董文志 周陽 劉志恒 莫小華

摘要：目的 探討三七總皂苷是否降低胰腺炎大鼠胰腺組織中鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ-γ（CaMKⅡ-γ）基因和蛋白水平的表達，降低細胞鈣超載的程度，減輕急性重癥胰腺炎時胰腺組織的損傷。方法 雄性SD大鼠120只，隨機分為3組：假手術(shù)（SO）組、重癥急性胰腺炎（SAP）組、三七總皂苷干預(yù)（PNS）組。檢測3組大鼠的血清淀粉酶（AMS）、細胞內(nèi)Ca2+濃度、胰腺組織內(nèi)CaMKⅡ-γmRNA及CaMKⅡ-γ蛋白的表達量、并對大鼠胰腺石蠟切片進行病理評分。結(jié)果 SAP組及PNS組在術(shù)后4h、8h、12h和24h的血清淀粉酶、胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA的表達量、胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白表達量、胰腺組織病理評分及胰腺細胞內(nèi)Ca2+濃度均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8h、12h的胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA及CaMKⅡ-γ 蛋白表達量均明顯高于PNS組（P均<0.05），SAP組在術(shù)后8h、12h、24h的胰腺組織病理評分及胰腺細胞內(nèi)Ca2+濃度均明顯高于PNS組（P均<0.05）。結(jié)論 1.CaMKⅡ-γ在大鼠SAP模型中高表達，其與大鼠胰腺炎鈣超載的發(fā)生有關(guān)。2.三七總皂苷可以通過降低CaMKⅡ-γ在胰腺組織內(nèi)的表達，減輕胰腺細胞鈣超載的程度，對胰腺組織起到保護作用。

關(guān)鍵詞：SAP;PNS;鈣超載;CaMKⅡ-γ

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）09-0067-04

Effect of Panax Notoginseng Saponins on Expression of CaMKII-γin Calcium

Overload in Rats with Acute Severe Pancreatitis

DONG Wen-zhi， ZHOU Yang， LIU Zhi-heng， MO Xiao-hua

（The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650101， China）

【Abstract】Objective： To study whether Panax notoginseng saponins can reduce the expression of calmodulin-dependent protein kinase II-γ（CaMKII-γ） gene and protein in pancreatic tissue of rats with pancreatitis， lower the degree of calcium overload and alleviate the pancreatic tissue damage during acute severe pancreatitis. Methods： 120 SD male rats were randomly divided into 3 groups， sham operation （SO） group， severe acute pancreatitis （SAP） group and Panax notoginseng saponin intervention （PNS） group. The serum amylase （AMS）， intracellular Ca2+ concentration， CaMKII-γ mRNA and CaMKII-γprotein expression in pancreatic tissue were detected in three groups， and their pathological scores were obtained from rat pancreatic paraffin sections. Results： The serum amylase， pancreatic tissue CaMKII-γand mRNA expression， pancreatic tissue CaMKII-γ， protein expression， pancreatic tissue pathological score and pancreatic intracellular Ca at 4h， 8h， 12h and 24h after operation and the concentration of 2+ in SAP group and PNS group were significantly higher than those of SO group （P<0.05）. The expression of CaMKII-γ mRNA and CaMKII-γ protein in pancreatic tissue of SAP group were significantly higher than that of PNS group at 8h and 12h after operation （P<0.05）， the pathological scores of pancreatic tissue and the concentration of Ca2+ in pancreatic cells in the SAP group were significantly higher than those in the PNS group at 8h， 12h and 24h after operation （P<0.05）. Conclusion： A. CaMKII-γ is highly expressed in rat SAP model， which is related to the occurrence of calcium overload in rat pancreatitis. B. Panax notoginseng saponins can reduce the degree of calcium overload in pancreatic cells by reducing the expression of CaMKII-γ in pancreatic tissue and protect pancreatic tissue.

