摘要：目的 探討大豆異黃酮（SI）減輕腦缺血再灌注（I/R）引起鈣超載的作用機制。方法 將48 只SD大鼠采用隨機數(shù)法分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、腦缺血再灌注模型組（I/R組）、病毒空載組（NC 組）、Frizzled-2敲低組（Knock down組），12只/組。采用線栓法堵塞大腦中動脈2 h，再灌注24 h構(gòu)建 I/R模型。采用Western blot驗證病毒敲低效率并檢測Wnt/Ca2+信號通路相關(guān)蛋白Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ的變化。采用鈣含量顯色法檢測各組缺血半暗帶（IP）區(qū)鈣離子濃度變化，HE檢測各組IP區(qū)組織結(jié)構(gòu)變化。另將72只SD大鼠采用隨機數(shù)法分為3組：Sham組、I/R組、大豆異黃酮預(yù)處理組（SI組），24只/組。采用多普勒血流儀檢測局部腦血流變化，TTC染色檢測腦梗死體積，HE和尼氏染色檢測IP 區(qū)組織變化、免疫熒光檢測ROS、Ca2+和細胞凋亡水平、流式檢測細胞鈣離子濃度，試劑盒檢測血清MDA和SOD水平，Western blotting 和免疫組化檢測IP區(qū)Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ蛋白表達。結(jié)果 與I/R 組比較，Knock down 組鈣離子濃度（Plt;0.001）、Wnt5a（Plt;0.05）、Frizzled-2（Plt;0.05）和P-CaMKⅡ（Plt;0.001）表達水平均降低；與I/R組比較，SI 組鈣離子濃度（Plt;0.05）、ROS 和MDA水平（Plt;0.001）、細胞凋亡程度（Plt;0.001）、腦梗死體積（Plt;0.001）、Wnt5a、Frizzled-2 和P-CaMKⅡ表達水平（Plt;0.05）均降低，SOD水平升高（Plt;0.001）。結(jié)論大豆異黃酮可能通過抑制Wnt/Ca2+信號通路減輕大鼠腦缺血再灌注引起的鈣超載

關(guān)鍵詞：大豆異黃酮；腦缺血再灌注；鈣超載；Wnt/Ca2+

腦卒中可分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占所有病例的80%［1］。血流阻塞或血供不足是缺血性腦卒中的根本原因，缺血性腦卒中導致大腦供氧和葡萄糖減少，進而引發(fā)興奮毒性、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等一系列病理事件，最終導致不可逆的神經(jīng)元損傷［2， 3］。腦卒中后腦血流的恢復(fù)可以挽救缺血神經(jīng)元損傷，但也可引起腦缺血再灌注損傷（CIRI）［1， 4］。CIRI的形成機制復(fù)雜，鈣超載是導致 CIRI 后神經(jīng)元持續(xù)損傷的一個關(guān)鍵機制［5］。有研究認為在腦缺血的前期，短暫的葡萄糖和氧剝奪會觸發(fā)對N-甲基-D-天冬氨酸受體的持續(xù)刺激，導致相關(guān)Ca2+通道的激活和Ca2+ 內(nèi)流進入細胞，進而導致神經(jīng)元損傷甚至死亡［6］。也有研究認為ROS會影響Ca2+進入細胞內(nèi)和Ca2+的儲存［7， 8］。但目前對于腦缺血再灌注過程中鈣超載具體機制仍不明確。Wnt/Ca2+信號通路目前被認為在細胞內(nèi)鈣代謝中起關(guān)鍵作用［9］，但其是否參與缺血再灌注鈣超載尚未見報道。深入研究腦缺血再灌注引起的鈣超載與Wnt/Ca2+通路的關(guān)系，對于研究CIRI的具體機制及尋求治療的新靶點具有重要意義。

