馬 賓, 丁瑩梅, 劉曉芬, 朱鈴強(qiáng), 袁 梅△

1南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,衡陽(yáng) 421001 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,武漢 430030

急性缺血性心腦血管疾病缺血再通已證明對(duì)組織具有保護(hù)作用,但再灌注過程本身可以放大細(xì)胞損傷和死亡,它也會(huì)在心外膜、腦組織血流恢復(fù)后產(chǎn)生一定的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)[1-2]。IRI病理生理改變包括氧化應(yīng)激、鈣失衡、線粒體損傷、過度炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和程序性細(xì)胞死亡等,它們互為因果,形成惡性循環(huán)[3],從而損害血運(yùn)重建治療帶來(lái)的臨床益處。生理情況下,細(xì)胞通過一系列轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制保持胞膜內(nèi)外鈣離子濃度差,維持胞內(nèi)低鈣狀態(tài),即鈣(calcium,Ca)穩(wěn)態(tài)。Ca2+是控制細(xì)胞功能的細(xì)胞內(nèi)信使,細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道也是鈣離子功能發(fā)揮的基礎(chǔ),但細(xì)胞內(nèi)鈣超載可能具有潛在毒性并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

Jennings等[4]首先描述了出現(xiàn)在急性缺血性損傷中的鈣超載。后來(lái),廣大研究者認(rèn)識(shí)到,細(xì)胞Ca2+水平的巨大變化是由細(xì)胞質(zhì)膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)和一些細(xì)胞間連接等引起的,再灌注過程介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)Ca2+濃度的過度升高使細(xì)胞出現(xiàn)過度收縮、蛋白酶激活和線粒體衰竭等功能障礙,故調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)被認(rèn)為是控制IRI進(jìn)展的主要因素。在幾十年發(fā)展過程中,對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)聯(lián)的研究日趨深入。本文討論和總結(jié)了IRI發(fā)生時(shí)Ca2+在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的調(diào)控機(jī)制以及對(duì)該機(jī)制的最新見解。

1 細(xì)胞質(zhì)膜鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)

細(xì)胞膜通過各種通道、受體及鈣調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)控制細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外Ca2+之間的平衡,從而維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞表面通道和受體的刺激增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,細(xì)胞質(zhì)膜上存在多種Ca2+通道,包括瞬時(shí)受體電位離子通道(transient receptor potential,TRP)、電壓門控Ca2+通道(voltage-gated calcium channels,VGCC)、鈣敏感受體(calcium-sensing receptor,CaSR)、Na+/Ca2+交換器(Na+/Ca2+exchanger,NCX)和質(zhì)膜Ca2+-ATP酶(protein misfolding cyclic amplification,PMCA)等,這些被認(rèn)為是質(zhì)膜上主要鈣穩(wěn)態(tài)維持器。

1.1 質(zhì)膜CaSR、TRP、VGCC介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流

CaSR是G蛋白耦聯(lián)受體超家族C家族的成員之一。在發(fā)生IRI時(shí),CaSR可被細(xì)胞外細(xì)微的鈣離子含量增多而激活,活化的CaSR可介導(dǎo)激活磷脂酶C系統(tǒng),促使肌漿網(wǎng)釋放鈣離子,細(xì)胞外鈣內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高均受CaSR的調(diào)節(jié)[5]。CaSR已被證明參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞和組織中的炎癥反應(yīng),CaSR異常激活可通過激活絲裂原活化蛋白激酶、磷酸化蛋白激酶-δ易位、鈣超載、Fas受體等通路來(lái)促進(jìn)心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[6-7]。有研究通過構(gòu)建動(dòng)物急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)、大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型和體外糖氧剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R)模型發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷可通過抑制CaSR表達(dá),并增加ERK1/2磷酸化水平達(dá)到對(duì)心臟的保護(hù)作用[8]。黃芪甲苷也可以通過降低大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、減少腦梗死體積和促進(jìn)PC12細(xì)胞活力,以及抑制IRI誘導(dǎo)的cleaved Caspase-3和CaSR的表達(dá)來(lái)緩解IRI。心循環(huán)系統(tǒng)中的多形核中性粒細(xì)胞可通過增強(qiáng)各種酶和細(xì)胞因子的釋放來(lái)?yè)p傷心肌缺血再灌注(I/R)后的組織[9],Zhai等[10]在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了多形核中性粒細(xì)胞可以通過心臟外泌體中特異性的lncRNA3986減少心臟IRI并保護(hù)心肌,源自CaSR激活劑西那卡塞刺激的多形核中性粒細(xì)胞分泌的外泌體減少了心肌梗死面積并改善了心臟功能。也有研究者[11]探索了I/R誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化蛋白-1下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng),它通過單核細(xì)胞趨化蛋白1誘導(dǎo)的蛋白1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和CaSR途徑調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞死亡。Liu等[12]證實(shí)了CaSR激活磷酸化蛋白激酶C-δ在I/R過程中通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。在這些研究中,用到的CaSR抑制劑NPS-2390和NPS-2143參與IRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,但潛在機(jī)制仍不明確。值得進(jìn)一步研究的是,Zhai等[10]以暴露于NPS-2143的PMN中提取外泌體,設(shè)計(jì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),不同組之間的結(jié)果差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,他們懷疑有其他細(xì)胞或物質(zhì)的參與。

