá)來自釀酒酵母的基因時(shí)，需要考慮整體密碼子偏好性對(duì)基因表達(dá)的影響，反之亦然。

3 結(jié)論

隨著合成生物學(xué)的興起，在基盤細(xì)胞中表達(dá)多個(gè)外源基因，構(gòu)建新的代謝通路，調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，成為合成生物學(xué)研究的主要方向。類球紅細(xì)菌具有重要的開發(fā)前景，因此研究類球紅細(xì)菌密碼子使用偏好性，對(duì)人工合成外源基因，使之在類球紅細(xì)菌中高效地表達(dá)，具有重要的意義。本文通過對(duì)類球紅細(xì)菌基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在類球紅細(xì)菌使用頻率較高的27 個(gè)密碼子中，以G 或C 結(jié)尾的密碼子占85.19%。同時(shí)，在15 個(gè)高表達(dá)優(yōu)越密碼子中，除了終止密碼子外，其余密碼子全都以G 或C 結(jié)尾，說明類球紅細(xì)菌偏愛使用以G 或C 結(jié)尾的密碼子。通過研究分析得到類球紅細(xì)菌基因組密碼子使用的偏好性主要受到選擇壓力的影響。最后經(jīng)過ENC 差異分析構(gòu)建了類球紅細(xì)菌高低表達(dá)基因庫，確定了19 個(gè)高表達(dá)優(yōu)越密碼子和15 個(gè)高表達(dá)最優(yōu)密碼子。