大豆異黃酮（SI）是從大豆中提取的一種帶芳香A-環(huán)的三苯基異黃酮類化合物，在抗癌、防骨質(zhì)疏松、防治心血管疾病等多方面都有其獨特功效［10， 11］。既往研究表明SI可以通過調(diào)節(jié)鈣離子和鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）減輕CIRI［12-14］，CaMKⅡ活性檢測可以作為Wnt/Ca2+信號通路的標志物［15］。SI 能否通過調(diào)控Wnt/Ca2+信號通路改善腦缺血再灌注導致的鈣超載損傷尚未見報道。

本研究通過SI 預(yù)處理，采用線栓法構(gòu)建大腦中動脈缺血再灌注模型，探討SI 對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶內(nèi)鈣水平的影響及其可能的作用機制，為治療CIRI提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級成年雄性SD大鼠（250～280 g），購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，均在適當?shù)拿芏认嘛曫B(yǎng)，環(huán)境、溫度、濕度適宜，光照/黑暗周期為12 h/12 h，自由飲水和進食。所有動物實驗均經(jīng)蚌埠醫(yī)科大學動物研究倫理委員會批準（倫理編號：2021-206）。

1.1.2 主要試劑和儀器

腺相關(guān)病毒（上海漢恒生物有限公司）； SI（Acmec，純度40%，S64650）；栓線（北京西濃科技公司）；2，3，5- 三苯基氯化四氮唑（TTC，Solarbio）；蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；Wnt5a、β-actin 抗體（abcolne）；P-CaMK Ⅱ、CaMKⅡ抗體（Abcam）；Frizzled-2 抗體和山羊抗兔二抗（Affinity）；HE染料（Biosharp）；尼氏染料（源葉）；鈣含量顯色試劑盒、超氧化物陰離子熒光檢測探針DHE、鈣離子試劑盒和一步TUNEL 染色試劑盒（碧云天）；MDA 和SOD 試劑盒（南京建成有限公司）；電泳儀（Servicebio）；激光多普勒血流儀（Perimed）；高端倒置熒光顯微鏡（Obsever）； 流式細胞儀（貝克曼）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥

采用隨機數(shù)法將48只SPF級雄性SD大鼠（250g～280 g）隨機分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、腦缺血再灌注模型組（I/R 組）、病毒空載組（NC組）、Frizzled-2敲低組（Knock down組），12只/組。其中NC組和Knock down組對大鼠進行側(cè)腦室注射腺相關(guān)病毒，NC組為Knock down組的陰性對照組，注射21 d后再構(gòu)建腦缺血再灌注模型。再采用隨機數(shù)法將另外72 只SPF級雄性SD大鼠（250g～280 g）隨機分為3 組：假手術(shù)組（Sham組）、腦缺血再灌注模型組（I/R組）、SI預(yù)處理組（SI組），24只/組。SI組給予SI（120 mg/kg）［13］灌胃21 d后構(gòu)建腦缺血再灌注模型，Sham組和I/R組給予等體積生理鹽水灌胃，I/R組21 d后構(gòu)建腦缺血再灌注模型，Sham 組不插栓線其他步驟同I/R組。

1.2.2 腦缺血再灌注模型的建立

手術(shù)前將大鼠麻醉（1%戊巴比妥鈉，腹腔注射，40 mg/kg）俯臥位置于手術(shù)平板上。剃除頭部的毛發(fā)并用酒精消毒，剪開額頂部的皮膚并剔除皮下組織和骨膜，暴露中線、冠狀縫和右頂骨，使用牙科鉆在顱骨頂骨上橫竇上方、上矢狀竇外側(cè)、冠狀縫下方形成一骨窗［16］，穿透顱骨至硬腦膜，將多普勒激光探頭固定于此，實時檢測局部腦血流（rCBF）變化。