TRP是一種Ca2+可滲透的非選擇性離子通道,以M家族M2亞型在IRI中研究最為廣泛[13-14]。TRPM2介導(dǎo)的許多細(xì)胞功能都需要在氧化應(yīng)激下刺激Ca2+內(nèi)流[15]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在IRI中的作用相輔相成,氧化應(yīng)激介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于引發(fā)免疫細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)至關(guān)重要[16],氧化應(yīng)激通過增加二磷酸腺苷核糖焦磷酸酶(adenosine diphosphate ribose,ADPR)和Ca2+的產(chǎn)生間接激活TRPM2。在炎癥過程中,線粒體中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加也使ADPR的產(chǎn)生增加,促進(jìn)了TRPM2介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流[17],進(jìn)一步增加了線粒體中ROS的產(chǎn)生,形成惡性循環(huán)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),在tMCAO模型中,使用TRPM2抑制劑或者將TRPM2敲除小鼠的骨髓移植到野生型小鼠中,可減少M(fèi)CAO后梗死面積[18-19]。Hu等[20]證實(shí)TRPM2缺失減少了ROS依賴性IRI和OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。此研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),腦IRI產(chǎn)生ROS激活TRPM2,進(jìn)而下調(diào)AMPK/mTOR通路,抑制自噬。此外,也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[21],將TRPM2敲除小鼠進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈主干結(jié)扎后再灌注實(shí)驗(yàn)時(shí),TRPM2(-/-)小鼠比TRPM2(+/+)小鼠的I/R后心肌梗死減少更多,提示由TRPM2激活介導(dǎo)的再灌注區(qū)域中性粒細(xì)胞的積累可能在心肌I/R損傷中起關(guān)鍵作用。新近一項(xiàng)研究表明,TRPM2介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流通過Pyk2磷酸化調(diào)節(jié)心臟中線粒體對(duì)Ca2+的攝取,隨后其易位至線粒體,導(dǎo)致線粒體Ca2+攝取增強(qiáng),在IRI中發(fā)揮重要作用[22]。近年來(lái),冷凍電鏡對(duì)TRPM2高分辨率原子結(jié)構(gòu)的完整揭示為開發(fā)更特異和有效的TRPM2抑制劑奠定了基礎(chǔ)[14],TRPM2特異性抑制劑與高度組織/細(xì)胞特異性納米遞送載體的結(jié)合,可以使TRPM2抑制療法在治療缺血性疾病中的應(yīng)用成為可能。

