劉 謹(jǐn), 周珍珍

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科,武漢 430030 2河南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科,鄭州 450003

原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌)是中國(guó)常見(jiàn)高發(fā)的惡性腫瘤之一,而肝癌細(xì)胞的血行播散侵襲轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因[1-2]。肺轉(zhuǎn)移是肝細(xì)胞癌最常見(jiàn)的血行轉(zhuǎn)移器官[3-4],是肝癌研究的難點(diǎn)[5]。新近研究表明,編碼“肺歸巢域”蛋白基因AEG-1(astrocyte elevated gene 1)在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移播散等方面發(fā)揮重要作用[6-8]。我們的前期研究[9]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)AEG-1的肝癌細(xì)胞更易向人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化,提示AEG-1可能與肝癌定向肺轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了證實(shí)AEG-1在肝癌中的作用,我們構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)AEG-1肝癌細(xì)胞株SMMC-7721-AEG-1-L及過(guò)表達(dá)對(duì)照SMMC-7721-control-L,穩(wěn)定沉默AEG-1肝癌細(xì)胞株SMMC-7721-shAEG-1-P及沉默對(duì)照SMMC-7721-control-P,并使用上述細(xì)胞株建立裸鼠肝癌模型;建立上述4種肝癌細(xì)胞株的皮下移植瘤裸鼠模型,觀察過(guò)表達(dá)或沉默AEG-1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)展的作用;建立肝癌原位移植瘤模型和血行播散模型,并用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè),研究過(guò)表達(dá)或沉默AEG-1基因在肝癌定向肺轉(zhuǎn)移中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

以在吉?jiǎng)P基因所購(gòu)得的慢病毒包裝AEG-1(cDNA NM_178812)高表達(dá)基因編碼序列,轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,獲得AEG-1基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株(SMMC-7721-AEG-1-L);包裝無(wú)任何目的的基因序列pEGFP-N1-3 FLAG,轉(zhuǎn)染獲得過(guò)表達(dá)對(duì)照細(xì)胞株(SMMC-7721-control-L);質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的穩(wěn)定SMMC-7721細(xì)胞株:轉(zhuǎn)染含有靶向AEG-1的shRNA(shRNA序列:5′-GCTGACTGATTCTGGTTCAT-3′)質(zhì)粒獲得沉默AEG-1細(xì)胞株(SMMC-7721-shAEG-1-P)和轉(zhuǎn)染無(wú)任何靶向shRNA pGCSi-H1/Neo,獲得沉默對(duì)照細(xì)胞株(SMMC-7721-control-P);隨后使用熒光素酶基因慢病毒包裝顆粒感染上述4種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。以上細(xì)胞株均由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所提供,細(xì)胞培養(yǎng)方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

裸鼠購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司,品系Balb/c nu/nu,SPF級(jí),雄性,3～4周齡。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)裸鼠的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。60只裸鼠分組情況如表1。

表1 60只Balb/c nu/nu裸鼠隨機(jī)分為4組(n)Table 1 Sixty Balb/c nu/nu nude mice were randomly divided into 4 groups (n)

1.2.1 建立人肝癌細(xì)胞SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤模型 當(dāng)上述4組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí),用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化細(xì)胞,并用吸管吹打,用培養(yǎng)液將消化下來(lái)的細(xì)胞重新懸浮成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),80×g離心10 min后,棄上清液,隨后用0.9%的生理鹽水吹打,制備單細(xì)胞懸液。各組取裸鼠5只,按5×106細(xì)胞/0.2 mL劑量接種于裸鼠右肩胛皮下(具體操作參照文獻(xiàn)[10-12])。注射后每天觀察腫瘤形成及有無(wú)紅腫、潰破。

