關(guān)琴笑,廖嘉儀,張玉娥,李綺婷,譚娥玉,宋向崗

(1.江門市五邑中醫(yī)院,廣東 江門 529000;2.江門市藥品檢驗(yàn)所,廣東 江門 529000)

慢性支氣管炎(Chronic bronchitis,CB)是臨床發(fā)病率較高的呼吸系統(tǒng)疾病之一,尤以老年人多發(fā)[1]。該病指氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥,每年至少3個(gè)月且連續(xù)2年的慢性咳嗽和咳痰[2],屬于中醫(yī)學(xué)咳嗽、痰飲、咳喘等疾病范疇。古人云:“脾為生痰之源,肺為貯痰之器”[3],形象地說明了肺、脾功能失調(diào),影響津液輸布與排泄,以致水濕內(nèi)停,聚濕成痰,出現(xiàn)咳嗽、咳痰癥狀,也是現(xiàn)代疾病慢性支氣管炎的病理基礎(chǔ),臨床常使用理氣健脾、燥濕化痰的中藥治療。

中藥陳皮CitriReticulataePericarpium為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮,藥材分為陳皮和廣陳皮,味苦、辛,歸肺脾經(jīng),有理氣健脾、燥濕化痰的功效,用于脘腹脹滿,食少吐瀉,咳嗽痰多。半夏PinelliaeRhizoma為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖,具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效,用于濕痰寒痰、咳喘痰多等癥。陳皮-半夏兩藥常作為經(jīng)典化痰藥對(duì)配伍入復(fù)方[4],如二陳湯、溫膽湯,共奏理氣健脾、燥濕化痰行氣之功,現(xiàn)代研究表明,兩者可用于治療慢性呼吸系統(tǒng)疾病[5-6],但有關(guān)這一藥對(duì)治療CB的藥理學(xué)作用機(jī)制研究報(bào)道較少。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),篩選陳皮-半夏藥對(duì)的活性成分,預(yù)測活性成分的作用靶點(diǎn)和生物學(xué)信號(hào)通路,探討陳皮-半夏藥對(duì)治療CB的潛在作用機(jī)制。

1 方法

1.1 陳皮-半夏化學(xué)成分和靶點(diǎn)收集

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)及文獻(xiàn)檢索收集陳皮-半夏的化學(xué)成分,設(shè)置口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)為篩選標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合文獻(xiàn)篩選出活性成分。使用TCMSP、BATMAN-TCM、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫獲得目標(biāo)化合物的相關(guān)靶點(diǎn),并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 CB疾病靶點(diǎn)和與成分交集靶點(diǎn)收集

在GeneCards(http://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中,以“chronic bronchitis”為搜索關(guān)鍵詞,獲得CB相關(guān)靶點(diǎn),并歸納出藥對(duì)和疾病的交集靶點(diǎn)。

1.3 “陳皮半夏-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建及分析

將獲得藥對(duì)的活性成分及交集靶基因?qū)隒ytoscape 3.7.2軟件,構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò),直觀地反映活性成分和靶點(diǎn)的關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)活性成分設(shè)置為長方形節(jié)點(diǎn),靶點(diǎn)為橢圓形節(jié)點(diǎn),節(jié)點(diǎn)之間連接次數(shù)越大,節(jié)度值(degree)越大,通過分析節(jié)度值和GeneCards數(shù)據(jù)庫中CB相關(guān)系數(shù),預(yù)測重要活性成分和靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl),物種限定為“Homosapiens”,相互作用閾值選定為0.7最高置信度,去除游離基因,構(gòu)建PPI。邊(edge)的顏色深淺設(shè)置反映關(guān)系程度,導(dǎo)出交集靶蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。通過分析網(wǎng)絡(luò)的節(jié)度值(degree),獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.5 功能富集和基因組百科全書通路富集分析

利用David 2021數(shù)據(jù)庫(htpps://david.ncifcrf.gov/)對(duì)陳皮-半夏和CB交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.6 分子對(duì)接