VGCC在離子通道中占有獨(dú)特的地位,它介導(dǎo)的Ca2+通量不僅可以產(chǎn)生動(dòng)作電位,而且VGCC對(duì)Ca2+的選擇性滲透推動(dòng)了細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度的增加,這種濃度僅在離子中觸發(fā)下游信號(hào)通路[23-24]。按照編碼α1亞基的同源序列型,VGCC可分為Cav1、Cav2、Cav3這3個(gè)家族[25],Cav1以L型鈣通道為主,Cav1.2和1.3存在于腦、心臟等多種可興奮細(xì)胞。早有研究表明[26],當(dāng)給予L-VGCC的拮抗劑后,I/R誘導(dǎo)的總蛋白酪氨酸激酶和酪氨酸活性下降,IRI可能是通過N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)和L-VGCC介導(dǎo)的。在體內(nèi)條件下,通過腹膜內(nèi)注射VGCC激活劑和側(cè)腦室內(nèi)注射NMDA,磷酸化AKT和磷酸化CREB等細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)分子均下降,給予相應(yīng)干預(yù)措施后可通過NMDA受體或經(jīng)VGCC的鈣流入激活鈣調(diào)蛋白激酶,進(jìn)而磷酸化GluN2B-Ser1303導(dǎo)致皮層和海馬細(xì)胞死亡[27]。邢影等[28]測(cè)量了腦缺血皮層神經(jīng)元Ca2+變化情況,發(fā)現(xiàn)L-VGCCs電流Ⅰ～Ⅴ曲線呈時(shí)間依賴性,證明了過度開放L-VGCCs與IRI有關(guān)。國(guó)外學(xué)者進(jìn)行了大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與血腦屏障關(guān)系的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)[29],發(fā)現(xiàn)全身給予溶血磷脂酰肌醇可以促進(jìn)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流,增加血腦屏障通透性,但是通過應(yīng)用硝苯地平抑制L-VGCC或在無(wú)Ca2+鹽水中這種內(nèi)流被消除,表明溶血磷脂酰肌醇可通過影響L-VGCC參與血腦屏障破壞。在大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎I/R模型研究中,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素B受體依賴的VGCC的Ca2+內(nèi)流,可以在I/R中誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)變[30]。三甲基錫中毒動(dòng)物模型中,三甲基錫以劑量依賴性方式影響VGCC誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)變化,啟動(dòng)神經(jīng)炎性變化,引起神經(jīng)毒性[31]。

1.2 質(zhì)膜NCX、PMCA介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣外流

鈉鈣交換體(sodium-calcium exchanger,NCX)被認(rèn)為是Ca2+流出質(zhì)膜的重要途徑[32]。NCX有2種工作方式:前向型指將鈉離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)、鈣離子轉(zhuǎn)出細(xì)胞,反向型指將鈣離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)、鈉離子轉(zhuǎn)出細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)Na+升高導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞中NCX反向模式激活在OGD/R后發(fā)揮重要作用[33]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)NCX2和NCX3都與腦缺血有關(guān),NCX3是急性缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)的下游參與者[34-35],敲低和敲除NCX3會(huì)導(dǎo)致tMCAO或pMCAO引起的2種不同缺血模型的局灶性缺血損傷擴(kuò)大[36]。雖然谷氨酸長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是一種神經(jīng)毒素,但它也可以作為ATP合成的中間代謝物,有研究者[37]分析了NCX對(duì)谷氨酸作用的影響,證實(shí)了缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)細(xì)胞中,NCX反向模式活性降低,而谷氨酸限制了這種反向模式以改善經(jīng)受H/R的神經(jīng)元的代謝和存活。在缺血性環(huán)境中,谷氨酸可用作心臟和大腦中的替代能源,NCX可協(xié)調(diào)谷氨酸的代謝,增強(qiáng)ATP供應(yīng)并提高缺血細(xì)胞的活力[38]。給予鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑可通過NCX直接作用于心肌細(xì)胞,限制NLRP3炎性體激活并介導(dǎo)其選擇性自噬,減輕心肌IRI[39]。這些發(fā)現(xiàn)顛覆了谷氨酸為有害因素的傳統(tǒng)觀點(diǎn),未來(lái)應(yīng)將注意力集中在NCX和興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體治療保護(hù)靶點(diǎn)的研發(fā)。