1.2.2 建立肝癌原位移植瘤模型 無(wú)菌條件下,分別取上述4組皮下移植瘤小鼠各1只,取瘤后處死。選擇活力好的瘤組織浸入無(wú)菌生理鹽水中漂洗,并切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊待用;用氯氨酮及地西泮稀釋后麻醉裸鼠,沿右側(cè)季肋部橫向切口,分離腹肌,暴露肝右葉,剪開(kāi)肝葉,用3個(gè)0的可吸收縫線將1塊移植瘤組織縫入肝臟,用明膠海綿填壓止血,逐層關(guān)腹(具體操作參照文獻(xiàn)[13])。

1.2.3 建立肝癌血行播散模型 按照1.2.1方法準(zhǔn)備各組肝癌細(xì)胞,用手捏住裸鼠尾巴選擇兩側(cè)靜脈血管用胰島素注射器吸取細(xì)胞懸液100 μL緩慢注射,拔出針后用棉簽按住注射部位以免細(xì)胞懸液流出(具體操作參照文獻(xiàn)[3-4])。

1.2.4 動(dòng)物活體成像 熒光素鉀/鎂鹽(激活熒光素酶的底物)的配制:室溫溶解熒光素于DPBS(不含鎂離子和鈣離子)中使終濃度為15 mg/mL;在超凈臺(tái)內(nèi),先將0.22 μm濾膜過(guò)濾器用5～10 mL無(wú)菌水過(guò)濾并將水丟棄;然后過(guò)濾滅菌溶解充分的熒光素溶液,并用1.5 mL EP管分裝,避光凍存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

從動(dòng)物房取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,盡量保證其處于無(wú)菌環(huán)境。成像前將超凈臺(tái)及房間進(jìn)行紫外照射30 min;1%戊巴比妥鈉溶液麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,待動(dòng)物麻醉后再行腹腔注射熒光素;每個(gè)小鼠注射10 μL/g熒光素儲(chǔ)存液,5～10 min后用活體成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.2.5 裸鼠的處死與蘇木精-伊紅(HE)染色 術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng),觀察裸鼠的生長(zhǎng)情況,如體重增減,活動(dòng)程度的變化以及對(duì)外界刺激的反應(yīng)情況等,觀察裸鼠生長(zhǎng)35 d后處死動(dòng)物,無(wú)菌條件下,對(duì)鼠進(jìn)行系統(tǒng)解剖,并觀察肝癌在肝內(nèi)和肺部的轉(zhuǎn)移情況,同時(shí)收集裸鼠全部肺組織、肝臟組織,進(jìn)行固定、切片、免疫組化染色觀察組織成瘤情況,記錄腫瘤大小、稱取瘤重。組織包埋及HE染色由武漢百奧斯生物科技有限公司制作。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

運(yùn)用Trizol(Invitrogen公司)法提取細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用一步法試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR,檢測(cè)AEG-1和β-actin的相對(duì)表達(dá)量,引物序列分別為:AEG-1,正向:5′-TGTTGAAGTGGCTGAGGG-3′,反向:5′-CAGGAAATGATGCGGTTG-3′;β-actin,正向:5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′,反向:5′-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3′。

1.4 Western blot檢測(cè)

配制胞核蛋白裂解液,buffer A:10 mmol/L HEPES-KOH(pH=7.9),1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl,0.5 mmol/L DTT,0.2 mmol/L PMSF,1 μg/mL亮肽素;buffer B:20 mmol/L HEPES-KOH(pH7.9),25%甘油,1.5 mmol/L MgCl2,420 mmol/L NaCl,0.2 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L DTT,0.2 mmol/L PMSF,1 μg/mL亮肽素(Ferments公司)。用核蛋白裂解液抽提轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白,測(cè)定蛋白提取液濃度,-70℃保存?zhèn)溆?。取總蛋?0 μg與上樣緩沖液充分混勻,100 ℃水浴10 min變性后上樣。12% SDS-PACE凝膠行電泳分離后,轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加兔抗人AEG-1一抗(Abcam公司,1 ∶1000)4℃孵育過(guò)夜,TBST液漂洗,加Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(武漢博士德公司,1 ∶4000)室溫孵育30 min,TBST液漂洗。ECL試劑(Pierce公司)顯色,曝光,顯影,定影,用X線膠片拍照保存。Image J圖像分析軟件測(cè)定條帶的灰度值,以與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值表示蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)的比較采用方差分析,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞株AEG-1 mRNA及蛋白表達(dá)

