趙娟娟 吳榮榮

（衡水學院生命科學學院 河北 衡水 053000）

隨著人們生活水平的提高，對生鮮乳的需求不斷增加，其質量問題倍受消費者的重視。在日常生活中，各種包裝的液體乳制品經(jīng)常產生漲包、蛋白分離、存在異味等現(xiàn)象，主要原因是原料乳質量不過關，特別是嗜冷菌總數(shù)過高[1]。

國際乳品聯(lián)合會將7 ℃及以下依然能生長繁殖的微生物定義為低溫菌，將能在20 ℃及以下生長繁殖，且最適生長溫度在10 ℃～15 ℃的微生物定義為嗜冷菌。在多數(shù)情況下，嗜冷微生物不會直接引起嚴重的乳品變質現(xiàn)象。但嗜冷菌分泌的蛋白酶和酯酶等代謝產物難以用高溫滅活，在冷藏過程中產生影響食品風味的苦味、腐敗味、酸臭味等物質或形成凝膠[2,3]。同時在生產設備表面形成難以清除的生物膜，對食品生產可能帶來持續(xù)污染。本項目擬從原料乳中分離出嗜冷微生物中最具代表性的熒光假單胞菌，并對嗜冷菌進行鑒定，同時研究嗜冷菌對乳品品質的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 鮮牛奶。采自衡水武邑豐犇奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社。

1.1.2 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基A：IDF 標準中規(guī)定的嗜冷菌檢測用營養(yǎng)瓊脂平板，其組成成分：酵母提取物2.5 g、胰蛋白胨5.0 g、脫脂奶粉1.0 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂10 ～15 g、蒸餾水1 000 ml。培養(yǎng)基B：在培養(yǎng)基A 的成分中加入1I.U.penicillin。

1.1.3 主要儀器與設備。超凈工作臺、生化恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、乳品成分分析儀等。

1.2 嗜冷菌的分離方法。將采集的鮮牛奶置入滅菌的三角瓶中，4 ℃下保藏48 h 后接種于瓊脂平板中，25 ℃下培養(yǎng)48 h 后移接于肉湯培養(yǎng)基中，25 ℃下增菌培養(yǎng)48 h；接入A、B 培養(yǎng)基制成的瓊脂平板中，25 ℃下培養(yǎng)48 h。鏡檢，對比分菌結果。

1.3 嗜冷菌的生理生化特性鑒定

1.3.1 形態(tài)染色。按常規(guī)涂片法進行革蘭氏染色。

1.3.2 動力性實驗。將菌在瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)劃線后刺穿管底，在25 ℃下培養(yǎng)24 h。

1.3.3 41 ℃不生長實驗。熒光假單胞菌可以在4 ℃～37 ℃范圍內生長。將純化后的菌株用液體培養(yǎng)基活化過夜，取0.1 ml 涂布，41 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌株是否生長。

1.3.4 乙醇抑菌實驗。培養(yǎng)基滅菌后加入8%的無水乙醇。取0.1 ml 活化后的菌液涂布平板后置于25 ℃條件下培養(yǎng)2 d，觀察菌株是否生長。

1.3.5 蛋白酶實驗。熒光假單胞菌能分泌多種蛋白分解酶。配制牛奶培養(yǎng)基，取0.1 ml 活化的菌株涂布平板后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否產生透明暈圈。

1.3.6 脂酶實驗。熒光假單胞菌能表達脂肪酶。培養(yǎng)基滅菌后加入1%吐溫-80。取0.l ml 活化的菌株涂布平板后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否產生暈圈。

1.3.7 過氧化氫實驗。在滅菌載玻片上滴加5%的H2O2，挑取菌株在H2O2溶液中輕輕劃線，觀察是否生成氣泡。

1.3.8 明膠液化實驗。將菌落穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內，置于25 ℃下培養(yǎng)24 h，取出放入冰箱內10 ～30 min，如仍呈溶解狀即為明膠液化實驗陽性，如凝固不溶為陰性。

1.3.9 精氨酸雙水解酶實驗。將菌落接種于精氨酸雙水解酶生化管，培養(yǎng)基變紅為陽性，仍為黃色為陰性。

1.3.10 糖發(fā)酵實驗。將菌落分別接種于木糖、甘露糖、果糖、麥芽糖生化管，25 ℃培養(yǎng)24 h 后，如果培養(yǎng)基變黃為陽性，仍為紫色為陰性。

1.3.11 熒光素試驗。將細菌在改良金氏B 瓊脂斜面培養(yǎng)基上端連續(xù)劃線后刺穿管底，于25 ℃下培養(yǎng)24 h，用紫外線燈照射(波長360 nm)，出現(xiàn)黃綠色熒光為陽性。

1.4 嗜冷菌對乳品品質的影響。用乳品成分分析儀對不同溫度貯藏下的牛乳中的脂肪和蛋白質含量進行測定，比較嗜冷菌對乳品品質的影響[4]。

2 結果與分析

2.1 嗜冷菌的分離。經(jīng)培養(yǎng)可見培養(yǎng)基表面有灰白色菌落生長，邊緣整齊、濕潤，直徑0.5 ～1.5 mm，挑取菌落時呈黏液狀(如圖1)。移接于肉湯培養(yǎng)基中25 ℃下增菌培養(yǎng)48 h，出現(xiàn)均勻渾濁菌落生長，沿管壁表面有白色菌膜形成(圖2)。從鏡檢結果可以看出，本實驗所分離得到的嗜冷菌在培養(yǎng)基B 上生長更好，且經(jīng)顯微觀察，菌體形態(tài)更佳。大多數(shù)革蘭氏陰性菌對青霉素有抵抗能力，再加上分菌前的低溫處理，使得嗜冷菌的生長優(yōu)勢得到了鞏固。所以在分離嗜冷菌時，應進行樣品的預處理，并采用培養(yǎng)基B 配方。

圖1 瓊脂平板分菌

圖2 肉湯增菌

2.2 嗜冷菌的鑒定結果。分離的嗜冷菌的生理生化特性鑒定結果見表1。2.3 嗜冷菌對乳品品質的影響。不同貯藏溫度下嗜冷菌對乳品中脂肪和蛋白質含量的影響見表2 ～4?？梢钥闯觯S著貯藏溫度的升高，嗜冷菌得以在更接近最適生長溫度的環(huán)境下生長，繁殖速度增長明顯，再加上由嗜冷菌釋放的生物酶在較高溫度下活力的增強，乳制品的脂肪含量、蛋白質含量都隨貯存天數(shù)的增加而減少，且變質速度加快，貨架期明顯變短。

表1 生理生化特性鑒定

表2 5 ℃保藏乳品的變化

表3 10 ℃保藏乳品的變化

表4 15 ℃保藏乳品的變化

3 結論與討論

利用不同培養(yǎng)基對生鮮乳中的嗜冷菌進行了篩選，確定培養(yǎng)基B 較適宜。通過生理生化特性鑒定，結果為熒光假單胞菌。用乳品成分分析儀對不同溫度貯藏下的牛乳中的脂肪和蛋白質含量進行測定，結果表明，乳制品的脂肪含量、蛋白質含量都隨貯存天數(shù)的增加而減少，且變質速度加快，嗜冷菌對乳品品質存在較大影響。