質(zhì)膜鈣泵(plasma membrane calcium pump,PMCA)利用ATP能量主動(dòng)將Ca2+自濃度低的細(xì)胞內(nèi)泵出到濃度高的細(xì)胞外,故稱之為鈣泵[40]。對(duì)于PMCA的研究目前主要集中在神經(jīng)退行性疾病中[41]。PMCA維持基礎(chǔ)細(xì)胞溶質(zhì)水平或少量Ca2+離子進(jìn)入,而NCX負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的大量但短暫的增加,PMCA具有高Ca2+親和力和低容量,NCX具有低Ca2+親和力但具有高離子流出能力,PMCA能與一些細(xì)胞中的NCX協(xié)作,以從細(xì)胞質(zhì)中去除Ca2+。PMCA與IRI的相關(guān)研究較為少見,有研究稱低濃度的小聚芳基化合物金復(fù)雜羧酸抑制PMCA4可顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的血管生成過程,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)小聚芳基化合物金復(fù)雜羧酸可增強(qiáng)缺血后肢體的再灌注,還有研究證明了以PMCA4為靶點(diǎn)進(jìn)行治療可改善缺血性心血管疾病[42]。國(guó)外學(xué)者[43]的研究表明,長(zhǎng)時(shí)間OGD誘導(dǎo)后,CA1神經(jīng)元中編碼PMCA1和PMCA2的基因表達(dá)下調(diào),在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行去極化誘導(dǎo)后,對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放進(jìn)行測(cè)量,發(fā)現(xiàn)咖啡因誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度瞬變的幅度比KCl誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度瞬變的振幅小得多,表明細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+在短暫升高后的去除是由PMCA介導(dǎo)的,此研究揭示了缺氧誘導(dǎo)因子1α驅(qū)動(dòng)的PMCA上調(diào)可能是對(duì)抗海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷的機(jī)制。

2 線粒體鈣

線粒體是一個(gè)巨大的鈣庫(kù),可緩沖大量的鈣負(fù)荷。為防止細(xì)胞鈣超載,線粒體有攝取和釋放鈣途徑,2條攝取途徑包括線粒體Ca2+單轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(mitochondrial calcium uniporter,MCU)單向轉(zhuǎn)運(yùn)和快速攝取模式,3條釋放途徑包括線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)、線粒體Na+依賴性釋放線粒體鈉鈣交換途徑(mitochondria Na+/Ca2+exchanger,mNCX)和線粒體Na+不依賴性釋放途徑(mitochondria H+/Ca2+exchanger,mHCX)[44],這些鈣離子進(jìn)出通道在線粒體維持鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。其中,MCU、mPTP在I/R研究中較為廣泛,mNCX次之。

線粒體通過不斷融合和分裂保持穩(wěn)態(tài)平衡,IRI會(huì)使線粒體分裂增多,過度的線粒體分裂也是造成IRI的原因。IRI期間,通過MCU積累鈣是鈣激活mPTP開放的主要機(jī)制,線粒體總鈣增加可能是mPTP開啟的觸發(fā)因素,mPTP的開放代表了鈣釋放的快速途徑,抑制MCU可減少體外心臟IRI[45-46]。線粒體電子傳遞失衡導(dǎo)致線粒體能量代謝下降在心臟缺血期間維持進(jìn)行性損傷,雖然在再灌注過程中可以恢復(fù)能量代謝,但早期線粒體鈣超載和ROS增加會(huì)促進(jìn)mPTP的打開,導(dǎo)致線粒體膜電位塌陷,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[47]。此外,線粒體上磷酸肌醇3-激酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)已被證明在IRI中發(fā)揮心臟保護(hù)作用,Rameshrad等[48]使用了左前降支結(jié)扎和Langendorff法體外心臟灌注系統(tǒng),證實(shí)大鼠心臟中PI3K/Akt通路的激活降低了心肌氧化應(yīng)激水平并保留了線粒體功能。對(duì)小鼠模型的研究表明,成年心肌細(xì)胞MCU的急性缺失可保護(hù)心臟免受IRI和細(xì)胞死亡[49]。與此同時(shí),過表達(dá)mNCX以增強(qiáng)心肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Ca2+的流出或上調(diào)MCUB亞基以減弱細(xì)胞內(nèi)Ca2+的攝取,可以防止IRI;在mNCX上調(diào)的情況下,即使在永久性心肌梗死后也有收縮功能[50]。此外,心臟有能力上調(diào)這種適應(yīng)性蛋白,以減少IRI。因?yàn)樾呐K缺血損傷后,編碼mNCX和MCUB亞基基因表達(dá)增加,在短期內(nèi)或再灌注24 h后,MICU1的敲除會(huì)加劇I/R誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷,增加梗死面積和凋亡,使收縮功能受損[51],說明MICU1對(duì)MCU的門控特性在I/R中具有保護(hù)作用,終末期缺血性心力衰竭患者的MICU1轉(zhuǎn)錄物也升高[52]。