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞株AEG-1 mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示:SMMC-7721-AEG-1-L、SMMC-7721-control-L肝癌細(xì)胞株AEG-1 mRNA表達(dá)量分別為[(4.58±0.32)vs.(0.86±0.05),P<0.05];SMMC-7721-shAEG-1-P、SMMC-7721-control-P肝癌細(xì)胞株AEG-1 mRNA表達(dá)量分別為[(0.80±0.07)vs.(2.61±0.13),P<0.05]。不同組別肝癌細(xì)胞AEG-1 mRNA表達(dá)情況見(jiàn)圖1A。

應(yīng)用Western blot檢測(cè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞株AEG-1蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示:SMMC-7721-AEG-1-L、SMMC-7721-control-L肝癌細(xì)胞株AEG-1蛋白表達(dá)量分別為[(0.517±0.009)vs.(0.232±0.004),P<0.05];SMMC-7721-shAEG-1-P、SMMC-7721-control-P肝癌細(xì)胞株AEG-1蛋白表達(dá)量分別為[(0.272±0.007)vs.(0.582±0.004),P<0.05]。不同組別肝癌細(xì)胞AEG-1蛋白表達(dá)情況,見(jiàn)圖1B、1C。

1:SMMC-7721-AEG-1-L;2:SMMC-7721-control-L;3:SMMC-7721-shAEG-1-P;4:SMMC-7721-control-P;A:AEG-1 mRNA表達(dá)情況;B～C:AEG-1蛋白表達(dá)情況;與SMMC-7721-control-L組比較,*P<0.05;與SMMC-7721-control-P組比較,#P<0.05圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞株轉(zhuǎn)染情況Fig.1 The transfection of SMMC-7721 cell line was detected by real-time quantitative PCR and Western blotting

2.2 AEG-1調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)

裸鼠皮下移植瘤模型,皮下接種SMMC-7721-AEG-1-L和SMMC-7721-control-L細(xì)胞2 d內(nèi)接種部位皮丘完全消失,3～5 d接種部位見(jiàn)突出于皮膚表面的實(shí)性瘤結(jié)節(jié),成瘤率為100%(圖2A、2B)。腫瘤體積測(cè)量顯示,SMMC-7721-AEG-1-L組腫瘤體積大且生長(zhǎng)迅速,在第10天出現(xiàn)生長(zhǎng)高峰,SMMC-7721-control-L瘤體小且生長(zhǎng)速度緩慢,組中有1腫瘤體積明顯較小,注射肝癌細(xì)胞10 d后瘤塊消失,至第20天再次出現(xiàn)。造成這一現(xiàn)象的原因可能與肝癌細(xì)胞皮下注射部位缺少血供,以及裸鼠本身免疫功能未完全敲除有關(guān)。SMMC-7721-shAEG-1-P和SMMC-7721-control-P細(xì)胞2 d內(nèi)接種部位皮丘完全消失,第5天接種部位見(jiàn)突出于皮膚表面的實(shí)性瘤結(jié)節(jié),成瘤率為100%(圖2C、2D)。在第25天和第30天的測(cè)量中,SMMC-7721-AEG-1-L組腫瘤體積均顯著高于SMMC-7721-control-L組(均P<0.05,圖3A)。而SMMC-7721-shAEG-1-P組、SMMC-7721-control-P組裸鼠腫瘤體積在6次測(cè)量中均無(wú)顯著差異(均P>0.05,圖3B)。30 d后部分體積較大的腫瘤侵襲皮膚出現(xiàn)破潰。

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組圖2 裸鼠肝癌模型的皮下剝離腫瘤Fig.2 Subcutaneous tumors in nude mice hepatoma model

與SMMC-7721-control-L組比較,*P<0.05圖3 裸鼠肝癌模型中皮下移植瘤模型瘤體生長(zhǎng)曲線Fig.3 Tumor growth curve of subcutaneous xenograft tumor model in nude mice

