杜高輝, 張 青, 魏宇淼

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430022

動(dòng)脈粥樣硬化是由脂質(zhì)驅(qū)動(dòng),多種細(xì)胞共同參與的血管慢性炎癥性疾病,主要發(fā)生于大中動(dòng)脈,是缺血性心臟病和中風(fēng)的主要原因[1]。動(dòng)脈粥樣硬化早期,氧化脂質(zhì)損害并激活內(nèi)皮細(xì)胞,造成內(nèi)皮功能障礙,是動(dòng)脈粥樣硬化病變的起始環(huán)節(jié)。隨后循環(huán)中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下,進(jìn)一步分化為泡沫細(xì)胞,加速斑塊脂質(zhì)核心的形成和擴(kuò)張,與平滑肌細(xì)胞及其分泌物形成的纖維帽共同構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志性病變。近年,中性粒細(xì)胞,特別是中性粒細(xì)胞形成的胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trapping nets,NETs)被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化病程進(jìn)展的重要參與者。NETs直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,招募循環(huán)中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞,加重動(dòng)脈粥樣硬化病變的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致斑塊壞死核心擴(kuò)大和斑塊不穩(wěn)定性增加,嚴(yán)重威脅人體健康[2]。本文從NETs產(chǎn)生,NETs與內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及其他細(xì)胞的相互作用出發(fā),闡明NETs對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病程進(jìn)展的關(guān)鍵作用,為動(dòng)脈粥樣硬化的研究提供新的思路。

1 NETs概述

1.1 NETs的發(fā)現(xiàn)

中性粒細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的主力軍,機(jī)體受到炎癥刺激時(shí),中性粒細(xì)胞從循環(huán)中遷移至感染部位結(jié)合并吞噬病原體,通過脫顆粒釋放抗菌因子抵御病原體,并通過抗微生物蛋白、釋放活性氧迅速殺死病原體。Brinkmann等[3]于2004年首次發(fā)現(xiàn)并描述了NETs。它由活化的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生,其主要成分包括核染色質(zhì)、組蛋白和顆粒蛋白,如髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、彈力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和肽基精氨酸脫亞胺酶Ⅳ(peptidearginine deaminase 4,PAD4)等。核染色質(zhì)由核酸和蛋白質(zhì)組成,作為NETs的骨架,組蛋白起到促進(jìn)微生物和病原體粘附的作用。顆粒蛋白中的MPO、NE等發(fā)揮消滅病原體的作用。NETs最早被認(rèn)為是打擊入侵病原體(主要為細(xì)菌)的一個(gè)重要工具[4]。隨后的研究發(fā)現(xiàn),NETs對(duì)細(xì)菌毒素、原生生物和病毒也有抵御作用。此外,越來越多的證據(jù)表明,NETs在多種疾病中都發(fā)揮作用,如自身免疫性疾病[5]、腫瘤[6]、糖尿病[7]、阿爾茲海默病[8]等。同樣的,NETs與動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理進(jìn)展也息息相關(guān)[9]。

1.2 NETs產(chǎn)生的機(jī)制

NETs產(chǎn)生的過程稱為NETosis[3],包括NETs的生成和釋放。目前的研究認(rèn)為NETs的產(chǎn)生有兩種不同的機(jī)制,分別為:自殺性NETosis(核膜裂解NETs形成)和非自殺性NETosis(囊泡介導(dǎo)的NETs形成)。自殺性NETosis是一種進(jìn)展緩慢(持續(xù)數(shù)小時(shí))的細(xì)胞死亡方式,有別于壞死和凋亡[10]。目前關(guān)于自殺性NETosis的機(jī)制研究表明,中性粒細(xì)胞通過佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)處理而被激活,隨后通過上調(diào)糖酵解途徑,誘導(dǎo)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK),繼而誘導(dǎo)NADPH氧化酶復(fù)合物的磷酸化和組裝。NADPH氧化酶調(diào)節(jié)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生[11],提高Ca2+水平,進(jìn)一步激活PAD4。PAD4則通過將組蛋白H3和H4的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸,使組蛋白丟失大量陽離子,發(fā)生染色質(zhì)凝集[12]。同時(shí),ROS的大量產(chǎn)生會(huì)破壞中性粒細(xì)胞顆粒膜和溶酶體膜,誘導(dǎo)釋放MPO和NE。NE可以將GSDMD(gasdermin D)轉(zhuǎn)化為活性形式GSDMD-NT,介導(dǎo)核膜、顆粒膜、質(zhì)膜孔隙的形成。在此過程中,顆粒蛋白被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,參與染色質(zhì)的去折疊。隨后核膜破裂,染色質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)蛋白混合,進(jìn)入細(xì)胞外液[13]。