通過MCU過度攝取Ca2+也是導(dǎo)致腦組織損傷的關(guān)鍵因素,細(xì)胞內(nèi)Ca2+對(duì)線粒體代謝的依賴性影響可以持續(xù)存在,即使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的初始升高消退后,細(xì)胞能量也持續(xù)消耗。在MCAO的大鼠中,I/R導(dǎo)致電子傳遞鏈進(jìn)行性抑制,ATP生成受損,ROS生成增加,導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡,缺血前藥物性抑制可減弱這些變化并減少腦梗死體積,而藥物性激活MCU則會(huì)加劇腦損傷[53]。成年神經(jīng)元中MCU的條件性敲除同樣可以保護(hù)小鼠免受缺氧缺血性腦損傷,并將神經(jīng)元丟失和線粒體損傷降至最低,神經(jīng)元MCU消融也可以減輕與缺氧/缺血性損傷相關(guān)的感覺運(yùn)動(dòng)缺陷[54]。

心臟IRI和神經(jīng)元興奮性毒性細(xì)胞死亡模型已證明MCU蛋白的表達(dá)增加,隨后線粒體內(nèi)Ca2+濃度升高,血液重新進(jìn)入缺血組織后會(huì)產(chǎn)生線粒體活性氧(mROS),氧化應(yīng)激刺激的mROS形成改變了線粒體分裂和融合的動(dòng)態(tài)平衡,急劇升高的mROS導(dǎo)致mPTP開放,引發(fā)細(xì)胞凋亡和線粒體自噬,最終導(dǎo)致再灌注損傷。因此,MCU-mROS-mPTP軸主要調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡途徑,未來(lái)有望靶向MCU-mROS-mPTP軸減輕IRI。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)鈣

肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum/endoplasmic reticulum,SR/ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣儲(chǔ)庫(kù)及調(diào)控系統(tǒng),胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放大量的鈣可觸發(fā)鈣信號(hào)。SR/ER含有一些鈣調(diào)通道和受體,心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中的肌醇1,4,5-三磷酸受體和雷尼丁受體(ryanodine receptor,RYR)主要介導(dǎo)Ca2+釋放,心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA)主要介導(dǎo)Ca2+儲(chǔ)存,SR/ER中鈣離子水平動(dòng)態(tài)平衡才能保證鈣信號(hào)的準(zhǔn)確性。

RyR主要表達(dá)于肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)上和非肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,RyR2是廣泛存在于心肌細(xì)胞SR上介導(dǎo)心肌興奮收縮偶聯(lián)的主要Ca2+釋放通道。在心肌病、心律失常綜合征和心血管再灌注損傷期間,SR上RyR2的異常表達(dá),導(dǎo)致胞質(zhì)Ca2+濃度增加,胞質(zhì)Ca2+的增加進(jìn)而導(dǎo)致VDAC和MCUC介導(dǎo)的Ca2+攝取進(jìn)入線粒體,最終導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放和心肌細(xì)胞死亡。Kushnir等[55]指出,蛋白激酶A、鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ等均參與RyR2的調(diào)控,鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ在細(xì)胞內(nèi)鈣超載時(shí)能夠被Ca2+激活進(jìn)而磷酸化RyR2,誘導(dǎo)RyR2開放。Bovo等[56]研究報(bào)道,IRI后的RyR氧化在β-腎上腺素能受體刺激期間從正性肌力作用到致心律失常作用的轉(zhuǎn)變中至關(guān)重要,同時(shí)用還原劑巰基丙酰甘氨酸處理IRI的心肌細(xì)胞減弱了RyR氧化并降低了β-腎上腺素能受體激活過程中引起的Ca2+濃度升高。有研究者在小鼠心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),RyR2與電壓依賴性陰離子通道相互作用介導(dǎo)鈣離子穩(wěn)態(tài)[57],故單獨(dú)或與RyR2抑制劑聯(lián)合施用VDAC或MCUC抑制劑可能是一種有前景的治療策略。