2.3 AEG-1與肝癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移

處死皮下移植瘤裸鼠,取出肝臟組織肉眼進(jìn)行觀察,SMMC-7721-AEG-1-L組肝臟表面密布破潰出血點(diǎn),SMMC-7721-control-L組未見(jiàn)異常。SMMC-7721-shAEG-1-P組以及SMMC-7721-control-P組肝臟均有轉(zhuǎn)移灶(圖4)。隨機(jī)取一處肝臟組織做石蠟包埋,HE染色組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn):SMMC-7721-AEG-1-L組裸鼠肝臟組織出現(xiàn)彌漫性侵犯轉(zhuǎn)移灶,SMMC-7721-control-L組見(jiàn)小范圍炎癥出現(xiàn)。SMMC-7721-shAEG-1-P與SMMC-7721-control-P組肝臟亦可見(jiàn)侵襲轉(zhuǎn)移灶(圖5)。肝內(nèi)原位移植術(shù)后7 d進(jìn)行裸鼠活體成像證實(shí)手術(shù)移植成功率為100%。第35天再次進(jìn)行裸鼠活體成像,結(jié)果顯示:與SMMC-7721-control-L組相比,SMMC-7721-AEG-1-L組出現(xiàn)明顯肝內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移,發(fā)光面積和強(qiáng)度均顯著增加;SMMC-7721-shAEG-1-P組腫瘤發(fā)光面積較小且發(fā)光強(qiáng)度明顯降低,色階比對(duì)小于SMMC-7721-control-P組的10%～20%(圖6)。術(shù)后35天處死肝內(nèi)原位移植瘤模型裸鼠,各組隨機(jī)選擇一只裸鼠取肝臟,進(jìn)行石蠟包埋,光學(xué)顯微鏡組織學(xué)檢測(cè)肝內(nèi)包埋瘤體長(zhǎng)徑和轉(zhuǎn)移灶數(shù)量:SMMC-7721-AEG-1-L組447.58 μm,轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為11個(gè),SMMC-7721-control-L組451.58 μm,肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為9個(gè);SMMC-7721-shAEG-1-P組69.98 μm,轉(zhuǎn)移灶為6個(gè);SMMC-7721-control-P組391.41 μm,轉(zhuǎn)移灶為9個(gè)。組間比較顯示,SMMC-7721-AEG-1-L組和SMMC-7721-control-L組存在顯著差異;SMMC-7721-shAEG-1-P組的腫瘤大小及轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯低于SMMC-7721-control-P組,見(jiàn)圖7。

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組圖4 肝癌細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠肝臟改變Fig.4 Liver changes in nude mice with subcutaneous xenograft of hepatoma cells

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組;放大倍數(shù)×100,右上小窗×40圖5 皮下移植瘤模型肝癌細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(HE染色)Fig.5 Intrahepatic metastasis of hepatoma cells in subcutaneous xenograft tumor model (HE staining)

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組;比色條代表發(fā)光強(qiáng)度,從紅色至紫色發(fā)光強(qiáng)度逐漸降低圖6 肝癌原位移植瘤模型活體成像Fig.6 In vivo imaging of orthotopic xenograft tumor model

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組;放大倍數(shù)×100,左上小窗×40圖7 原位移植瘤模型原位肝癌及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶(HE染色)Fig.7 Liver cancer in situ and intrahepatic metastasis foci of orthotopic xenograft tumor model (HE staining)

2.4 AEG-1與肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移

肉眼觀察皮下移植瘤模型肺組織均無(wú)異常表現(xiàn);HE染色組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),SMMC-7721-AEG-1-L組存在2個(gè)肺轉(zhuǎn)移灶,SMMC-7721-control-L組未見(jiàn)肺部轉(zhuǎn)移灶;SMMC-7721-shAEG-1-P組未見(jiàn)肺轉(zhuǎn)移灶,SMMC-7721-control-P組肺部有1處轉(zhuǎn)移灶(圖8)。肝內(nèi)原位移植瘤裸鼠活體成像中均未看到肺部出現(xiàn)發(fā)光(圖6);但是光學(xué)顯微鏡組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),SMMC-7721-AEG-1-L組、SMMC-7721-control-L組肺部轉(zhuǎn)移灶分別為3個(gè)、1個(gè);SMMC-7721-shAEG-1-P組未發(fā)現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移灶,SMMC-7721-control-P組肺部存在2個(gè)轉(zhuǎn)移灶(圖9)。

