馬東紅，師晶晶，劉 云，侯玉龍，曹子彧，黎 妞，郭明好

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,河南 衛(wèi)輝 453100)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)發(fā)病率逐年升高,糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是T2DM常見的并發(fā)癥之一,早期主要臨床表現(xiàn)為尿蛋白-肌酐比值(urinary protein-creatinine ratio,UACR)升高。在DN發(fā)病過程中,腎臟局部炎癥反應(yīng)發(fā)揮了重要的作用[1]。白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一種關(guān)鍵的促炎因子,IL-6與DN患者腎組織系膜增生和間質(zhì)損傷程度有關(guān)[2]。白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是由調(diào)節(jié)性T細胞等多種細胞分泌的具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的因子。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)為參與細胞外基質(zhì)沉積、成纖維細胞活化的重要因子,與DN的進展密切相關(guān)[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn),組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDAC)介導(dǎo)的組蛋白乙?；揎椩贒N發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,使用HDACs抑制劑可延緩或逆轉(zhuǎn)DN的進程[5],其中,HDAC4在DN發(fā)病過程中可抑制足細胞自噬并加劇炎癥反應(yīng)[6]。目前,關(guān)于DN發(fā)生發(fā)展過程中IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4表達水平變化及其與臨床指標(biāo)相關(guān)性的研究較少?；诖?本研究旨在探討DN大鼠IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4表達變化及其與血糖、UACR的相關(guān)性,以期為2型DN的治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

64只健康雄性Sprague Dawley大鼠購自山西醫(yī)科大學(xué)生物實驗中心,體質(zhì)量 180～200 g,7～8周齡。

1.2 主要試劑與儀器

高脂高糖飼料購自北京博泰宏達生物有限公司,鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司,放射免疫沉淀裂解液購自福州飛凈生物科技有限公司,十二烷基硫酸鈉、聚偏二氟乙烯膜購自北京索萊寶有限公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自新賽美生物技術(shù)有限公司,脫脂牛奶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,兔多克隆IL-10抗體、鼠單克隆IL-6抗體、兔單克隆TGF-β1抗體、兔多克隆HDAC4 抗體均購自英國Abcam公司,電化學(xué)發(fā)光試劑購自廣州捷倍斯科技有限公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,大鼠IL-10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、大鼠TGF-β1ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司,大鼠HDAC4 ELISA試劑盒購自上海扶生實業(yè)有限公司;全波長掃描酶標(biāo)儀、恒溫水浴槽、低溫超速離心機購自美國 Thermo 公司,精密電子天平購自德國 Sartorius公司,移液器購自德國 Eppendorf公司,貝克曼AU5800全自動生物化學(xué)分析儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司,電泳槽、電轉(zhuǎn)移裝置購自上海天能科技有限公司,AlfaEaseFC 成像分析系統(tǒng)購自美國Alfa Innotech Corporation公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及各組干預(yù)措施

采用隨機數(shù)字表法將64只大鼠分為對照組(n=32)和DN組(n=32)。DN組大鼠給予高脂高糖飼料6周后,經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg·kg-1,72 h后,取尾靜脈血測血糖,血糖≥16.7 mmol·L-1表示T2DM模型大鼠制備成功,血糖<16.7 mmol·L-1的大鼠以30 mg·kg-1的劑量再次經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素;T2DM模型大鼠制備成功后,繼續(xù)給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后,收集尿液,應(yīng)用全自動生物化學(xué)分析儀檢測大鼠尿微量白蛋白、肌酐水平,并計算UACR,UACR(mg·g-1)=尿微量白蛋白(mg·L-1)/尿肌酐(μmol·L-1)×8 840 ,UACR≥30 mg·g-1表示DN模型大鼠制備成功,DN模型大鼠造模成功后正常飲食飲水。對照組大鼠正常飲食飲水,經(jīng)腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.3.2 大鼠體質(zhì)量、血糖、UACR及腎臟指數(shù)(kidney index,KI)檢測

于造模后第 0、4、8、12 周分批處死2組大鼠,每次每組分別處死8只。于每次處死前稱大鼠體質(zhì)量;使用羅氏血糖儀及配套試紙檢測大鼠血糖;收集尿液,應(yīng)用全自動生物化學(xué)分析儀檢測大鼠尿微量白蛋白、尿肌酐水平,并計算UACR。大鼠處死后立即取出雙側(cè)腎臟,其中一側(cè)腎臟去除包膜后稱腎質(zhì)量,并計算KI,KI=腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.3.3 Western blot法檢測大鼠腎組織中IL-6、IL-10、TGF-β1和HDAC4蛋白表達