SERCA是存在于肌肉組織的肌漿網(wǎng)-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣泵攝取通道。心肌和骨骼肌慢肌纖維上存在較為廣泛的是SERCA2a[58],SERCA2a的活性控制著胞質(zhì)中Ca2+再攝取的速度和SR Ca2+貯量,是心肌生理功能的根本保證[59]。由于缺血缺氧使得ATP供給不足,SERCA2a不能將胞質(zhì)中多余的Ca2+泵到肌漿網(wǎng)中,心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性下降,Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度隨即升高,故SERCA2a功能低下是MIRI時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載的重要原因之一。此外,受磷蛋白(phospholamban,PLN)作為SERCA的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子能夠抑制SERCA,Toll樣受體7促進(jìn)cAMP-PKA-PLN通路磷酸化的PLN可增強(qiáng)SERCA的活性,進(jìn)而增加SR中Ca2+攝取的速度,減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載,發(fā)揮心肌保護(hù)作用[60]。有研究證實(shí),SERCA過表達(dá)通過抑制鈣超載、滅活黃嘌呤氧化酶和減少細(xì)胞內(nèi)或線粒體ROS來(lái)恢復(fù)線粒體質(zhì)量控制,外源性黃嘌呤氧化酶或鈣通道激動(dòng)劑的使用消除了SERCA過表達(dá)對(duì)線粒體質(zhì)量控制的保護(hù)作用,并抵消了心臟微血管IRI后SERCA過表達(dá)的有益作用[61]。Li等[62]證實(shí),SERCA的過表達(dá)通過使eNOS和ET-1之間的比值正?；@著減輕I/R誘導(dǎo)的管腔狹窄和血管壁水腫,SERCA過表達(dá)可以通過轉(zhuǎn)錄抑制粘附因子的表達(dá)逆轉(zhuǎn)I/R誘導(dǎo)的微血管中紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,SERCA維持的內(nèi)皮屏障完整性降低了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)心肌的可能性;此研究還發(fā)現(xiàn)SERCA過表達(dá)減弱了細(xì)胞內(nèi)鈣超載,抑制MCU的表達(dá),并防止I/R處理的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中mPTP的異常開放。有研究證實(shí)SERCA調(diào)節(jié)的鈣穩(wěn)態(tài)可能會(huì)影響Ripk3/PGAM5的激活[63]。

4 MAM、CRAC復(fù)合結(jié)構(gòu)

線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)介導(dǎo)兩個(gè)細(xì)胞器之間的雙向通信,它通過一個(gè)復(fù)雜的傳導(dǎo)通道參與鈣離子從SR轉(zhuǎn)移到線粒體。該傳導(dǎo)通道包括雷諾丁受體、三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)、電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)、MCU等。簡(jiǎn)而言之,Ca2+通過IP3R或RyR釋放,線粒體Ca2+被線粒體外膜上的VDAC攝取,后被線粒體內(nèi)膜上的MCU攝取。為促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的鈣離子交換,VDAC1還可通過GRP75與IP3R耦聯(lián)[64],CypD-IP3R-GRP75-VDAC復(fù)合物主要調(diào)節(jié)MAM中的陽(yáng)離子交換,這種復(fù)合物會(huì)隨著其成分被抑制而減少,從而緩解線粒體Ca2+過載并使細(xì)胞免受IRI。Gomez等[65]報(bào)道了糖原合成酶激酶-3β與MAM中的IP3R通道復(fù)合體相互作用,并且抑制該激酶可降低IP3R磷酸化和SR Ca2+釋放,從而減輕Ca2+超載,達(dá)到IRI的保護(hù)作用。關(guān)于PTPIP51、Cyclophilin D、GSK3β、MFN2等MAM定位蛋白在心肌IRI中的作用有較多研究,但機(jī)制仍不明確[66],有待進(jìn)一步研究。

