趙娟娟 吳榮榮

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

隨著人們生活水平的提高，對(duì)生鮮乳的需求不斷增加，其質(zhì)量問題倍受消費(fèi)者的重視。在日常生活中，各種包裝的液體乳制品經(jīng)常產(chǎn)生漲包、蛋白分離、存在異味等現(xiàn)象，主要原因是原料乳質(zhì)量不過關(guān)，特別是嗜冷菌總數(shù)過高[1]。

國際乳品聯(lián)合會(huì)將7 ℃及以下依然能生長繁殖的微生物定義為低溫菌，將能在20 ℃及以下生長繁殖，且最適生長溫度在10 ℃～15 ℃的微生物定義為嗜冷菌。在多數(shù)情況下，嗜冷微生物不會(huì)直接引起嚴(yán)重的乳品變質(zhì)現(xiàn)象。但嗜冷菌分泌的蛋白酶和酯酶等代謝產(chǎn)物難以用高溫滅活，在冷藏過程中產(chǎn)生影響食品風(fēng)味的苦味、腐敗味、酸臭味等物質(zhì)或形成凝膠[2,3]。同時(shí)在生產(chǎn)設(shè)備表面形成難以清除的生物膜，對(duì)食品生產(chǎn)可能帶來持續(xù)污染。本項(xiàng)目擬從原料乳中分離出嗜冷微生物中最具代表性的熒光假單胞菌，并對(duì)嗜冷菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)研究嗜冷菌對(duì)乳品品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 鮮牛奶。采自衡水武邑豐犇奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社。

1.1.2 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基A：IDF 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的嗜冷菌檢測用營養(yǎng)瓊脂平板，其組成成分：酵母提取物2.5 g、胰蛋白胨5.0 g、脫脂奶粉1.0 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂10 ～15 g、蒸餾水1 000 ml。培養(yǎng)基B：在培養(yǎng)基A 的成分中加入1I.U.penicillin。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備。超凈工作臺(tái)、生化恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、乳品成分分析儀等。

1.2 嗜冷菌的分離方法。將采集的鮮牛奶置入滅菌的三角瓶中，4 ℃下保藏48 h 后接種于瓊脂平板中，25 ℃下培養(yǎng)48 h 后移接于肉湯培養(yǎng)基中，25 ℃下增菌培養(yǎng)48 h；接入A、B 培養(yǎng)基制成的瓊脂平板中，25 ℃下培養(yǎng)48 h。鏡檢，對(duì)比分菌結(jié)果。

1.3 嗜冷菌的生理生化特性鑒定

1.3.1 形態(tài)染色。按常規(guī)涂片法進(jìn)行革蘭氏染色。

1.3.2 動(dòng)力性實(shí)驗(yàn)。將菌在瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)劃線后刺穿管底，在25 ℃下培養(yǎng)24 h。

1.3.3 41 ℃不生長實(shí)驗(yàn)。熒光假單胞菌可以在4 ℃～37 ℃范圍內(nèi)生長。將純化后的菌株用液體培養(yǎng)基活化過夜，取0.1 ml 涂布，41 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌株是否生長。

1.3.4 乙醇抑菌實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基滅菌后加入8%的無水乙醇。取0.1 ml 活化后的菌液涂布平板后置于25 ℃條件下培養(yǎng)2 d，觀察菌株是否生長。

1.3.5 蛋白酶實(shí)驗(yàn)。熒光假單胞菌能分泌多種蛋白分解酶。配制牛奶培養(yǎng)基，取0.1 ml 活化的菌株涂布平板后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生透明暈圈。

1.3.6 脂酶實(shí)驗(yàn)。熒光假單胞菌能表達(dá)脂肪酶。培養(yǎng)基滅菌后加入1%吐溫-80。取0.l ml 活化的菌株涂布平板后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生暈圈。