裸鼠肝癌細(xì)胞血行播散模型,以每只5×106的細(xì)胞數(shù)尾靜脈注射SMMC-7721-AEG-1-L、SMMC-7721-control-L、SMMC-7721-shAEG-1-P和SMMC-7721-control-P肝癌細(xì)胞。尾靜脈注射35 d后活體成像未觀測(cè)到肺部發(fā)光轉(zhuǎn)移灶,第60天后再次行活體成像發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移率分別是:SMMC-7721-AEG-1-L組60%、SMMC-7721-control-L組20%;SMMC-7721-shAEG-1-P組20%、SMMC-7721-control-P組60%。圖10顯示各組典型肺部轉(zhuǎn)移結(jié)果,SMMC-7721-AEG-1-L組的肺右上葉和左側(cè)三葉出現(xiàn)大片發(fā)光癌灶,SMMC-7721-control-L組大約在右肺門(mén)的位置檢測(cè)到1處發(fā)光癌灶;SMMC-7721-shAEG-1-P組在左肺下葉有1處發(fā)光癌灶,SMMC-7721-control-P組全肺出現(xiàn)彌散性癌灶。裸鼠于尾靜脈注射后的60 d給予處死,取肺組織。肉眼可見(jiàn)SMMC-7721-control-P組裸鼠肺表面有滿肺轉(zhuǎn)移微小點(diǎn)狀癌灶,其余3組肺表面未見(jiàn)異常。取部分肺組織石蠟包埋HE染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè):SMMC-7721-AEG-1-L組轉(zhuǎn)移灶有18個(gè),SMMC-7721-control-L組有3個(gè)轉(zhuǎn)移灶;SMMC-7721-shAEG-1-P組轉(zhuǎn)移灶為5個(gè),SMMC-7721-control-P組轉(zhuǎn)移灶有23個(gè)(圖11)。

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組;放大倍數(shù)×100,右下小窗×40圖8 肝癌皮下移植瘤模型肺轉(zhuǎn)移(HE染色)Fig.8 Lung metastasis of liver cancer in subcutaneous xenograft tumor model (HE staining)

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組;放大倍數(shù)×100,左上小窗×40圖9 肝癌原位移植瘤模型肺轉(zhuǎn)移(HE染色)Fig.9 Lung metastasis of liver cancer in orthotopic xenograft tumor model (HE staining)

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組;比色條代表發(fā)光強(qiáng)度,從紅色至紫色發(fā)光強(qiáng)度逐漸降低圖10 裸鼠肝癌細(xì)胞血行播散模型肺轉(zhuǎn)移活體成像Fig.10 In vivo imaging of lung metastasis in hematogenous spread model of nude mice

A:SMMC-7721-AEG-1-L組;B:SMMC-7721-control-L組;C:SMMC-7721-shAEG-1-P組;D:SMMC-7721-control-P組圖11 血行播散模型肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移(HE染色)Fig.11 Lung metastasis of hepatoma cells in hematogenous spread model (HE staining)

3 討論

肝癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升,病死率居我國(guó)惡性腫瘤的第2位,死亡原因大多與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[1-2]。因此,有效地減少或阻斷肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是當(dāng)前研究的重點(diǎn)之一。

原發(fā)性肝癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移多以血行播撒為主,尤以肺轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)[5]。研究表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位腫瘤組織脫落進(jìn)入血流,啟動(dòng)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過(guò)程,而循環(huán)腫瘤細(xì)胞向靶器官微血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化是前期準(zhǔn)備和必要條件[14-17]。我們前期研究[18]觀察到,在Transwell小室下層鋪有一層人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMECs)及人臍靜脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞株更易向鋪有HPMECs的小室趨化。這一實(shí)驗(yàn)提示,肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能更易向肺轉(zhuǎn)移。那么,是什么因素調(diào)控了肝癌細(xì)胞向肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化呢?