【Key words】 SAP， PNS， calcium overload， CaMKII-γ

隨著學(xué)者們對SAP研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)胰腺腺泡“鈣超載”是 SAP 發(fā)生發(fā)展過程中非常重要的環(huán)節(jié)，通過阻斷“鈣超載”，可延緩SAP病情的發(fā)展[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ-γ是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)Ca2+的重要調(diào)控蛋白，對細胞膜上的鈣通道以及細胞內(nèi)鈣庫膜上的相關(guān)鈣通道的調(diào)節(jié)都起著重要作用[2]。本實驗是想通過建立大鼠SAP模型，三七總皂苷腹腔注射，檢測大鼠的血清淀粉酶、細胞內(nèi)Ca2+濃度、胰腺組織內(nèi)CaMKⅡ-γmRNA及CaMKⅡ-γ蛋白的表達量、并對大鼠胰腺石蠟切片進行病理評分。以尋求SAP鈣超載的發(fā)生機制和三七總皂苷對鈣超載改善作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康成年清潔級SD雄性大鼠120只，體重200～250 g，120只SD大鼠隨機分成3組：①假手術(shù)組（SO組，n=40）;②重癥急性胰腺炎組（SAP組，n=40）;③三七總皂苷介入組（PNS組，n=40）。分別于術(shù)后4、8、12、24h時，每組隨機各選取10只大鼠處死采集標本。

1.2 SO動物模型制備 開腹后僅將十二指腸提出切口，用棉簽輕輕翻動胰腺3次，不注射?；悄懰徕c，消毒棉球及滲出液后，注射生理鹽水（0.1 mL/100 g）補液?？p合腹壁各層。

1.3 SAP組動物模型制備 辨認十二指腸降部腸管壁內(nèi)潛行的胰膽管，用無損傷絲線結(jié)扎肝門處膽管，提起十二指腸辨認出十二指腸乳頭處，在其對側(cè)腸壁，用預(yù)先去尖鈍針頭1 mL注射器插入腸腔，探查十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭逆行穿刺入胰膽管并向前推進約0.5 cm，使用無損傷血管夾固定針頭。以0.2 mL/min的速度向胰膽管內(nèi)注入5% ST（0.1 mL/100 g），注射完畢后約2～3 min肉眼觀察確認大鼠胰腺組織水腫，顏色變?yōu)榇u紅色或灰白色，繼續(xù)維持針頭原位2 min，用消毒棉簽吸凈腹腔內(nèi)滲出，解開結(jié)扎在肝門部的絲線。注射生理鹽水（0.1 mL/100 g）補液?？p合腹壁各層。建立大鼠SAP模型。

1.4 PNS組動物模型制備 在進行胰腺炎模型建模前，行腹腔注射三七總皂苷[50 mg/mL血塞通注射液（0.1 mL/100 g）]。注射后1h，按照SAP組方法建立急性重癥胰腺炎模型。成功建立大鼠PNS模型。3組大鼠術(shù)后背部皮下注射生理鹽水2 mL/kg，以補充術(shù)巾丟失水分。清醒后自由飲水，仍然禁食。

1.5 標本采集及指標檢測 各實驗組于術(shù)后按預(yù)定時間點從各組隨機挑選10只大鼠麻醉后經(jīng)原切口進腹，觀察胰腺炎癥及腹水性質(zhì)，快速采集血液標本和組織標本。心臟采血3-4mL，離心后取上層血清置EP管中-80°C保存，用于檢測血清淀粉酶。取全部胰腺組織，25%置于4%多聚甲醛溶液中固定、切片HE染色用于病理組織觀察;25%用于CamkII-γ mRNA測定;25%用于CaMKII-γ 蛋白含量測定;25%新鮮標本制備成細胞懸液供細胞內(nèi)（Ca2+）測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計結(jié)果以P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 SO組、SAP組、PNS組不同時相大鼠血清淀粉酶濃度比較 SAP組及PNS組在術(shù)后4h、8h、12h和24h的血清淀粉酶均明顯高于SO組（P均<0.05），SAP組在術(shù)后各時間點的血清淀粉酶與PNS組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均≥0.05）。見表1。

2.2 SO組、SAP組、PNS組不同時相大鼠胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA表達水平的比較 SAP組及PNS組在術(shù)后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA的表達量均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8 h、12 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA均明顯高于PNS組（P均<0.05），在術(shù)后4 h、24 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA與PNS組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均≥0.05）。見表2。

2.3 SO組、SAP組、PNS組不同時相大鼠胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白表達水平的比較 SAP組及PNS組在術(shù)后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白的表達量均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8 h、12 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白均明顯高于PNS組（P均<0.05），在術(shù)后4 h、24 h的胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白與PNS組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均≥0.05）。見表3。

