李光全,王云紅,陶 敏,王 丹,劉 丹,彭 瑾,王壽明,劉成鼎*

(1.重慶市墊江縣中醫(yī)院 藥學(xué)部,重慶 408300;2.重慶市中藥研究院,重慶 400065)

牡丹皮Moutan Cortex為毛茛科芍藥屬植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有清熱涼血、化瘀活血等功效,主要用于熱入營血、溫毒發(fā)斑、吐血衄血、夜熱早涼、無汗骨蒸、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲傷痛、臃腫瘡毒等癥[1]。牡丹皮在我國已有2 000多年的藥用歷史,是臨床常用中藥之一,如《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(第九版)[2]就推薦將其與別的藥配伍用作新冠肺炎重癥患者氣營兩燔證的治療。

在孕蕾期摘除花蕾是牡丹皮規(guī)范化種植的技術(shù)要求[3-4],其原因是該方法可以減少營養(yǎng)消耗、提高牡丹皮的產(chǎn)量。然而,產(chǎn)量高不等于品質(zhì)好,此方法能否提高藥材品質(zhì),可從化學(xué)成分方面進(jìn)行研究。因此,本研究在前期研究成果的基礎(chǔ)上[5],以浸出物、丹皮酚及主要特征化學(xué)成分含量為評價指標(biāo),進(jìn)一步考查了摘花摘果對牡皮品質(zhì)的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司),配紫外檢測器(SPD-20A);LabSolutions色譜分析軟件;CP214型萬分之一天平(奧豪斯儀器[上海]有限公司);DV215CD型十萬分之一天平(奧豪斯儀器[上海]有限公司);DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司);2500A型多功能粉碎機(jī)(永康市紅太陽機(jī)電有限公司)。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)藥材 試驗(yàn)?zāi)档榉N植在重慶市墊江縣沙坪鎮(zhèn)雙塘村的牡丹,按試驗(yàn)需要分別進(jìn)行如下處理:花蕾期摘花(摘花組),花凋謝時摘果(摘果組),不摘花果(對照組)。其具體栽培條件、試驗(yàn)處理、采收方法同前期研究[5]。采收并測量根徑后,剪取牡丹根(最粗端10cm)作為檢測樣本,按《中國藥典》2020版方法制成“連丹皮”并趁鮮切成薄片,按各樣本的組別歸屬分別存放,經(jīng)50℃烘干,制成對照組、摘花組、摘果組飲片。

1.2.2 藥品與試劑 丹皮酚(批號:110708-201908,純度:99.8%,中國食品藥品檢定研究院);乙醇(AR,批號:2021052402,成都科隆化學(xué)品有限公司);乙腈(色譜純,批號:011210801,美國BCR試劑公司);超純水,自制。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 浸出物測定

取對照組、摘花組、摘果組牡丹皮飲片適量,分別打粉過二號篩。每組平行取樣3份(共9個試驗(yàn)樣本),按照《中國藥典》2020版4部“醇溶性浸出物測定法”(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法進(jìn)行測試。即取本品粉末約2.5g,精密稱定,置250mL錐形瓶中,加乙醇100mL,密塞,稱定重量,靜置1h后,連接回流冷凝管,水浴加熱至沸騰,并保持微沸1h。放冷后,取下錐形瓶,密塞,再稱定重量,用乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,用干燥濾器濾過,精密量取濾液25mL(再量取10mL留作HPLC指紋圖譜檢測),置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,在水浴上蒸干,于105℃干燥3h,置干燥器中冷卻30min,精密稱定重量,直至恒重;以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 供試品溶液制備 按“2.1”項(xiàng)下方法操作,留取的濾液過0.22μm濾膜,即得供試品溶液。

2.2.2 丹皮酚對照品溶液制備 精密稱取丹皮酚對照品7.07mg,加乙醇定容至5mL,配制成質(zhì)量濃度為1.414mg/mL的對照品溶液,于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。本研究用到的其他對照品因不用做定量分?其配制方法不再贅述。

2.2.3 色譜條件 納普ChromCore 120 C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相為乙腈-0.01%磷酸水,流速1.0mL/min,柱溫30℃,進(jìn)樣量10μL,檢測波長250nm,梯度洗脫:0～5min,10%乙腈;5～40min,10%～20%乙腈;40～60min,20%～50%乙腈;60～70min,50%～60%乙腈;70～75min,60%～95%乙腈;75～80min,95%～10%乙腈;80～90min,10%～10%乙腈。