采用改良的Longa's法建立大腦中動脈缺血再灌注模型［17］。沿頸部正中線切開，仔細剝離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎ECA和CCA 近心端，動脈夾短暫夾閉CCA，在動脈夾與CCA結(jié)扎處中間打一活結(jié)。于CCA結(jié)扎處遠心端剪一斜口，將栓線經(jīng)此斜口輕輕向前推進，拉緊活結(jié)固定住栓線，松開動脈夾從CCA經(jīng)ICA入顱至大腦前動脈，阻斷大腦中動脈形成缺血。缺血2 h后，拔出栓線以恢復(fù)腦血流灌流24 h，模擬急性腦缺血再灌注模型。

1.2.3 側(cè)腦室注射敲低Frizzled-2 的腺相關(guān)病毒

采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）對大鼠進行腹腔注射，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［18］中列出的坐標定位側(cè)腦室（前囟后1 mm，正中線右側(cè)1.5 mm，深度4 mm），并用牙科鉆在此位置上鉆1個直徑2 mm的小孔，暴露硬腦膜。使用吸取5 μL腺相關(guān)病毒溶液的微量注射器緩慢（1 μL/min）注射到側(cè)腦室。注射結(jié)束后靜置5 min再取下針頭，棉簽按壓以防出血，最后進行頭皮縫合。

1.2.4 腦梗死體積檢測和行為學評分

大鼠麻醉后立即處死，斷頭取腦，用預(yù)冷的PBS清洗后置于-80 ℃冰箱速凍1 h，取出后在冰上切成6片2 mm厚的冠狀腦切片。將腦片置于2% TTC染液中37 ℃水浴孵育10 min，再將腦片翻面繼續(xù)孵育10 min，隨后置于4%多聚甲醛中固定，隔日拍照并利用Image J 進行腦梗死面積的分析。紅色區(qū)域為未梗死區(qū)，白色區(qū)域為梗死區(qū)。腦梗死體積比=各腦切片梗死面積和/各腦切片面積和×100%。

再灌注24 h后，參照Longa's評價指標進行神經(jīng)學評分［17］。無神經(jīng)功能缺陷：0 分；對側(cè)上肢不能完全伸展：1分；行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈：2分；行走時向?qū)?cè)傾倒：3分；不能自動行走，存在意識喪失現(xiàn)象：4分。選擇評分在1～3的進行后續(xù)實驗，并在各組大鼠中隨機選擇6只，進行統(tǒng)計學分析。

1.2.5 腦組織HE染色和尼氏染色

再灌注24 h后麻醉大鼠，先用0.9%生理鹽水進行心臟灌注，再用4%多聚甲醛緩慢灌注直至肺變白，最后取腦置于4%多聚甲醛中4 ℃冰箱存放。隔日進行梯度酒精脫水、浸蠟、包埋和切片，分別進行HE和尼氏染色。

1.2.6 腦組織ROS、Ca2+免疫熒光染色

再灌注24 h 后麻醉大鼠，立即取腦置于-80 ℃速凍后直接包埋制成冰凍切片。用預(yù)冷的PBS清洗切片3遍于室溫稍晾干，再用組化筆圍組織畫圈，后分別滴加DHE探針和Fluo-4探針，37 ℃水浴孵育30 min，隨后用PBS清洗3遍，再用DAPI 染液室溫孵育5 min，PBS清洗5 遍，滴加抗熒光淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡采集圖像并利用 Image J進行分析。

1.2.7 腦組織TUNEL免疫熒光染色

再灌注24 h后麻醉大鼠，進行心臟灌注后取腦置于4%多聚甲醛中固定24 h，后置于20%～30%蔗糖中脫水，OCT包埋制備冰凍切片。根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明書染色，PBS洗3 遍后用DAPI 染色液染色，再用PBS清洗3 遍后封片。采用熒光顯微鏡觀察TUNEL陽性細胞，Image J計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)，隨機選取3張圖片計算細胞凋亡率。TUNEL細胞陽性率（%）=TUNEL細胞陽性數(shù)/DAPI細胞數(shù)×100%。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測鈣離子濃度