2組大鼠于不同時間點分批處死后,取出一側(cè)腎組織,使用放射免疫沉淀裂解液裂解,研磨勻漿,使用低溫高速離心機4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min,取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度。每孔取 20 μg 蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上,脫脂牛奶室溫封閉l h,滴加IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4、 β-actin一抗,4 ℃孵育過夜。使用含吐溫-20的Tris緩沖液洗膜10 min×3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,采用含吐溫-20的Tris緩沖液洗膜 10 min×5次。采用電化學(xué)發(fā)光法顯色,應(yīng)用AlfaEase FC成像分析系統(tǒng)成像,應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參,以目的蛋白灰度值與β-actin的灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3.4 ELISA法檢測大鼠血清中IL-6、IL-10、TGF-β1和HDAC4水平

2組大鼠于不同時間點分批處死后,立即抽取;心臟血5 mL,置于抗凝管中,離心取上清,-80 ℃保存;采用ELISA法檢測血清中IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4水平,嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠血糖、體質(zhì)量、UACR和KI比較

造模后第 0、4、8、12 周,DN組大鼠血糖水平和UACR均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模后第 0周,2組大鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后第 4、8、12 周,DN組大鼠的體質(zhì)量均顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模后第 0、4周,2組大鼠的KI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后第 8、12周,DN組大鼠的KI顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 2組大鼠血糖、體質(zhì)量、UACR和KI比較Tab.1 Comparison of blood glucose,body weight,UACR and KI of rats between the two groups

2.2 2組大鼠血清中IL-10、IL-6、TGF-β1和HDAC4水平比較

造模后第 0、4、8、12 周,DN組大鼠血清中IL-6、HDAC4和TGF-β1水平均顯著高于對照組,IL-10水平顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組大鼠血清IL-10、IL-6、TGF-β1和HDAC4水平比較Tab.2 Comparison of serum IL-10,IL-6,TGF- β1 and HDAC4 levels of rats between the two groups

2.3 2組大鼠腎組織中IL-10、IL-6、TGF-β1和HDAC4相對表達量比較

造模后第 0周, DN組大鼠腎組織中IL-10相對表達量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);造模后第 8周,DN組大鼠腎組織中IL-10相對表達量顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);造模后第4、12周,2組大鼠腎組織中IL-10相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后第 0、4、8、12 周,DN組大鼠腎組織中IL-6、HDAC4相對表達量均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模后第 0周,2組大鼠腎組織中TGF-β1相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);造模后第4、8、12周,DN組大鼠腎組織中TGF-β1相對表達量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1和表3。

圖1 2組大鼠腎組織中IL-6、IL-10、TGF-β1和HDAC4蛋白表達(Western blot)Fig.1 Expressions of IL-6,IL-10,TGF- β1 and HDAC4 protein in renal tissue of rats in the two groups (Western blot)

表3 2組大鼠腎組織中IL-10、IL-6、TGF-β1和HDAC4相對表達量比較Tab.3 Comparison of relative expression levels of IL-10,IL-6,TGF-β1 and HDAC4 in renal tissue of rats between the two groups

2.4 DN大鼠血清IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4水平與血糖、UACR的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示, DN組大鼠血清IL-6、TGF-β1水平與血糖呈正相關(guān)(r=0.614、0.514,P<0.05),血清IL-10水平與血糖呈負相關(guān)(r=-0.448,P<0.05),血清HDAC4水平與血糖無顯著相關(guān)性(r=-0.177,P>0.05)。DN組大鼠血清IL-6、TGF-β1水平與UACR呈正相關(guān)(r=0.405、0.470,P<0.05),血清IL-10、HDAC4水平與UACR無顯著相關(guān)性(r=-0.134、-0.124,P>0.05)。

3 討論

DN是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一,其發(fā)病機制復(fù)雜。腎臟局部炎癥在促進 DN 的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用,其涉及到炎癥細胞、炎癥因子和多種蛋白激酶[7]。

