張亞平　顏彥　宋振舉　童朝陽

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診科，*心內(nèi)科，上?！?00032)

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·論著·

PRKAG2心臟綜合征中R302Q突變對心肌細(xì)胞糖原和鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響

張亞平顏彥*宋振舉童朝陽

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診科，*心內(nèi)科，上海200032)

摘要目的：探討PRKAG2心臟綜合征中R302Q突變對心肌細(xì)胞糖原和鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響。方法： 用表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒感染大鼠H9C2心肌細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常對照組。感染24 h和48 h后，采用過碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff，PAS)染色法進(jìn)行糖原染色，觀察心肌細(xì)胞的糖原貯積；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測細(xì)胞內(nèi)糖原含量；同時(shí)用Rohd-2/AM活體染料進(jìn)行鈣離子染色，然后采用流式細(xì)胞術(shù)分析鈣離子庫信號差異。結(jié)果：EGFP組與對照組糖原染色和含量結(jié)果無明顯差別；PRKAG2-WT組糖原染色和含量略微增強(qiáng)；PRKAG2-R302Q組糖原染色和含量明顯增強(qiáng)。各組的鈣離子穩(wěn)態(tài)并未受到影響。結(jié)論：PRKAG2心臟綜合征中R302Q突變導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)糖原貯積，而鈣離子穩(wěn)態(tài)并未受到影響，沒有鈣超載現(xiàn)象發(fā)生。

關(guān)鍵詞PRKAG2心臟綜合征；R302Q突變；糖原；鈣超載

PRKAG2心臟綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，由PRKAG2基因突變造成[1]。PRKAG2基因編碼腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的γ2調(diào)節(jié)亞基[2]。PRKAG2綜合征臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性心肌細(xì)胞糖原貯積、心肌肥厚、室性預(yù)激和傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病[3-4]，甚至可能會(huì)發(fā)展成致命的室性心律失常，患者隨時(shí)有發(fā)生心臟性猝死的危險(xiǎn)。PRKAG2心臟綜合征患者通常在30歲前發(fā)病，有傳導(dǎo)阻滯的患者更易發(fā)生心臟性猝死，相當(dāng)一部分患者需要安裝永久起搏器。由于該病有心肌肥厚的表現(xiàn)，故患者常常被誤診為肥厚性心肌病。我們的前期研究[5]報(bào)告1例具有心肌肥厚和預(yù)激表型的PRKAG2綜合征患者；克隆PRKAG2基因并測序顯示，該患者帶有1個(gè)雜合的R302Q突變，PRKAG2基因B3切(剪切方式)，306位堿基G被A取代，302位精氨酸被谷氨酰胺取代，導(dǎo)致R302Q突變。2001年，Gollob等[6]首次報(bào)告PRKAG2綜合征的基因測序分析結(jié)果，證實(shí)患者都存在PRKAG2-R302Q突變，但在中國人群中未有報(bào)道。PRKAG2心臟綜合征的最典型的特點(diǎn)為心肌細(xì)胞糖原貯積，但關(guān)于R302Q突變對心肌代謝狀況的影響目前并無深入研究。因此，本研究在細(xì)胞水平上探究了PRKAG2心臟綜合征患者中R302Q突變對糖原貯積以及鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響。

1資料與方法

1.1材料DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，優(yōu)級胎牛血清(美國Hyclon公司)，H9C2大鼠胚胎心肌細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心)，鈣離子熒光探針Rohd-2/AM(日本同仁化學(xué)研究所)； 過碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff，PAS)糖原染色試劑盒(美國Sigma公司)。

1.2重組腺病毒的制備和感染應(yīng)用AdEasyTM系統(tǒng)(美國Stratagene公司)包裝目的重組腺病毒，具體步驟參見說明書。本研究分別選擇表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒，同時(shí)設(shè)正常對照組。將H9C2心肌細(xì)胞種在12孔板各孔中的玻璃蓋玻片上，24 h后分為4組，每組6個(gè)孔。各組分別加入5~10 μL相應(yīng)的重組腺病毒。分別于感染24 h和48 h后進(jìn)行糖原染色、糖原含量檢測、鈣離子染色分析等。

1.3糖原染色糖原染色采用PAS染色法，光鏡下觀察心肌細(xì)胞的糖原貯積狀況。PAS陽性反應(yīng)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有紫紅色球狀顆粒。

1.4糖原含量的檢測采用糖原檢測試劑盒(ELISA法)，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒要求，檢測細(xì)胞內(nèi)糖原含量。

1.5鈣離子染色大鼠 H9C2心肌細(xì)胞感染表達(dá)EGFP、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒48 h后，在培養(yǎng)皿中加入Rohd-2/AM染料進(jìn)行鈣離子染色。再經(jīng)過磷酸鹽緩沖液漂洗，消化成單細(xì)胞后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鈣離子庫信號差異分析。

2結(jié)果

2.1糖原染色感染重組腺病毒后24 h和48 h的PAS染色結(jié)果相似。EGFP組與對照組糖原染色結(jié)果無明顯差別；PRKAG2-WT組糖原染色略微增強(qiáng)；PRKAG2- R302Q組糖原染色明顯增強(qiáng)；見圖1。

2.2糖原含量的檢測采用ELISA法檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)糖原含量，結(jié)果顯示，EGFP組在24 h和48 h與正常對照組無差異(P>0.05)；PRKAG2-WT組細(xì)胞內(nèi)糖原含量較正常對照組稍高，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而PRKAG2 - R302Q組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