研究表明,AEG-1基因在多種腫瘤中高表達(dá),如非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、宮頸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等[19-20],AEG-1基因的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、耐藥等密切相關(guān)[7,21-23],這些研究表明,AEG-1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中[24-25],使用裸鼠異種移植模型,人類(lèi)肝癌細(xì)胞中AEG-1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致形成了具高度侵襲性、血管生成性和轉(zhuǎn)移性的腫瘤,而AEG-1的表達(dá)抑制減緩了肝癌的發(fā)展。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[26],抑制肝癌細(xì)胞AEG-1可影響骨架蛋白F-actin表達(dá),肝癌細(xì)胞骨架重排,有可能減少肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。AEG-1在癌癥的炎癥機(jī)制中起關(guān)鍵的作用,有研究發(fā)現(xiàn)AEG-1可通過(guò)NF-κB的活化促進(jìn)肝癌發(fā)展。

本研究小組[27-28]及近期研究[29]顯示,AEG-1與肝臟炎癥密切相關(guān)。本研究在皮下移植瘤、原位移植瘤模型中觀察到AEG-1高表達(dá)可增加肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的同時(shí)伴有肝臟的炎癥浸潤(rùn)。而AEG-1在人類(lèi)炎癥及纖維化發(fā)生等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用[30-32],可調(diào)控PI3K/Akt、p38 MAPK、ERK等通路,我們?cè)诤笃诘姆肿友芯恐锌蓹z測(cè)相關(guān)信號(hào)通路的變化,為進(jìn)一步研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究選擇低侵襲性成瘤率較高的SMMC-7721肝癌細(xì)胞構(gòu)建AEG-1過(guò)表達(dá)或沉默的SMMC-7721肝癌細(xì)胞株,而后使用熒光素酶基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染上述肝癌細(xì)胞用于動(dòng)物活體成像[33]。本研究建立皮下移植瘤模型測(cè)量皮下腫瘤體積[34],觀測(cè)AEG-1過(guò)表達(dá)/沉默與腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)系。結(jié)果顯示SMMC-7721-AEG-1-L組的腫瘤體積和生長(zhǎng)速度顯著增加。

肝內(nèi)原位移植瘤模型[10-12]模擬人原發(fā)肝細(xì)胞癌,使用較為直觀的動(dòng)物活體成像的方法來(lái)檢測(cè)原發(fā)肝癌中AEG-1基因表達(dá)在腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移中所起的作用。原位移植瘤模型中,SMMC-7721-AEG-1-L組肝內(nèi)有明顯發(fā)光轉(zhuǎn)移灶,SMMC-7721-shAEG-1-P組的肝臟腫瘤發(fā)光范圍較小且沒(méi)有發(fā)光轉(zhuǎn)移灶。

血行播散裸鼠模型的活體成像結(jié)果顯示AEG-1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移灶發(fā)光范圍及強(qiáng)度顯著增加。相反,沉默AEG-1則導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移灶發(fā)光范圍及強(qiáng)度顯著降低,本研究結(jié)果與Bhatnagar等[35]在前列腺癌中的研究結(jié)果一致。HE染色檢測(cè)裸鼠血行播散模型的肺轉(zhuǎn)移結(jié)果顯示,AEG-1過(guò)表達(dá)/沉默導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著增多/減少。以上研究結(jié)果與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的研究一致[36],表明AEG-1高表達(dá)具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述,AEG-1基因過(guò)表達(dá)具有促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)以及肝內(nèi)、肝外侵襲轉(zhuǎn)移的作用,反之沉默AEG-1基因則可以抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。本研究為進(jìn)一步探討肝癌肺轉(zhuǎn)移定向趨化的分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。