2.2.4 指紋圖譜建立 將9個牡丹皮試驗(yàn)樣品按“2.2.1”項(xiàng)方法處理后按照“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行HPLC分析,再將各HPLC色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”,建立指紋圖譜,并進(jìn)行相似度分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 摘花摘果對牡丹皮浸出物的影響

藥材浸出物是衡量中藥材質(zhì)量的重要指標(biāo),本研究按實(shí)驗(yàn)方法測定供試品溶液,測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,摘花組、摘果組和對照組醇溶性浸出物的測定結(jié)果均高于藥典要求(不得少于15.0%)。其中對照組浸出率最小,平均為21.05%;摘花組和摘果組浸出物含量差異不大,均比對照組高約6%。結(jié)果表明,摘花摘果處理均可提高牡丹皮醇溶性成分的含量。

表1 摘花摘果不同處理牡丹皮的浸出物

3.2 摘花摘果不同處理牡丹皮指紋圖譜相似度評價

將9個牡丹皮試驗(yàn)樣本HPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”,設(shè)定S6為參照圖譜,采用平均數(shù)法,時間窗寬度為0.1,進(jìn)行多點(diǎn)校正、匹配,生成對照圖譜(圖1)。根據(jù)指紋圖譜情況,選定具有代表性的8個共有色譜峰作為特征峰(特征峰選擇依據(jù):①峰型及分離度均良好;②不同極性段;③已知的活性指標(biāo)成分)。通過與對照品圖譜比對、查閱文獻(xiàn)資料共指認(rèn)出5個色譜峰(圖1),分別為1號色譜峰沒食子酸、2號色譜峰氧化芍藥苷、5號色譜峰芍藥苷、7號色譜峰苯甲酰芍藥苷、8號色譜峰丹皮酚。整理出各樣品8個特征峰的保留時間和峰面積,得到表2和表3。根據(jù)表2數(shù)據(jù),各共有峰相對保留時間的RSD在0.05%～1.92%(<5%),表明不同處理下各特征化學(xué)成分組成基本一致。將9個牡丹皮樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜匹配,進(jìn)行相似度評價,結(jié)果各批次牡丹皮與對照指紋圖譜之間的相似度在 0.978～0.998,表明各樣本之間一致性較好。

圖1 9個不同牡丹皮樣本指紋圖譜

表2 摘花摘果不同處理牡丹皮圖譜共有峰的保留時間

表3 摘花摘果不同處理牡丹皮圖譜共有峰的峰面積

3.3 摘花摘果對牡丹皮丹皮酚含量的影響

丹皮酚是牡丹皮的重要有效成分,也是其質(zhì)量標(biāo)志指標(biāo)之一?！吨袊幍洹?020版規(guī)定牡丹皮含丹皮酚不得少于1.2%(按干燥品計(jì)算)。將配制好的丹皮酚對照品溶液按“3.2.3”項(xiàng)下方法和條件進(jìn)樣,得到丹皮酚對照品溶液的HPLC圖譜(圖2)。對比圖1中各批牡丹皮樣本指紋圖譜特征峰,可將丹皮酚歸屬到8號峰。通過樣品及對照品的峰面積,計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)樣本牡丹皮含量(表4)。表中數(shù)據(jù)顯示,各組樣品丹皮酚含量均超過了1.2%,符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。摘花組、摘果組平均丹皮酚含量均為1.35%,而對照組丹皮酚含量為1.74%。結(jié)果提示,摘花、摘果會減低牡丹皮中丹皮酚的含量。

圖2 丹皮酚對照品溶液的HPLC圖譜

表4 摘花摘果不同處理牡丹皮中丹皮酚含量

3.4 摘花摘果不同處理牡丹皮特征化學(xué)成分差異性比較

為比較摘花摘果不同處理對牡丹皮特征化學(xué)成分含量的影響,本研究通過在同一水平比較各共有特征峰的峰面積。將表3中各峰面積值分別除以對應(yīng)樣本的生藥取藥量,得到各色譜峰折算峰面積(相當(dāng)于每單位重量生藥的峰面積,表5)。如表5所示,各特征峰的相對峰面積RSD在2.55%～14.79%之間,表明摘花摘果處理對牡丹皮化學(xué)成分含量的影響因成分不同而有差異。為了更直觀地比較其差異,以表5數(shù)據(jù)計(jì)算出各處理組特征峰峰面積平均值,再以對照組為參照,得到各組特征色譜峰平均折算峰面積的相對值(表6)。由表6可知,相較于對照組,摘花組和摘果組各特征色譜峰的峰面積有的增加、有的減少。其中,平均峰面積增加的特征峰為3號峰、4號峰;平均峰面積減少的特征峰為1號峰(沒食子酸)、2號峰(氧化芍藥苷)、5號峰(芍藥苷)、6號峰、7號峰(苯甲酰芍藥苷)、8號峰(丹皮酚)。結(jié)果提示,摘花摘果處理對牡丹皮化學(xué)成分的影響因化學(xué)成分不同而不同。

