楊 鑫，王曉蕾，楊孟麗，張紅偉，樊 騰，馬聞苛，楊明月，高寧寧，殷 婕，郭自偉，張雪瑩，王玉淼，李 麗，岳修勤

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科,河南 衛(wèi)輝 453100;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院麻醉科,北京 100050)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。及時再灌注治療是AMI患者的關(guān)鍵治療策略[1-2],但在血液供應(yīng)重新恢復(fù)的過程中會不可避免地發(fā)生心肌缺血再灌注損傷。在急性心肌梗死的缺血再灌注過程中,氧化應(yīng)激在很大程度上促進了心臟損傷[3-5],因此,可以以活性氧損傷為靶點來減輕心臟急性缺血再灌注損傷。交感神經(jīng)刺激通過激活β腎上腺素受體而增加心率(heart rate,HR)和心肌收縮功能,迷走神經(jīng)刺激通過激活M受體而降低HR和心肌收縮功能。心肌缺血再灌注損傷造成心臟自主神經(jīng)失衡,從而進一步加劇心肌缺血再灌注損傷。研究表明,星狀神經(jīng)節(jié)阻滯具有減少缺血再灌注損傷、促進心肌功能恢復(fù)的積極作用[6-7]。本研究通過觀察心肌缺血再灌注模型大鼠星狀神經(jīng)節(jié)阻滯前后HR、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)水平以及心肌酶、氧化產(chǎn)物、抗氧化酶水平的變化,探討星狀神經(jīng)節(jié)阻滯在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡健康Sprague Dawley雄性大鼠30只,體質(zhì)量250～300 g,購自山東省實驗動物中心。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、缺血再灌注組、星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組,每組10只,于室溫20～25 ℃ 環(huán)境中給予充足的食物和水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究通過新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批(編號:2019057)。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛購自青島宇龍海藻公司,大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所;多功能生物信號采集系統(tǒng)、ALC-V8呼吸機購自上海奧爾科特生物有限公司,EP管購自美國KIRGEN公司,酶標儀購自美國Thermo Scientific公司,恒溫培養(yǎng)箱購自德國Heraeu公司,14、18號血管鉗購自上海眾和天工醫(yī)療器械有限公司,小鑷子購自上海金粒醫(yī)療器械有限公司,小動物撐開器購自海德創(chuàng)業(yè)(北京)生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及干預(yù)

3組大鼠手術(shù)前均禁食12 h,缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠參照王平安等[8]的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型:大鼠術(shù)前腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(300 mg·kg-1)進行麻醉,固定四肢,通過針狀電極測量心電圖;頸部備皮,消毒、鋪巾,氣管插管連接動物呼吸機進行輔助通氣;胸部備皮,消毒、鋪巾,開放胸腔,剝離心包膜暴露心臟,于左心耳與肺動脈圓錐下方2～3 mm處進針,使用6-0絲線結(jié)扎冠狀動脈左前降支30 min,松開結(jié)扎線再灌注120 min;缺血期局部心肌顏色變白、心電圖ST段抬高、T波高聳表明結(jié)扎成功;松開結(jié)扎線后心前區(qū)顏色恢復(fù)紅潤、心電圖ST段回落提示再灌注成功。對照組大鼠用絲線穿過冠狀動脈左前降支但不結(jié)扎,其余手術(shù)步驟同缺血再灌注組。星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠再灌注即刻行星狀神經(jīng)節(jié)阻滯,其余步驟同缺血再灌注組;為保證星狀神經(jīng)節(jié)阻滯效果,采用直視下星狀神經(jīng)節(jié)阻滯:大鼠心肌再灌注前,沿食管旁向足端尋找椎動脈、鎖骨下動脈起始處,見梭形或星狀、1～2 mm大小的淡黃色神經(jīng)團即為星狀神經(jīng)節(jié),使用2.5 g·L-1羅哌卡因0.2 mL注射于星狀神經(jīng)節(jié)外周,再灌注結(jié)束后觀察到大鼠左側(cè)面部霍納綜合征即為星狀神經(jīng)節(jié)阻滯成功。缺血再灌注組10只大鼠中因胸內(nèi)大出血死亡1只,星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組10只大鼠中因損傷肺部死亡1只,2組大鼠的存活率和造模成功率均為90%。整個實驗過程均嚴格按照動物倫理要求操作。

1.3.2 3組大鼠HR、MAP檢測

大鼠麻醉后,在其四肢安裝心電圖導(dǎo)聯(lián),連接多功能生物信號采集系統(tǒng),右頸動脈置管,監(jiān)測并記錄術(shù)前(T0)、缺血30 min(T1)以及再灌注30 min(T2)、60 min(T3)、120 min(T4)時的HR和MAP。

1.3.3 3組大鼠血清心肌損傷標志物檢測

再灌注結(jié)束后,通過大鼠右頸動脈留取動脈血5 mL,置于肝素抗凝采血管中,靜置5 min,3 000 r·min-1離心10 min,用微量槍取上清液分裝到EP管,采用ELISA法檢測血清中 cTnI、CK-MB及LDH水平,按照試劑盒說明書操作;使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值,建立標準曲線,計算cTnI、LDH、CK-MB水平。