2.4 SO組、SAP組、PNS組不同時相胰腺細胞內(nèi)Ca2+濃度的比較 將轉(zhuǎn)染了熒光顯色劑的胰腺組織碎片，放在載玻片上，使用蓋玻片輕壓胰腺組織。使用熒光顯微鏡下觀察，可見胰腺腺泡細胞內(nèi)鈣離子的顯影，呈現(xiàn)綠光（見圖1、圖2）。通過細胞內(nèi)Ca2+的熒光強度（FI）來反映細胞內(nèi)Ca2+的濃度大小。SAP組及PNS組在術(shù)后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺細胞內(nèi)Ca2+濃度均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8 h、12 h、24 h的胰腺細胞內(nèi)Ca2+濃度均明顯高于PNS組（P均<0.05），在術(shù)后4 h的胰腺細胞內(nèi)Ca2+濃度與PNS組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均≥0.05）。見表4。

2.5 SO組、SAP組、PNS組不同時相胰腺組織病理損傷評分的比較 SAP組及PNS組在術(shù)后4 h、8 h、12 h和24 h的胰腺組織病理損傷評分均明顯高于SO組（P均<0.05），其中SAP組在術(shù)后8 h、12 h、24 h的胰腺組織病理損傷評分均明顯高于PNS組（P均<0.05），在術(shù)后4h的胰腺組織病理損傷評分與PNS組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均≥0.05）。見表5。

表1 各組血清淀粉酶（AMS）水平的比較（x±s，U/L）

注：與SO組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠胰腺組織CaMKⅡ-γ mRNA表達水平的比較（x±s）

注：與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，△P<0.05

表3 各組大鼠胰腺組織CaMKⅡ-γ 蛋白表達水平的比較（x±s）

注：與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，△P<0.05

表4 各組大鼠胰腺胰腺細胞內(nèi)Ca2+熒光強度的比較（x±s）

注：與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，△P<0.05

表5 各組大鼠胰腺胰腺組織病理損傷評分的比較（x±s）

注：與SO組比較，*P<0.05;與SAP組比較，△P<0.05

圖1 在普通顯微鏡下胰腺組織的形態(tài)

圖2 在熒光顯微鏡下組織內(nèi)Ca2+呈現(xiàn)綠色

3 討論

急性胰腺炎為外科常見的急腹癥之一，其患者中的20%-30%為SAP患者，SAP病情發(fā)展兇險，死亡率較高。導(dǎo)致SAP治療難度大的原因之一是其發(fā)病機制復(fù)雜多樣，對其機制的研究也還不夠透徹。因而其發(fā)病機制的研究一直是學(xué)者們研究的重中之重。自“胰腺腺泡細胞鈣超載學(xué)說”被提出以來，鈣超載學(xué)說一直成為研究的熱點，并且有學(xué)者認為，胰腺腺泡“鈣超載”在 SAP 發(fā)病機制中占有中心地位[3]。

Ca2+是胰腺腺泡細胞進行生理活動的主要離子。在靜息狀態(tài)下，胰腺腺泡細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定在150mmL/L水平左右，刺激狀態(tài)下Ca2+呈波動性變化。細胞Ca2+主要存儲在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在胰腺腺泡細胞中的濃度與分泌顆粒在細胞中的分布一致。胰腺腺泡細胞內(nèi)Ca2+反應(yīng)可分為生理性和病理性兩種明顯不同反應(yīng)。

生理狀態(tài)下胰腺腺泡細胞內(nèi)鈣信號會發(fā)生小幅度的振蕩，主要受神經(jīng)性遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh）和循環(huán)激素縮膽囊素（CCK）激發(fā)。乙酰膽堿和縮膽囊素的受體位于腺泡細胞的基底區(qū)質(zhì)膜上[4-5]，它們接受刺激產(chǎn)生第二信使并觸發(fā)細胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子。小幅度的細胞內(nèi)鈣信號振蕩和全細胞鈣信號振蕩波是生理性的鈣信號。但是過量的乙酰膽堿和縮膽囊素以及甲萘醌（氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑）能引起全細胞鈣離子超載，這最終能導(dǎo)致細胞死亡。病理狀態(tài)下，胰腺腺泡細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣釋放通道Ryanodine受體和質(zhì)膜SOCs通道開放，引起細胞外鈣離子順化學(xué)梯度大量內(nèi)流，同時伴有細胞ATP耗竭及生物膜的損傷，二者皆可影響鈣-鎂ATP酶活性，導(dǎo)致升高的鈣離子不能有效重吸收或泵出細胞外，不僅影響細胞正常分泌功能導(dǎo)致胰酶大量分泌造成胰腺組織“自我消化”，甚至導(dǎo)致胰酶在胞內(nèi)的過早激活，最終導(dǎo)致SAP的發(fā)病。

鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）存在于體內(nèi)所有重要器官中。它主要存在于神經(jīng)組織，其中大腦中含量高，總蛋白含量的1%，其中在突觸后致密帶占神經(jīng)總蛋白含量的20%～30% 。胰島中含量很高，它也較多地存在于垂體前葉細胞和平滑肌細胞[6]。CaMKⅡ在細胞中的主要作用是調(diào)節(jié)器Ca2+的代謝。但是其在不同的組織中，以不同形式存在，發(fā)揮不同作用。

鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一種多功能蛋白激酶，存在于體內(nèi)所有重要器官中，純化的CaMKⅡ幾乎無活性，其與鈣/鈣調(diào)素結(jié)合后，自身要通過兩條途徑實現(xiàn)對Ca2+的調(diào)節(jié)：①作用于胞膜L型鈣通道，磷酸化胞膜上的電壓依賴性鈣通道及其相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，起易化作用，使其開放能力增加，大量鈣離子進入細胞[2]。②磷酸化可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白（sorcin），去除后者對肌質(zhì)網(wǎng)上鈣釋放通道Ryanodine受體（RyR）的抑制，使其開放時間延長，導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放增加。通過以上途徑降低細胞內(nèi)鈣離子濃度，大大避免細胞的鈣超載發(fā)生。在胰腺外分泌細胞，它可以被鈣離子釋放激素氨甲酰甲膽堿、膽囊收縮素所激活，但是它不被血管活性腸肽激活。鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ 在胰島素分泌中起重要作用。在β細胞中它主要是以β3 同工酶的形式存在[7]。CaMKⅡ的多克隆抗體的免疫化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胰島有很強的免疫反應(yīng)，垂體有中度的免疫反應(yīng)，肌肉細胞也有適度反應(yīng)。

在試驗中就是將上述的“鈣超載”、“CaMKⅡ-γ”以及“三七總皂苷”與“SAP”的發(fā)病機制和治療進行研究。我們使用逆行胰膽管注射法建立大鼠SAP模型，通過檢測血清淀粉酶、觀察腹水情況、評估胰腺組織變化來明確SAP模型建立成功與否。在SAP發(fā)病過程中，我們觀察大鼠血清中的Ca2+在相應(yīng)的時間點出現(xiàn)降低，這和臨床工作中人體SAP病情變化相一致，可以推測降低的Ca2+進入細胞內(nèi)。在檢測細胞內(nèi)Ca2+時，我們使用Fluo-3-am生理學(xué)探針，其可以特異標記細胞內(nèi)Ca2+，探針標記后的胰腺細胞通過流式細胞技術(shù)檢測Ca2+的熒光強度（FI），使用胰腺細胞內(nèi)熒光強度（FI）代表細胞內(nèi)“鈣超載”的程度。實驗中我們得出：SAP時胰腺細胞發(fā)生“鈣超載”。在CaMKⅡ-γ的檢測，通過基因和蛋白兩個水平分別闡述，兩個指標進行相互印證，都能說明其在在胰腺細胞中的表達均有細胞“鈣超載”的發(fā)生有關(guān)。在本實驗課題中，使用PNS腹腔注射預(yù)治療SAP，對相關(guān)指標檢測，筆者得出：三七總皂苷可以通過抑制胰腺組織中CaMKⅡ-γ基因和蛋白的表達，減輕細胞內(nèi)“鈣超載”的程度，對胰腺組織進行保護。

綜上所述，本次實驗通過過建立SAP模型，三七總皂苷腹腔注射，從“胰腺鈣超載學(xué)說”方面解釋了SAP的可能發(fā)病機制，并且闡述了三七總皂苷治療SAP的可能機制，即三七總皂苷可以通過抑制胰腺組織中CaMKⅡ-γ基因和蛋白的表達，從而減輕細胞內(nèi)“鈣超載”的程度，以致達到治療胰腺炎的作用。相信通過人們更多的研究及努力，對SAP發(fā)病機制的研究將會越來越透徹，最終實現(xiàn)預(yù)防及更有效治療重癥急性胰腺炎的目標。

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（收稿日期：2018-05-15）