再灌注24 h后取各組大鼠缺血半暗帶區(qū)域腦皮質(zhì)組織并制備成單細胞懸液，用Fluo-4探針37 ℃孵育30 min，PBS清洗2遍，后用緩沖液重懸上機檢測。

1.2.9 分光光度法檢測血清中MDA和SOD水平

再灌注24 h后麻醉大鼠，開腹腔通過腹主動脈采血離心收集血清，按試劑盒說明書加入待測樣品和相應(yīng)試劑后置于酶標儀中檢測各組吸光度值，帶入相應(yīng)公式計算各項指標含量。

1.2.10 Western blot 和免疫組織化學檢測Wnt5a、Frizzled-2 和P-CaMKⅡ的表達水平

再灌注24 h 后取腦組織缺血半暗帶區(qū)域勻漿并裂解，取蛋白上清BCA測定蛋白濃度、變性、上樣（30 μg）、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶或5%BSA 封閉2 h，Wnt5a（1∶1000）、Frizzled-2（1∶1000）、P-CaMKⅡ（1∶4000）和CaMKⅡ（1∶25 000）抗體，4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗膜，山羊抗兔二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜，滴加曝光液顯影并拍照。取各組腦組織石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、血清封閉，一抗4 ℃過夜、二抗避光孵育15 min；用DAB液顯色后行細胞核復(fù)染、脫水封片置于顯微鏡下觀察。

1.2.11 鈣含量顯色法測定腦組織鈣離子濃度

再灌注24 h將大鼠處死后取腦組織，將IP區(qū)腦組織剪切成細小的碎片，按試劑盒說明書加入待測樣品和相應(yīng)試劑后置于酶標儀中檢測各組吸光度值，帶入相應(yīng)公式計算各項指標含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8 軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，所有計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析比較多組間差異，采用T多重比較法比較兩組間差異。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt/Ca2+ 信號通路介導腦缺血再灌注引起的鈣超載

Western blotting 檢測Frizzled-2 敲低效果和Wnt/Ca2+信號通路相關(guān)蛋白的表達結(jié)果顯示，與Sham組相比，NC組的差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），Knock down組Frizzled-2蛋白表達降低約50%（Plt;0.001，圖1A、B）；I/R組Wnt5a、P-CaMKⅡ和Frizzled-2的表達增高。與I/R 組相比，Knock down 組Wnt5a、P-CaMK Ⅱ 和Frizzled-2 的表達均降低（圖1C～F）。鈣含量顯色法檢測各組腦組織鈣離子濃度的結(jié)果顯示，與 Sham 組相比，I/R組鈣離子濃度明顯增高；與 I/R 組相比，NC 組的差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），Knock down 組鈣離子濃度降低（圖1G）。HE結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組組織結(jié)構(gòu)分布紊亂，可見大量空泡，染色不均，胞核深染。與I/R組相比，NC 組無明顯變化，Knock down組病理損傷可見明顯改善（圖1H）。

2.2 腦缺血再灌注模型建立過程中局部腦血流的變化

I/R組（圖2A）和SI組（圖2B）大鼠局部腦血流檢測結(jié)果顯示，插線后兩組rCBF均迅速降至初始值的10%～20%，2 h 后拔出栓線血流恢復(fù)至初始值的50%～60%。在缺血的2 h內(nèi)血流保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，但 I/R 組血流恢復(fù)速度慢于SI組。

2.3 SI對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積和神經(jīng)缺損評分的影響

采用TTC 染色檢測大鼠腦梗死體積，結(jié)果顯示Sham組未見明顯梗死區(qū)域，I/R組出現(xiàn)明顯的梗死區(qū)（Plt;0.001），而SI組梗死體積較I/R組明顯減?。≒lt;0.001，圖3A、B）。Sham組未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙癥狀，神經(jīng)功能評分為0。而I/R組大鼠神經(jīng)功能缺失評分明顯高于Sham 組（Plt;0.001），SI組癥狀明顯輕于I/R組（Plt;0.01，圖3C）。