1.3.4 3組大鼠心肌氧化應(yīng)激標志物檢測

采血后處死大鼠,留取3組大鼠缺血區(qū)心肌組織,將取自左心室前壁的100 mg心肌組織置于離心管中,加入10倍體積的冰冷磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4),冰上勻漿2 min,3 000 r·min-1離心15 min,收集上清液,采用ELISA法檢測心肌組織中MDA及SOD的表達,按照試劑盒說明書進行操作;使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值,建立標準曲線,計算MDA含量及SOD活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠不同時間點HR和MAP比較

T0時3組大鼠的MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.863,P>0.05)。T1、T2、T3、T4時3組大鼠的MAP比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=94.628、76.462、86.647、121.432,P<0.05);T1、T2、T3、T4時,缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠的MAP均顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);T2、T3、T4時星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠的MAP均顯著高于缺血再灌注組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。T0時3組大鼠的HR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.949,P>0.05)。T1、T2、T3、T4時3組大鼠的HR比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=126.462、168.564、98.678、128.751,P<0.05);T1、T2、T3、T4時,缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠的HR均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);T2、T3、T4時星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠的HR均顯著低于缺血再灌注組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。T1時星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組與缺血再灌注組大鼠的MAP、HR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 3組大鼠不同時間點HR、MAP比較Tab.1 Comparison of HR and MAP of rats among the three groups at different time points

2.2 3組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比較

3組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 58.654、85.461、221.202,P<0.05)。缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB 水平均顯著低于缺血再灌注組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 3組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比較Tab.2 Comparison of serum cTnI,LDH and CK-MB levels of rats among the three groups

2.3 3組大鼠心肌組織中MDA含量及SOD活性比較

3組大鼠心肌組織中MDA含量及SOD活性比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=54.622、53.507,P<0.05)。 缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠心肌組織中MDA含量顯著高于對照組,SOD活性顯著低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠心肌組織中MDA含量顯著低于缺血再灌注組,SOD活性顯著高于缺血再灌注組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 3組大鼠心肌組織中MDA含量及SOD活性比較Tab.3 Comparison of MDA content and SOD activity in myocardial tissue of rats among the three groups

3 討論

冠狀動脈閉塞時,閉塞處遠端心肌供血減少可導(dǎo)致組織損傷。雖然早期、成功建立再灌注是改善急性心肌缺血后臨床結(jié)果的最有效治療策略,但在缺血一段時間后,缺血心肌血流的恢復(fù)和再灌注卻會導(dǎo)致更多損傷的發(fā)生,這種不可逆損傷被稱為心肌缺血再灌注損傷,其所導(dǎo)致的心肌梗死面積占心肌梗死最終面積的50%[9]。研究認為,心肌損傷主要與活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生增加有關(guān)[10]。在正常心肌組織中,體內(nèi)氧化還原過程處于平衡狀態(tài),當氧化應(yīng)激時,ROS生成增多,過量的ROS可以導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化將蛋白質(zhì)氧化為非活性狀態(tài)并導(dǎo)致DNA鏈斷裂,從而破壞細胞,最終導(dǎo)致心肌損傷。目前,臨床上星狀神經(jīng)節(jié)阻滯技術(shù)在輔助治療心臟電風(fēng)暴、減輕心肌損傷等方面有大量報道[11-14]。星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對心肌缺血損傷或其他氧化應(yīng)激有明顯的抗氧化作用,其抑制氧化應(yīng)激可能是一種安全有效的臨床實踐,并可為避免不良心血管反應(yīng)提供一種簡便易行的方法。本研究通過觀察心肌缺血再灌注模型大鼠星狀神經(jīng)節(jié)阻滯前后HR、MAP以及血清心肌酶、氧化產(chǎn)物、抗氧化酶水平的變化,探討星狀神經(jīng)節(jié)阻滯在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的保護作用,旨在為臨床治療心肌缺血再灌注損傷提供新思路。