表5 摘花摘果不同處理牡丹皮圖譜共有峰的折算峰面積

表6 特征圖譜共有峰平均折算峰面積的相對值(與對照組比較)

4 討論

已有研究表明,摘花和摘果均可提高牡丹皮產(chǎn)量和質(zhì)量[6]。本課題組的前期研究結(jié)果也證實(shí)摘花和摘果可提高牡丹皮產(chǎn)量,其影響的程度與開花數(shù)量有關(guān)[5]。然而,上述結(jié)果均是從性狀、大小等方面評價,未在化學(xué)成分層面進(jìn)行研究。中藥化學(xué)成分是中藥藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ),是中藥品質(zhì)評控的重要指標(biāo)。故本研究基于化學(xué)成分出發(fā),以浸出率、丹皮酚和特征化學(xué)成分含量等多指標(biāo)客觀評價摘花、摘果對牡丹皮品質(zhì)的影響。

如表1所示,摘花、摘果均可提高牡丹皮浸出率,其中摘花效果略優(yōu)于摘果。從特征指紋圖譜相似度評價來看,各樣本相似度在97.8%以上,表明摘花、摘果不會改變牡丹皮化學(xué)成分。但是,值得注意的是,通過對比各處理組丹皮酚(表4)及其他特征化學(xué)成分含量(表6),可以發(fā)現(xiàn)摘花、摘果對牡丹皮化學(xué)成分的影響并不一致,即在提高了某些成分含量的同時,降低了另一些成分的含量。具體到相關(guān)特征化學(xué)成分,選定的8個代表化學(xué)成分中只有2個是增加的,余下6個全部降低。被指認(rèn)的沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚等5個化學(xué)成分,全部歸屬于含量降低的6個特征成分中,而含量增加的3號峰和4號峰尚不明確是何種物質(zhì)。上述結(jié)果表明,摘花或摘果處理提高了牡丹皮化學(xué)成分的總量,但具體到不同成分卻各有差異。沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚等5個成分為牡丹皮重要的質(zhì)量標(biāo)志物[7],本研究結(jié)果顯示,摘花和摘果后牡丹皮中上述成分的含量有所降低,據(jù)此可以認(rèn)為摘花或摘果處理可能不利于牡丹皮品質(zhì)的提升。

本研究結(jié)果也帶來了許多重要提示:一方面,摘花摘果會降低牡丹皮中丹皮酚等多個化學(xué)成分的含量,田云芳等[8]研究表明牡丹皮中丹皮酚含量隨生長時期而變化,其含量在花期與果熟期達(dá)到峰值,且前者更高。結(jié)合本研究,可以推測開花或結(jié)果可能有助于牡丹皮中丹皮酚等化學(xué)成分的生物合成,而摘花或摘果會減弱這種作用,不過此推測有待后期進(jìn)一步驗(yàn)證;另一方面,可以運(yùn)用該結(jié)果進(jìn)行牡丹皮種植技術(shù)指導(dǎo),若以產(chǎn)量為導(dǎo)向,在牡丹皮栽種過程中可以摘花摘果,若以丹皮酚含量為代表的品質(zhì)為導(dǎo)向,則應(yīng)保留花果。

本研究有一些不足之處:首先,牡丹皮一般要種植4～5年才可采收[9],其化學(xué)成分是成年累月的增長結(jié)果,單次的摘花摘果并不能預(yù)示牡丹皮化學(xué)成分的最終變化,需進(jìn)一步進(jìn)行逐年的摘花摘果試驗(yàn)研究,評價其對牡丹皮品質(zhì)的影響;其次,本課題組的前期研究結(jié)果表明摘花摘果對牡丹皮產(chǎn)量的影響因開花數(shù)量不同而不同[5],而本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時未按牡丹植株花蕾數(shù)量進(jìn)行分組研究,摘花摘果對不同花蕾數(shù)量的牡丹皮化學(xué)成分的影響情況不得而知,這些有待進(jìn)一步深入探索。