從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中度值較高化合物的2D結(jié)構(gòu),將其導(dǎo)入Chem3D軟件轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu),通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化使其能量最小化并保存為mol2 格式;通過PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載PPI網(wǎng)絡(luò)獲取到的核心蛋白受體結(jié)構(gòu),并利用 Pymol 軟件去水、去小分子配體,然后導(dǎo)入AutoDockTools軟件進(jìn)行加氫等預(yù)處理后,將活性成分、蛋白受體的格式轉(zhuǎn)為*pdbqt 格式;最后利用Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接,驗(yàn)證其結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 化合物篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫中同時(shí)符合OB≥30%和DL≥0.18的成分,陳皮有7個(gè),半夏有12個(gè)。查閱資料和文獻(xiàn),陳皮中黃酮類和揮發(fā)油為其主要活性成分,且2020年版《中華人民共和國藥典》對(duì)陳皮的黃酮類成分橙皮苷、橘皮素有含量測定要求,揮發(fā)油中檸檬烯、γ-萜品烯含量較高,鄰甲氨基苯甲酸甲酯為廣陳皮的特征性成分[7-9]。故將以上5種成分納入分析,共篩選24個(gè)成分。見表1。

表1 陳皮-半夏化學(xué)成分信息

2.2 陳皮-半夏活性成分與CB的交集靶點(diǎn)

經(jīng)整理,GeneCards數(shù)據(jù)庫中CB涉及1 204個(gè)疾病靶點(diǎn),相關(guān)性分?jǐn)?shù)范圍為0.21～61.04,中位數(shù)為4.83。目標(biāo)活性成分共有331個(gè)靶點(diǎn),其中91個(gè)為活性成分和CB的交集靶點(diǎn)。交集靶點(diǎn)在GeneCards數(shù)據(jù)庫中CB相關(guān)性分?jǐn)?shù)范圍為0.82～45.48,中位數(shù)為7.79,70%交集靶點(diǎn)相關(guān)性>4.83,與疾病關(guān)系密切。TP53等11個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)性分?jǐn)?shù)>15(見表2),為陳皮-半夏治療CB的相關(guān)性較高靶點(diǎn)。

表2 CB疾病高相關(guān)性靶點(diǎn)信息

2.3 “陳皮半夏-活性成分-靶點(diǎn)-CB”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建分析

可視化網(wǎng)絡(luò)(見圖1)中長方形代表陳皮-半夏中的 21種活性成分(去除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分),橢圓形代表91個(gè)共同靶點(diǎn),活性成分平均節(jié)度值為10.24,≥節(jié)度值15的成分(節(jié)度值)有柚皮素(21)、檸檬烯(19)、γ-萜品烯(18)、川陳皮素(17)、黃芩素(17)、β-谷甾醇(16)、橘皮素(15)。靶點(diǎn)平均節(jié)度值為2.36,PTGS2、SCN5A、PTGS1、ADRB2等節(jié)點(diǎn)節(jié)度值較大,4個(gè)及以上成分的交集靶點(diǎn)中,75%靶點(diǎn)相關(guān)性分?jǐn)?shù)高于CB中位數(shù)(見表3)。從網(wǎng)絡(luò)中可看出,陳皮-半夏不同類型組分通過作用于不同靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

圖1 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)

表3 4種及以上活性成分的交集靶點(diǎn)信息

2.4 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖2),網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)之間的連線代表靶點(diǎn)間存在相互作用,網(wǎng)絡(luò)總邊數(shù)為324,平均節(jié)度值為7.12,PPI富集P<1.0e-16。靶點(diǎn)的節(jié)度值越大,表示該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中作用越關(guān)鍵,其中節(jié)度值>20的靶點(diǎn)(節(jié)度值)包括AKT1(26)、MAPK3(25)、TP53(25)、HSP90AA1(24)、JUN(24)、IL1B(21)、MAPK1(21)為核心靶點(diǎn)(見表4)。

圖2 靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)

表4 PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)

2.5 靶基因功能分析

以P≤0.01為截點(diǎn),靶基因涉及229個(gè)生物過程條目,39個(gè)細(xì)胞組成條目,55個(gè)分子功能條目。生物過程涉及缺氧反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、藥物反應(yīng)、尼古丁反應(yīng)、老化、外源刺激的反應(yīng)、蛋白磷酸化正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、心室心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、凋亡過程的正向調(diào)控等;細(xì)胞組成涉及大分子配合物、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞表面、膜筏、質(zhì)膜、小窩、細(xì)胞外泌體、線粒體、肌膜等;分子功能涉及酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、離子通道結(jié)合、支架蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活劑結(jié)合、蛋白結(jié)合、芳香酶活性、Hsp90蛋白結(jié)合等。見圖3。