本研究結(jié)果顯示,造模后第 0、4、8、12 周,DN組大鼠血糖水平及UACR均顯著高于對照組,證明DN組大鼠DN模型造模成功。本研究結(jié)果顯示,造模后第 0周,2組大鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;造模后第 4、8、12 周,DN組大鼠的體質(zhì)量均顯著低于對照組,原因可能為DN模型大鼠機體不能充分利用葡萄糖,通過加速脂肪和蛋白質(zhì)的分解來補充能量,從而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)大量消耗,出現(xiàn)體質(zhì)量下降,也進一步證明了大鼠DN模型造模成功。 造模后第 0、4周,2組大鼠的KI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明DN早期盡管高血糖可引起體質(zhì)量逐漸下降,但對腎質(zhì)量無明顯影響;造模后第 8、12周,DN組大鼠的KI顯著高于對照組,說明隨著時間延長高血糖可促進DN模型大鼠腎臟肥大,加速腎臟損傷,也進一步證明了大鼠DN模型造模成功。

IL-10是一種由多種免疫細胞如B細胞、肥大細胞、粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和多種T細胞產(chǎn)生的關(guān)鍵抗炎介質(zhì)[11]。IL-10可顯著抑制腎小球系膜細胞增殖和巨噬細胞浸潤[12]。MU等[13]研究發(fā)現(xiàn), IL-10能夠減輕慢性腎臟病大鼠腎臟纖維化。JIN等[14]研究發(fā)現(xiàn),IL-10缺乏的小鼠會出現(xiàn)嚴重腎小管損傷,并伴隨有炎癥和促纖維化標(biāo)志物的增加,以及膠原沉積。本研究結(jié)果顯示,造模后第 0、4、8、12 周,DN組大鼠血清中IL-10水平顯著低于對照組;造模后第 0周DN組大鼠腎組織中IL-10相對表達量顯著高于對照組,造模后第8周DN組大鼠腎組織中IL-10相對表達量顯著低于對照組;此外,DN組大鼠血清IL-10水平與血糖呈負相關(guān);說明,DN進展過程中大鼠血清和腎組織中IL-10表達量較低,且可能介導(dǎo)了腎臟炎癥反應(yīng)和纖維化。

腎臟局部炎癥可以激活TGF-β1/Smad信號通路,從而促進DN患者腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)沉積[15-16],并進一步引起腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎間質(zhì)纖維化[17-19]。表觀遺傳組蛋白修飾和TGF-β1信號通路在調(diào)節(jié)DN腎臟纖維化方面起著重要作用。TGF-β1通過激活組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,使其在腎纖維化基因啟動子上富集,從而促進纖維化基因的轉(zhuǎn)錄,進而促進腎間質(zhì)纖維化的進展[20]。其中,介導(dǎo)組蛋白乙?；腍DAC4在DN發(fā)病過程中起重要作用。HDAC4可通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細胞凋亡,尤其是通過抑制足細胞自噬,促進腎小球病變和蛋白尿排泄[21-22]。本研究結(jié)果顯示,造模后第0、4、8、12周,DN組大鼠血清中HDAC4、TGF-β1水平均顯著高于對照組;造模后第4、8、12周,DN組大鼠腎組織中TGF-β1、HDAC4相對表達量均顯著高于對照組;此外,DN組大鼠TGF-β1水平與血糖、UACR呈顯著正相關(guān);說明,TGF-β1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與DN的發(fā)生發(fā)展過程。HDAC4主要介導(dǎo)足細胞損傷,足細胞是腎小球濾過膜的重要組成部分,足細胞損傷會導(dǎo)致大量蛋白尿。本研究結(jié)果顯示,DN大鼠血清HDAC4水平與血糖、UACR無顯著相關(guān)性,推測與DN造模時間短、UACR水平相對偏低有關(guān)。

4 結(jié)論

DN大鼠IL-6、TGF-β1、HDAC4表達上調(diào),IL-10表達下調(diào);此外,DN大鼠血清IL-6、TGF-β1水平與血糖、UACR呈顯著正相關(guān),血清IL-10水平與血糖呈顯著負相關(guān)。本研究結(jié)果可為DN抗炎治療提供新思路。DN發(fā)生發(fā)展過程較復(fù)雜,涉及代謝、炎癥、纖維化和表觀遺傳學(xué)改變等多種途徑及相互作用,具體作用機制還有待進一步深入探討。