2.4 SI對腦缺血再灌注大鼠腦組織病理學形態(tài)

HE染色和尼氏染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，細胞排列整齊，細胞輪廓清晰，未見壞死細胞，尼氏小體、細胞核及核仁清晰可見。I/R組大鼠腦組織排列不規(guī)則，染色不均勻，細胞間隙增大，細胞數(shù)量明顯減少，尼氏小體縮小，分布紊亂，細胞核較小甚至消失。而SI組病理損傷有所改善（圖4）。

2.5 SI對腦缺血再灌注大鼠腦組織胞內(nèi)鈣離子的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組鈣離子熒光強度明顯增強，SI組鈣離子熒光強度介于Sham組和I/R組之間（Plt;0.001，圖5A、B）。流式細胞術(shù)呈現(xiàn)相同趨勢（Plt;0.05，圖5C、D）。

2.6 SI對腦缺血再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響

與Sham組相比，I/R組ROS熒光強度、MDA水平增加，SOD水平下調(diào)（Plt;0.001）。與I/R組相比，SI組ROS熒光強度、MDA水平降低，SOD上調(diào)（Plt;0.001，圖6）。

2.7 SI對細胞凋亡的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組凋亡細胞陽性率明顯增高，與I/R組相比，SI組凋亡細胞陽性率降低（Plt;0.001，圖7）。

2.8 SI 對大鼠局灶性腦缺血再灌注后Wnt/Ca2+信號通路相關(guān)蛋白的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組Wnt/Ca2+ 信號通路相關(guān)蛋白Wnt5a、Frizzled-2 和PCaMKⅡ表達明顯升高（Plt;0.001）；與I/R組相比，SI 組Wnt5a、Frizzled-2、P-CaMKⅡ蛋白的表達量均降低（Plt;0.05，圖8A）。免疫組化結(jié)果也顯示，與Sham組相比，I/R組Wnt5a、Frizzled-2 和P-CaMKⅡ蛋白表達水平明顯升高；與I/R組相比，SI組Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ蛋白的表達量均降低（圖8B）。

3 討論

CIRI的病理生理機制復(fù)雜，尚未完全清晰，目前認為涉及以下多種可能的機制：氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細胞內(nèi)鈣超載及血腦屏障破壞等［19-23］。這些發(fā)病機制互為因果、共同作用，推動CIRI的發(fā)生發(fā)展。既往研究表明細胞內(nèi)鈣超載在CIRI的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用［24， 25］，也是多數(shù)情況下細胞死亡的最后共同通路［26］，但目前對于探討鈣超載在腦缺血再灌注中的具體機制及通過改善鈣超載來治療CIRI的研究甚少。本研究首次證實了Wnt/Ca2+信號介導腦缺血再灌注鈣超載損傷，并發(fā)現(xiàn)SI 可能通過減輕Wnt/Ca2+信號通路減輕CIRI。

SI主要分為游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩種形式，其中糖苷不具有活性，需要在腸道菌群的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚攒赵l(fā)揮療效［27， 28］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SI以120 mg·kg-1·d-1的劑量治療腦缺血再灌注大鼠表現(xiàn)出較好的療效［13］。因此，本研究沿用此劑量以灌胃的給藥方式對大鼠進行術(shù)前干預(yù)，采用改良版線栓法大腦中動脈堵塞模型誘導大鼠CIRI模型，在模型構(gòu)建過程中采用 LDF 實時監(jiān)測大鼠rCBF的動態(tài)變化。LDF可以準確地體現(xiàn)腦內(nèi)的微循環(huán)灌注情況［29］，也可作為判斷MCAO模型構(gòu)建成功的依據(jù)［30］。本研究監(jiān)測結(jié)果可見，I/R 組插線后rCBF驟降，拔線后rCBF恢復(fù)緩慢且恢復(fù)速度明顯慢于SI組，提示MCAO模型構(gòu)建成功且SI預(yù)處理可改善再灌注初期血流的低灌注情況。