自殺性NETosis形成的時(shí)間主要在刺激后3～4 h,而中性粒細(xì)胞也可以通過非?？斓乃俣?5～60 min)釋放NETs,且不依賴于細(xì)胞死亡,即非自殺性NETosis。目前的研究認(rèn)為非自殺性NETosis在調(diào)節(jié)病原體感染方面發(fā)揮更重要的作用,中性粒細(xì)胞通過Toll樣受體2(Toll-like repetor 2,TLR2)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和補(bǔ)體受體識(shí)別不同刺激物誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生,與NADPH氧化酶激活無關(guān)[13]。如金黃色葡萄球菌和白色念珠菌分別激活TLR2和補(bǔ)體受體,大腸埃希菌和脂多糖激活的血小板則激活TLR4。Toll樣受體和補(bǔ)體受體激活PAD4,使得NE向細(xì)胞核移位,參與染色質(zhì)去凝集,隨后蛋白質(zhì)修飾的染色質(zhì)通過小泡排出而不破壞細(xì)胞膜。不同于自殺性NETosis,非自殺性NETosis在NETs釋放后,中性粒細(xì)胞仍然可以存活并發(fā)揮進(jìn)一步功能。

1.3 NETs的檢測

基于NETs的組成成分,研究者使用多種檢測方法對(duì)不同部位的NETs進(jìn)行識(shí)別和定量。Perdomo等[14]通過熒光光譜法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測和定量血清中的游離DNA(circulating-free DNA,cfDNA)和NETs中的瓜氨酸化組蛋白H3(cit-H3)、NE、MPO等組分。Gavillet等[15]使用抗瓜氨酸化組蛋白抗體和抗MPO抗體結(jié)合DNA染料,通過流式細(xì)胞術(shù)識(shí)別和量化人或小鼠血液樣本中的NETs。Zhao等[16]使用一種新的方法,通過結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微鏡區(qū)分并量化自殺性NETosis和非自殺性NETosis。電子顯微鏡技術(shù)可以檢測NETs的形態(tài)和結(jié)構(gòu),如通過掃描電鏡(SEM)可以觀察NETs的超微結(jié)構(gòu),而通過透射電鏡(TEM)觀察細(xì)胞釋放NETs的過程,例如核膜裂解,并且區(qū)分細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、NETosis[10]。在小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中,通過蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光染色可以檢測到結(jié)腸組織中NETs的組分,如PAD4、MPO、NE、cit-H3較對(duì)照組表達(dá)量升高[17]?；铙w顯微鏡技術(shù)是實(shí)時(shí)檢測NETs產(chǎn)生的方法之一。Bruns等[18]在小鼠煙曲霉感染模型中使用雙光子顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)成像,檢測到NETs的產(chǎn)生及抵御煙曲霉感染的過程,并使用中性粒細(xì)胞耗竭抗體證明此過程需要中性粒細(xì)胞的參與。