心肌氧耗的多少主要由HR、心肌收縮力、心室壁張力所決定,臨床上常用HR與收縮壓乘積估算心肌耗氧量的相對水平。心動過速可縮短冠狀動脈血流灌注的時間,低血壓可降低心肌組織灌注的壓力,心動過速和低血壓共同作用會對心肌組織的正常血液供應(yīng)造成極大威脅。冠狀動脈搭橋術(shù)中常以HR與收縮壓乘積的標準反映心肌氧耗,在HR收縮壓乘積保持不變時,HR增快對心肌耗氧量的影響更大。心臟血管擴張可有效增加心臟的供血、供氧量,從而緩解心絞痛和心肌缺血狀態(tài),而達到心肌保護作用。有研究顯示,星狀神經(jīng)節(jié)阻滯通過阻斷區(qū)域交感活動,引發(fā)冠狀動脈循環(huán)的改變,并改善血流動力學(xué)[15]。訾聰娜等[16]研究顯示,星狀神經(jīng)節(jié)阻滯可減輕手術(shù)期間MAP、HR波動,維持患者的血流動力學(xué)相對穩(wěn)定,從而有利于減輕應(yīng)激反應(yīng)。YILDIRIM等[17]研究表明,在冠狀動脈搭橋術(shù)中,術(shù)前給予星狀神經(jīng)節(jié)阻滯,可防止橈動脈移植物的血管痙攣,并降低術(shù)中心房顫動發(fā)生率、正性肌力藥物需求和ST段抬高的發(fā)生率,發(fā)揮心肌保護作用。GULCU-BULUT等[18]在大鼠心肌缺血前用星狀神經(jīng)節(jié)阻滯預(yù)處理,結(jié)果顯示,在結(jié)扎和再灌注過程中,星狀神經(jīng)節(jié)阻滯均降低了心律失常的發(fā)生率,并顯著減少了大鼠的心肌梗死面積,證明星狀神經(jīng)節(jié)阻滯可能是一種利用機體自身途徑減少缺血再灌注損傷的合適方法。本研究結(jié)果顯示,T0時3組大鼠的MAP、HR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;T1時,缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組與對照組相比MAP顯著降低、HR顯著上升,提示心肌缺血損傷可造成血流動力學(xué)波動;T2、T3、T4時,缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠的MAP仍顯著低于對照組,HR仍顯著高于對照組;但星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠的MAP顯著高于缺血再灌注組,HR顯著低于缺血再灌注組;提示,星狀神經(jīng)節(jié)阻滯可改善冠狀動脈血液灌注、降低心肌氧耗。

缺血再灌注可通過細胞內(nèi)鈣超載、細胞線粒體能量代謝障礙以及氧自由基損傷等機制,造成心肌細胞損傷或壞死,繼而引發(fā)細胞膜通透性改變,導(dǎo)致心肌細胞胞質(zhì)物質(zhì)(心肌酶和心肌蛋白)釋放入血。心肌酶是臨床檢測心肌細胞損害程度的重要指標。CK-MB廣泛存在于心肌細胞中,是臨床診斷心肌損傷的有效指標。LDH廣泛存在于人體各個組織中,多見于心肌細胞中,冠狀動脈性心臟病患者發(fā)生急性心肌梗死后,隨著冠狀動脈病變支數(shù)的增加,LDH水平逐漸增高,臨床多將LDH應(yīng)用于心肌梗死的診斷。cTnI是反映心肌細胞急性損傷的指標,具有較高特異性,在短時間內(nèi)的心肌缺血刺激下,心臟可大量釋放cTnI,通過對cTnI水平的檢測可有效判斷心肌受損面積,且可作為微小心肌損傷的早期標志物。cTnI和CK-MB是心肌損傷時最敏感的特異性指標,其數(shù)值大小與心肌損傷程度呈正相關(guān)。本研究通過結(jié)扎與再開放大鼠冠狀動脈左前降支造成早期心肌損傷,檢測心肌相關(guān)標志物L(fēng)DH、CK-MB以及cTnI,其中cTnI的升高早于光鏡下病理損傷出現(xiàn)的時間。本研究通過測定大鼠血清心肌酶發(fā)現(xiàn),缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均顯著高于對照組,提示缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠均發(fā)生了缺血再灌注損傷;而星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB 水平均顯著低于缺血再灌注組,表明星狀神經(jīng)節(jié)阻滯可以減少心肌損傷,從而減少心肌相關(guān)標志物的釋放。在正常心肌組織中,體內(nèi)氧化還原過程處于平衡狀態(tài),當氧化應(yīng)激時,ROS生成增多,過量的ROS可以導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,將蛋白質(zhì)氧化為非活性狀態(tài)并導(dǎo)致DNA鏈斷裂,從而破壞細胞,最終導(dǎo)致心肌損傷。脂類受活性氧的攻擊氧化分解為MDA,進而繼續(xù)傷害心肌,進一步擴大心肌缺血損傷,MDA水平能夠反映出心肌受損的嚴重程度。SOD是反映機體抗氧化水平的重要物質(zhì)之一,具有對抗自由基和抵御氧化損傷的作用,對細胞、組織具備保護能力。本研究結(jié)果顯示,缺血再灌注組和星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組MDA水平高于對照組,SOD水平低于對照組,表明缺血再灌注導(dǎo)致大鼠的氧化應(yīng)激水平增高;星狀神經(jīng)節(jié)阻滯組MDA水平低于缺血再灌注組,SOD水平高于缺血再灌注組,表明再灌注前進行星狀神經(jīng)節(jié)阻滯減少了大鼠的氧化應(yīng)激水平。

4 結(jié)論

星狀神經(jīng)節(jié)阻滯能夠改善缺血再灌注大鼠的心肌灌注,通過改善氧化應(yīng)激而減輕心肌缺血再灌注損傷。因此,星狀神經(jīng)節(jié)阻滯可作為減輕缺血再灌注損傷的治療措施。