SI 是大豆中的異黃酮類化合物的總稱，因其抗氧化、抗炎作用目前多被用于抗癌研究［31-33］。研究表明，SI 在減輕CIRI 中也發(fā)揮一定的作用［34］，但對于SI 在CIRI鈣超載層面的研究較少。為探討SI是否能夠減輕腦缺血再灌注誘導的鈣超載，本研究采用免疫熒光和流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)鈣離子的濃度，結(jié)果顯示I/R組胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，SI 組鈣離子降低，提示 SI 可改善腦缺血再灌注誘導的鈣超載。

Wnt/Ca2+ 信號通路一種非典型 Wnt 通路，在早期胚胎發(fā)育、癌癥進展、神經(jīng)間通訊、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用［35-38］。Wnt/Ca2+ 通路激活可誘使細胞內(nèi)Ca2+ 濃度升高并可活化Ca2+ 敏感信號成分，在介導細胞Ca2+ 超載、氧化應(yīng)激和凋亡等病理過程中扮演重要角色。既往研究探討缺血再灌注損傷誘導的鈣超載機制主要集中在再灌注后鈉-鈣交換體的功能失調(diào)、內(nèi)源性兒茶酚胺的增多導致的鈣通道開放增加和生物膜損傷通透性增加［19，39，40］，而較少關(guān)注Wnt/Ca2+信號通路在細胞內(nèi)鈣代謝中起的作用。既往關(guān)于Wnt/Ca2+ 信號通路在缺血再灌注損傷的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞中Wnt5a和Frizzled-2表達增加，細胞中的鈣離子含量增多，抑制細胞中Frizzled-2表達后，缺血再灌注損傷后心肌細胞中鈣離子含量顯著下降［41］；也有研究發(fā)現(xiàn)肝組織缺血再灌注損傷后Wnt5a和Frizzled-2表達上調(diào)，靶向抑制肝細胞Frizzled-2表達能減輕缺血再灌注誘導的細胞毒性、細胞凋亡和細胞內(nèi)鈣離子水平［42］。這提示我們在缺血再灌注損傷中，Wnt/Ca2+ 信號通路會被激活，而靶向抑制Frizzled-2可以減輕缺血再灌注損傷。另有學者發(fā)現(xiàn)腦創(chuàng)傷可通過 Wnt5a/Frizzled-2信號通路導致神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載，靶向抑制Frizzled-2能抑制腦創(chuàng)傷誘導的神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度過度增加［43］。這提示腦組織也存在 Wnt/Ca2+ 通路，而靶向抑制 Frizzled-2 可以減輕神經(jīng)細胞損傷。因此本研究為驗證 Wnt/Ca2+ 信號通路在大鼠腦缺血再灌注后是否被激活，同樣選擇靶向抑制 Frizzled-2以達到抑制Wnt/Ca2+ 信號通路的作用。Wnt/Ca2+ 信號主要由Wnt5a 和 Frizzled-2 啟動，且CaMKⅡ是Wnt/Ca2+信號通路的標志物［44］，故本研究采用 Western blotting 檢測Wnt5a、Frizzled-2和 P-CaMKⅡ的蛋白表達水平，結(jié)果顯示成功敲低了Frizzled-2，且與 Sham 組相比，I/R組這些蛋白的表達均增高，說明在CIRI中 Wnt/Ca2+ 信號通路被上調(diào)，而敲低Frizzled-2后，這些蛋白的表達水平又有所降低，敲低Frizzled-2可以有效地抑制 Wnt/Ca2+信號通路。HE結(jié)果顯示，與I/R組相比，Knock down 組的病理損傷明顯減輕，再次說明了 Wnt/Ca2+ 信號通路確實參與腦缺血再灌注這一病理過程且抑制 Wnt/Ca2+信號通路可以減輕腦缺血再灌注病理損傷。采用鈣含量顯色法檢測 IP 區(qū)鈣離子濃度結(jié)果顯示與 I/R 組相比，Knock down 組的鈣離子濃度降低，表明Wnt/Ca2+信號通路介導腦缺血再灌注鈣超載損傷。我們猜測SI改善腦缺血再灌注誘導的鈣超載與調(diào)控Wnt/Ca2+ 信號通路有關(guān)。為驗證該想法，本實驗采用Western blotting檢測了SI 組Wnt5a、Frizzled-2 和P-CaMKⅡ的蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與I/R組相比，SI組這些蛋白表達水平降低，說明SI 可以抑制Wnt/Ca2+信號通路，SI 可能通過抑制Wnt/Ca2+信號通路減輕腦缺血再灌注引起的鈣超載。