A：正常對照組；B：EGFP組；C：PRKAG2-WT組；D：PRKAG2-R302Q組

組別24h糖原含量P值48h糖原含量P值正常對照組0.2763±0.0021-0.2446±0.0020-EGFP組0.2520±0.00180.32970.2379±0.00170.3391PRKAG2-WT組0.2789±0.00160.51230.2502±0.00200.5165PRKAG2-R302Q組0.3667±0.0022*0.00690.2830±0.0030*0.0256

注：與正常對照組比較，*P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3鈣離子染色通過鈣離子染色、流式細(xì)胞術(shù)分析大鼠H9C2心肌細(xì)胞鈣離子庫的信號差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFP組、PRKAG2-WT組、PRKAG2-R302Q組以及對照組的鈣離子穩(wěn)態(tài)均未受到影響。

3討論

由于PRKAG2心臟綜合征患者心肌肥厚的表現(xiàn)與肥厚型心肌病極其相似，故臨床中極易將前者誤診為后者而耽誤治療。在攜帶PRKAG2突變基因的患者中，常存在心律失常，隨著心肌肥厚逐漸進(jìn)展，易出現(xiàn)左心功能不全及心臟肥大[7-8]。然而，與編碼肌小節(jié)蛋白的基因突變引起的典型肥厚性心肌病相比較，PRKAG2突變患者經(jīng)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)心肌纖維排列紊亂者罕見，心肌間質(zhì)纖維化程度也很低[7]。這表明PRKAG2突變導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制可能與肥厚性心肌病并不相同。國外對于PRKAG2基因相關(guān)突變的基礎(chǔ)研究[9]認(rèn)為，突變引起腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性改變。AMPK是由α、β和γ 3個(gè)亞基組成的異源三聚體蛋白。其中，α亞基是AMPK的催化亞基，β和γ亞基是AMPK的調(diào)節(jié)亞基。AMPK激活后，通過增強(qiáng)葡萄糖攝取和脂肪酸氧化，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解，維持細(xì)胞內(nèi)能量代謝平衡。故AMPK活性增加會(huì)引起糖原異常貯積。有研究[9]在2005年發(fā)現(xiàn)，PRKAG2基因突變N488I可引起AMPK活性增加，引起心肌細(xì)胞糖原的異常貯積，該結(jié)論同時(shí)在T400N轉(zhuǎn)基因鼠的動(dòng)物模型中得到證實(shí)。Gollob等[10]發(fā)現(xiàn)，PRKAG2基因突變R302Q引起AMPK活性降低，也引起心肌細(xì)胞大量糖原貯積及心肌肥厚表現(xiàn)；推測是否因先前AMPK活性增強(qiáng)引起糖原貯積，其后由于心肌肥厚后的負(fù)反饋導(dǎo)致AMPK活性降低。本研究亦發(fā)現(xiàn)R302Q突變導(dǎo)致心肌細(xì)胞糖原的大量貯積，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

鈣離子升高是心肌肥厚信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。當(dāng)心肌細(xì)胞受到機(jī)械牽張或心臟負(fù)荷增加時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度出現(xiàn)反應(yīng)性增加。心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的升高可激活細(xì)胞內(nèi)一系列依賴鈣離子的ATP酶，使ATP降解增加。這不僅使肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白脫耦聯(lián)受到抑制，而且使肌漿網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)膜的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)受損，進(jìn)一步使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高。以此形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致鈣離子超載。鈣離子超載可啟動(dòng)鈣離子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而參與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展。本研究從細(xì)胞水平證實(shí)，PRKAG2基因的R302Q突變對心肌細(xì)胞鈣離子庫沒有顯著影響，但存在AMPK活性紊亂引起的糖原貯積，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of R302Q Mutation on Glycogen and Calcium Ion Homeostasis of Cardiomyocytes in PRKAG2 Cardiac Syndrome

ZHANGYapingYANYan*SONGZhenjuTONGChaoyangDepartmentofEmergency,*DepartmentofCardiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To investigate the effect of R302Q mutation on glycogen and calcium ion homeostasis of cardiomyocytes in PRKAG2 cardiac syndrome. Methods:The rat H9C2 cardiomyocytes were infected with adenovirus containing enhanced green fluorescent protein(EGFP), PRKAG2-WT, and PRKAG2-R302Q,meanwhile, normal control group was set up.After 24 h and 48 h,Periodic acid-Schiff(PAS) staining was used to observe cardiomyocyte glycogen storage, and the glycogen content in cells was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Meanwhile, Rohd-2/AM vital dye was used to carry out calcium ion staining,and then the signal differences among calcium stores were analyzed by flow cytometry. Results: There was no obvious difference regarding glycogen staining and content between EGFP group and control group. Glycogen staining and content was slightly enhanced in PRKAG2-WT group, while glycogen staining and content was obviously enhanced in PRKAG2-R302Q group.However, the calcium ion homeostasis in each group was not affected. Conclusions: R302Q mutation leads to intra cardiomyocyte glycogen accumulation in PRKAG2 cardiac syndrome. However, calcium ion homeostasis is not affected and there is no calcium overload.

Key WordsPRKAG2 cardiac syndrome；R302Q mutation；Glycogen；Calcium overload

通訊作者童朝陽，E-mail: tong.chaoyang@zs-hospital.sh.cn

基金項(xiàng)目：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青年基金項(xiàng)目(編號：QNJJ2012-09)

中圖分類號R 541

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A