2 NETs與動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化是由脂質(zhì)驅(qū)動(dòng),多種細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞)共同參與的慢性動(dòng)脈炎癥性疾病。眾多研究表明,中性粒細(xì)胞和NETs在動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用。Megens等[19]首次報(bào)道NETs存在于人和小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變處。Pertiwi等[20]的研究則通過對(duì)44個(gè)復(fù)雜斑塊(包括斑塊內(nèi)出血、糜爛、破裂)和20個(gè)完整斑塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,揭示不同形態(tài)斑塊的中性粒細(xì)胞和NETs分布情況。結(jié)果顯示,完整斑塊中無NETs,但其周圍血管組織分布有大量中性粒細(xì)胞和NETs。而在復(fù)雜斑塊(如斑塊內(nèi)出血、糜爛和破裂等)中,中性粒細(xì)胞和NETs則廣泛存在,且在不同復(fù)雜斑塊間分布無明顯差異。另一項(xiàng)關(guān)于人類頸動(dòng)脈內(nèi)膜標(biāo)本的研究表明,與富含脂質(zhì)的不穩(wěn)定斑塊相比,侵蝕斑塊表面分布有大量中性粒細(xì)胞和NETs,并且與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量相關(guān)[21]。NETs也廣泛分布于小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變部位。NE和蛋白酶3(PR3)是NETs發(fā)揮生物學(xué)功能的重要工具。Warnatsch等[22]的研究表明,與對(duì)照組ApoE基因敲除小鼠相比,ApoE/NE/PR3基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積減少約3成。給予ApoE基因敲除小鼠脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)治療,其斑塊面積同樣減少約3成,但給予ApoE/NE/PR3基因敲除小鼠DNase治療,斑塊面積幾乎不發(fā)生改變。這些研究證明了NETs在動(dòng)脈粥樣硬化中的重要作用。動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素也會(huì)誘導(dǎo)NETs的產(chǎn)生,如斑塊中的oxLDL、膽固醇結(jié)晶、氧化甾醇、血小板和各種趨化因子等等。研究表明oxLDL以濃度和時(shí)間依賴的方式,增加活性氧的產(chǎn)生,并且通過TLR2和TLR6途徑來誘導(dǎo)NETs的產(chǎn)生[23]。另一項(xiàng)研究表明,oxLDL可以增加PMA處理后中性粒細(xì)胞NETs的產(chǎn)生,并增加NETs中MPO的釋放[24]。氧化磷脂也在NETs形成中發(fā)揮重要作用,如給予LNK基因敲除小鼠ox-PL抗體不僅可以減少血清oxPL水平,還會(huì)減少NETs和動(dòng)脈血栓形成[25]。同時(shí),中性粒細(xì)胞自身膽固醇過度積累也會(huì)影響NETs的形成。如骨髓細(xì)胞中ABCA1/ABCG1缺乏(ABCA1/ABCG1介導(dǎo)膽固醇流出至高密度脂蛋白HDL)會(huì)導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞過量膽固醇積累,激活NLRP3炎癥小體,導(dǎo)致動(dòng)脈病變部位中性粒細(xì)胞的浸潤和NETs的釋放[26]。Curcic等[27]發(fā)現(xiàn)分泌性磷脂酶A2修飾的HDL可以抑制中性粒細(xì)胞的活化,以及NETs的形成,原因可能是sPLA2修飾的HDL,其膽固醇外流能力增強(qiáng)或是抑制中性粒細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高?？偠灾?NETs與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系存在復(fù)雜性和多樣性,NETs不僅在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處廣泛分布,還與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞相互作用。

2.1 NETs與內(nèi)皮細(xì)胞

內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化病變?cè)缙诘臉?biāo)志性事件。NETs起始于血流紊亂和剪切應(yīng)力增強(qiáng)的部位,可以直接激活和損傷內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[28]。Carmona-Rivera等[29]發(fā)現(xiàn)NETs中存在的基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)與內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2的激活和內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān),抑制MMP-2的激活可以恢復(fù)內(nèi)皮功能,減輕NETs引起的血管毒性。同時(shí),NETs也通過IL-1α和組織蛋白酶G的協(xié)同作用激活內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)凝血。NETs會(huì)進(jìn)一步放大和加重侵蝕斑塊血栓并發(fā)癥引起的內(nèi)皮功能障礙。而內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和激活會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)NETs和網(wǎng)狀中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生,二者的相互作用形成一系列惡性循環(huán),加重內(nèi)皮功能障礙[30]。因此,減少NETs產(chǎn)生可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能,預(yù)防早期動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展。

2.2 NETs與平滑肌細(xì)胞

中性粒細(xì)胞和NETs會(huì)優(yōu)先聚集在平滑肌細(xì)胞富集的粥樣斑塊中,通過TLR2依賴的途徑誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致侵蝕斑塊的形成[31]。通過對(duì)355例頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)行中性粒細(xì)胞標(biāo)記CD66b染色發(fā)現(xiàn)[32],與其余斑塊相比,中性粒細(xì)胞富集的斑塊,其脂質(zhì)核心更大,巨噬細(xì)胞數(shù)量更多,相反膠原纖維和平滑肌細(xì)胞數(shù)量則較之減少。同時(shí)中性粒細(xì)胞數(shù)量與斑塊內(nèi)炎癥因子IL-8,以及MMP-8、MMP-9水平呈正相關(guān)。PAD4是NETs形成的關(guān)鍵分子,也與侵蝕斑塊形成密切相關(guān)。Knight等[33]通過氯脒抑制PAD4從而減少NETs形成,減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病變面積,進(jìn)一步表明NETs在動(dòng)脈粥樣硬化中的重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中,斑塊內(nèi)激活的平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的遷移并釋放NETs。NETs中的組蛋白H4則可結(jié)合并溶解平滑肌細(xì)胞[34]。斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的死亡會(huì)減少間質(zhì)膠原合成,導(dǎo)致纖維帽變薄,斑塊不穩(wěn)定性增加。使用抗組蛋白H4抗體抑制這一反應(yīng)后,起到減小斑塊面積,增加斑塊穩(wěn)定性的作用。