胞內(nèi)鈣超載可引起自由基堆積、線粒體功能障礙及穩(wěn)態(tài)失衡，激活神經(jīng)元一氧化氮合酶以形成一氧化氮，激活磷脂酶和蛋白酶降解細胞脂質(zhì)及相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白，還可激活核酸酶引起DNA損傷［45］，并導致羥基自由基等生成增加，進一步加重氧化應(yīng)激，最終引起神經(jīng)元凋亡或壞死［46］。超氧化物陰離子具有濃度水平極低、活性較高、壽命短、易轉(zhuǎn)化等特點，且是機體最先產(chǎn)生的ROS，可直接反應(yīng)腦組織氧化應(yīng)激水平。MDA可間接反應(yīng)氧化應(yīng)激損傷程度，而SOD是機體抗氧化的關(guān)鍵酶。為探討SI 是否能夠影響機體的氧化應(yīng)激水平，本研究采用免疫熒光和分光光度法分別檢測腦組織中超氧化物陰離子和血清中MDA和SOD的含量，結(jié)果顯示I/R組超氧化物陰離子和MDA水平明顯升高，SI組相應(yīng)指標均降低，SOD水平呈現(xiàn)相反趨勢，提示SI可改善腦缺血再灌注誘導的氧化應(yīng)激。進一步采用免疫熒光檢測各組的細胞凋亡情況，結(jié)果顯示SI組細胞凋亡數(shù)量較 I/R組明顯減少，提示SI 可減少腦缺血再灌注誘導的細胞凋亡。以上結(jié)果表明，SI對腦缺血再灌注后細胞凋亡、氧化應(yīng)激水平變化的影響趨勢與鈣離子水平變化一致。為探討SI是否會減輕腦缺血再灌注后的梗死體積和病理損傷，本研究采用TTC、HE和Nissl染色分別檢測各組的腦梗死體積和病理損傷程度，結(jié)果也顯示 SI 可減少腦缺血再灌注導致的腦梗死體積和病理損傷程度，提示 SI 可減輕CIRI。然而，本研究的結(jié)果大部分都局限于表型實驗，后續(xù)仍需進一步探討 SI 抑制 Wnt/Ca2+ 信號通路減輕CIRI的具體分子機制。

綜上所述，腦缺血再灌注會激活 Wnt/Ca2+ 信號通路并介導缺血再灌注后的鈣超載，SI 可能通過抑制Wnt/Ca2+ 信號通路減輕腦缺血再灌注誘導的鈣超載減輕CIRI。

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（編輯：郎 朗）

基金項目：安徽省教育廳自然科學重大研究項目（KJ2021ZD0091）；安徽省大學生創(chuàng)新項目（S202210367110）；蚌埠醫(yī)科大學“512 人才培育計劃”（by51202204）；安徽省大學生創(chuàng)新項目（S202310367066）