鈣釋放激活鈣通道(calcium-release-activated calcium,CRAC)的組成和激活與鈣感受器基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule1,STIM1)和鈣庫(kù)釋放激活Ca2+通道蛋白1(calcium-release-activated-calcium channel protein 1,Orai1)密切相關(guān)。經(jīng)典的鈣池操縱性鈣通道是由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子感受器蛋白STIM1和質(zhì)膜上Orail鈣離子通道共同介導(dǎo)的。心肌細(xì)胞中STIM1是SR/ER鈣離子感受器,通過感受鈣庫(kù)中Ca2+濃度的變化從而介導(dǎo)CRAC的開放。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭時(shí),STIM1發(fā)生聚合向細(xì)胞膜靠近,并與Orail通道相互作用形成功能性CRAC,促使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,當(dāng)細(xì)胞鈣庫(kù)充盈時(shí),STIM1的活性降低,CRAC通道介導(dǎo)的鈣內(nèi)流減少。有報(bào)道指出,CRAC通道阻斷劑GSK7975A能有效地阻斷鈣庫(kù)耗竭引起的外Ca2+內(nèi)流,降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載[67],起到IRI保護(hù)作用。越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明,STIM和Orai蛋白與大腦和脊髓不同區(qū)域的神經(jīng)元功能有關(guān)[68]。大腦中CRAC通道的功能仍然存在爭(zhēng)議,特定STIM和Orai亞型在不同神經(jīng)元亞群中對(duì)Ca2+信號(hào)的表達(dá)和作用存在矛盾,目前認(rèn)為,神經(jīng)元中的SOCE可能是通過Orai2和STIM2之間的相互作用介導(dǎo)的。據(jù)報(bào)道,STIM2和Orai2 mRNA主要在小鼠大腦中表達(dá),STIM2基因敲除小鼠表現(xiàn)出對(duì)缺血性中風(fēng)的抵抗作用,神經(jīng)元鈣超載和細(xì)胞凋亡減少[69]。同樣,Sun等[70]報(bào)告了STIM2介導(dǎo)的SOCE在通過激活CaMKⅡ維持突觸后棘中的關(guān)鍵作用。Hartmann等[71]對(duì)小腦浦肯野神經(jīng)元中缺乏STIM1的小鼠進(jìn)行研究表明,在IP3介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放、代謝型谷氨酸受體介導(dǎo)的突觸傳遞和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)中需要STIM1參與。該研究組隨后的一份報(bào)告顯示,與Orai1和Orai3 mRNA相比,Orai2 mRNA的表達(dá)最多,并且是IP3R介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放對(duì)代謝型谷氨酸受體刺激的反應(yīng)所必需的,并提示這些神經(jīng)元的儲(chǔ)存再充盈是由Orai2介導(dǎo)[72]。上述研究并未提供神經(jīng)元中ER Ca2+或神經(jīng)元內(nèi)CRAC的直接測(cè)量含量,故Orai2對(duì)神經(jīng)元CRAC通道組成的貢獻(xiàn)值得進(jìn)一步研究。

5 小結(jié)與展望

本文較以往研究和綜述而言,從不同的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)等多方面綜述了鈣代謝與缺血再灌注損傷的關(guān)系,以期為臨床治療缺血再灌注損傷和鈣通道拮抗劑藥物開發(fā)提供借鑒。目前對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)和缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)如何失穩(wěn)態(tài)等復(fù)雜的生物學(xué)過程的理解存在不足,隨著對(duì)缺血再灌注損傷認(rèn)識(shí)不斷加深,引發(fā)了廣大研究者對(duì)鈣相關(guān)知識(shí)的探討和潛在機(jī)制的挖掘。本文總結(jié)了鈣信號(hào)在心腦血管疾病中的已有發(fā)現(xiàn)和新出現(xiàn)的證據(jù),以期引起科研人員的重視,從而深入研究鈣信號(hào)在繼發(fā)性灌注損傷的作用機(jī)制。