2.3 NETs與巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞相互作用會(huì)加重斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)。如膽固醇結(jié)晶激活中性粒細(xì)胞后,促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成IL-1β的前體分子,同時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬膽固醇結(jié)晶,促進(jìn)IL-1β成熟,進(jìn)一步上調(diào)T細(xì)胞促炎因子IL-17的表達(dá),IL-17則會(huì)進(jìn)一步招募免疫細(xì)胞至動(dòng)脈粥樣硬化病變部位,加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[22]。此外,NETs通過巨噬細(xì)胞的TLR9/NF-κB通路,介導(dǎo)IL-8的釋放。反之,IL-8通過其受體CXC受體2(CXC chemokine receptor 2,CXCR2)介導(dǎo)NETs的形成[35]。Josefs等[36]發(fā)現(xiàn),糖尿病LDLR基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變部位NETs數(shù)量增加,誘導(dǎo)病變部位巨噬細(xì)胞向M1型極化。給予糖尿病LDLR基因敲除小鼠DNase治療后,NETs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥減輕,斑塊面積、壞死核心及膽固醇結(jié)晶也相應(yīng)減少。

2.4 NETs與DC細(xì)胞

NETs不僅與巨噬細(xì)胞相互作用,與DC細(xì)胞之間聯(lián)系亦十分緊密。研究表明,NETs通過激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)致動(dòng)脈粥樣硬化[37],即NETs或死亡細(xì)胞產(chǎn)生的DNA與中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的顆粒蛋白共同激活血管壁中的漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞,引發(fā)強(qiáng)烈的Ⅰ型干擾素反應(yīng),導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。反之,漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的缺失則會(huì)減輕斑塊負(fù)荷及Ⅰ型干擾素反應(yīng)[38]。Knight等[33]的研究表明,NETs促進(jìn)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞活化,產(chǎn)生干擾素α促進(jìn)血管損傷、血栓和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。抑制PAD4可消除NETs釋放,減輕Ⅰ型干擾素反應(yīng),并減少動(dòng)脈粥樣硬化病變血管中膜和外膜網(wǎng)狀中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

2.5 NETs與血小板

Clark等[39]于2007年首次報(bào)道血小板參與NETs的形成。在小鼠膿毒血癥模型中,LPS通過結(jié)合血小板表面TLR4,促使血小板與中性粒細(xì)胞結(jié)合,導(dǎo)致中性粒細(xì)胞快速活化和NETs產(chǎn)生。血小板和中性粒細(xì)胞也通過p-選擇素(p-selectin)和白細(xì)胞表面受體p-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)相互作用[40]。此外,血小板糖蛋白(GP)Ⅰb與中性粒細(xì)胞β2整合素(CD18)結(jié)合也參與二者的相互作用。研究表明,阻斷中性粒細(xì)胞β2整合素(CD18)可以顯著減少血小板活化介導(dǎo)的NETs生成[41]。血小板活化對(duì)于中性粒細(xì)胞NETs的產(chǎn)生至關(guān)重要,其活化后分泌的蛋白或細(xì)胞因子可以直接參與中性粒細(xì)胞NETs的形成。如血小板活化后釋放高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1,HMGB1),誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的自噬反應(yīng)并加速NETs的產(chǎn)生[42]。血小板因子4(platelet factor 4,PF4)則參與炎癥部位中性粒細(xì)胞的募集和其DNA的釋放。體外研究表明,通過抑制PF4可減少中性粒細(xì)胞DNA的釋放,相反,重組PF4則促進(jìn)NETs的形成[41]。

3 小結(jié)與展望

中性粒細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在感染性疾病和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面NETs的形成和釋放會(huì)不斷侵蝕斑塊,誘導(dǎo)斑塊內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及斑塊表面血栓形成。NETs也會(huì)加重斑塊的炎癥反應(yīng)、增加斑塊內(nèi)脂質(zhì)負(fù)荷和膽固醇?jí)乃澜Y(jié)晶數(shù)量,并加速平滑肌細(xì)胞死亡,導(dǎo)致膠原纖維合成減少,纖維帽變薄及斑塊不穩(wěn)定性增加。總而言之,NETs在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展中的作用不容忽視。關(guān)于NETs和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系還需要更加深入和細(xì)致的研究,從而為后續(xù)的治療和藥物研發(fā)起到指導(dǎo)作用。