1.3.7 過氧化氫實(shí)驗(yàn)。在滅菌載玻片上滴加5%的H2O2，挑取菌株在H2O2溶液中輕輕劃線，觀察是否生成氣泡。

1.3.8 明膠液化實(shí)驗(yàn)。將菌落穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置于25 ℃下培養(yǎng)24 h，取出放入冰箱內(nèi)10 ～30 min，如仍呈溶解狀即為明膠液化實(shí)驗(yàn)陽性，如凝固不溶為陰性。

1.3.9 精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)。將菌落接種于精氨酸雙水解酶生化管，培養(yǎng)基變紅為陽性，仍為黃色為陰性。

1.3.10 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。將菌落分別接種于木糖、甘露糖、果糖、麥芽糖生化管，25 ℃培養(yǎng)24 h 后，如果培養(yǎng)基變黃為陽性，仍為紫色為陰性。

1.3.11 熒光素試驗(yàn)。將細(xì)菌在改良金氏B 瓊脂斜面培養(yǎng)基上端連續(xù)劃線后刺穿管底，于25 ℃下培養(yǎng)24 h，用紫外線燈照射(波長360 nm)，出現(xiàn)黃綠色熒光為陽性。

1.4 嗜冷菌對(duì)乳品品質(zhì)的影響。用乳品成分分析儀對(duì)不同溫度貯藏下的牛乳中的脂肪和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，比較嗜冷菌對(duì)乳品品質(zhì)的影響[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜冷菌的分離。經(jīng)培養(yǎng)可見培養(yǎng)基表面有灰白色菌落生長，邊緣整齊、濕潤，直徑0.5 ～1.5 mm，挑取菌落時(shí)呈黏液狀(如圖1)。移接于肉湯培養(yǎng)基中25 ℃下增菌培養(yǎng)48 h，出現(xiàn)均勻渾濁菌落生長，沿管壁表面有白色菌膜形成(圖2)。從鏡檢結(jié)果可以看出，本實(shí)驗(yàn)所分離得到的嗜冷菌在培養(yǎng)基B 上生長更好，且經(jīng)顯微觀察，菌體形態(tài)更佳。大多數(shù)革蘭氏陰性菌對(duì)青霉素有抵抗能力，再加上分菌前的低溫處理，使得嗜冷菌的生長優(yōu)勢得到了鞏固。所以在分離嗜冷菌時(shí)，應(yīng)進(jìn)行樣品的預(yù)處理，并采用培養(yǎng)基B 配方。

圖1 瓊脂平板分菌

圖2 肉湯增菌

2.2 嗜冷菌的鑒定結(jié)果。分離的嗜冷菌的生理生化特性鑒定結(jié)果見表1。2.3 嗜冷菌對(duì)乳品品質(zhì)的影響。不同貯藏溫度下嗜冷菌對(duì)乳品中脂肪和蛋白質(zhì)含量的影響見表2 ～4?？梢钥闯?，隨著貯藏溫度的升高，嗜冷菌得以在更接近最適生長溫度的環(huán)境下生長，繁殖速度增長明顯，再加上由嗜冷菌釋放的生物酶在較高溫度下活力的增強(qiáng)，乳制品的脂肪含量、蛋白質(zhì)含量都隨貯存天數(shù)的增加而減少，且變質(zhì)速度加快，貨架期明顯變短。

表1 生理生化特性鑒定

表2 5 ℃保藏乳品的變化

表3 10 ℃保藏乳品的變化

表4 15 ℃保藏乳品的變化

3 結(jié)論與討論

利用不同培養(yǎng)基對(duì)生鮮乳中的嗜冷菌進(jìn)行了篩選，確定培養(yǎng)基B 較適宜。通過生理生化特性鑒定，結(jié)果為熒光假單胞菌。用乳品成分分析儀對(duì)不同溫度貯藏下的牛乳中的脂肪和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，乳制品的脂肪含量、蛋白質(zhì)含量都隨貯存天數(shù)的增加而減少，且變質(zhì)速度加快，嗜冷菌對(duì)乳品品質(zhì)存在較大影響。