圖3 GO生物學(xué)富集分析

2.6 靶基因信號(hào)通路分析

KEGG富集分析結(jié)果(見圖4)以P≤0.01為截點(diǎn),共獲得通路117條通路,主要包括癌癥通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、化學(xué)致癌-受體激活、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。

圖4 KEGG通路富集分析

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中度值較高化合物柚皮素、檸檬烯、γ-萜品烯、川陳皮素、黃芩素、β-谷甾醇、橘皮素分別與PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)AKT1(PDB ID:4EJN)、MAPK3(PDB ID:2ZOQ)、TP53(PDB ID:5AOM)、HSP90AA1(PDB ID:3O0I)、JUN(PDB ID:5T01)、IL1B(PDB ID:5R85)、MAPK1(PDB ID:6SLG)進(jìn)行分子對(duì)接。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,一般結(jié)合能分值≤-5.0kCal/mol,表示成分和靶點(diǎn)具有較好結(jié)合作用[10]。結(jié)果主要活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5.0kCal/mol,表明其具有較好的結(jié)合能力(見表5、圖5)。

注:A.AKT1與川陳皮素;B.AKT1與黃芩素;C.AKT1與柚皮素;D.HSP90AA1與黃芩素;E.HSP90AA1與柚皮素;F.JUN與川陳皮素;G.JUN與黃芩素;H.MAPK1與黃芩素;I.MAPK3與黃芩素。

表5 活性化合物與核心靶點(diǎn)結(jié)合能

3 討論

本研究利用TCMSP等數(shù)據(jù)庫,研究了陳皮-半夏的活性成分治療慢性支氣管炎的分子機(jī)制,篩選出陳皮的黃酮、揮發(fā)油,半夏甾醇、黃酮多個(gè)物質(zhì)基礎(chǔ)。在活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中,柚皮素、檸檬烯、γ-萜品烯、川陳皮素、黃芩素、β-谷甾醇作用于較多靶點(diǎn),為主要活性成分;AKT1、MAPK3、TP53、HSP90AA1、JUN、IL1B、MAPK1為PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)。

柚皮素、川陳皮素、黃芩素為黃酮類成分,均具有抗炎的藥理作用。Fouad等[11]表明,柚皮素能明顯減輕LPS誘導(dǎo)急性肺損傷模型大鼠肺組織病理損傷,顯著降低肺組織中TNF-α、caspase-3的表達(dá),顯著升高HSP70的表達(dá)。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn),陳皮黃酮類成分川陳皮素具有良好的抗炎作用,減少促炎因子NO,抑制誘導(dǎo)型的iNOS和COX-2基因的表達(dá)。Duan等[13]研究表明,黃芩素顯著抑制脂多糖LPS刺激的巨噬細(xì)胞系中炎性因子的TNF-α、IL-4和IL-6的表達(dá)。揮發(fā)油類成分檸檬烯、γ-萜品烯也具有抗炎作用。檸檬烯誘導(dǎo)的A2A腺苷受體激活可減少哮喘小鼠模型中的氣道炎癥和反應(yīng)性[14];γ-萜品烯能減少卡拉膠誘導(dǎo)的腹膜炎模型動(dòng)物的中性粒細(xì)胞遷移,以及IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生[15]。此外,檸檬烯、γ-萜品烯具有抗氧化作用[16]。β-谷甾醇為甾醇類化合物,能減少卵蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞,降低肺組織和BAL液中IL-4和IL-5[17]。

PTGS2、PTGS1為陳皮-半夏藥對(duì)較多成分的相同靶點(diǎn),慢性支氣管疾病如哮喘與PTGS1和PTGS2基因的遺傳變異有關(guān)[18]。Wu等[19]研究表明,川陳皮素的主要代謝物4′-Demethylnobiletin(4DN)具有一定的抗炎作用,4DN不僅劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生,顯著降低促炎介質(zhì)PGE2、IL-1β和 IL-6,在蛋白和mRNA水平上抑制iNOS和COX-2的表達(dá),還抑制NF-κB和AP-1的核轉(zhuǎn)位。ADRB2基因編碼β2腎上腺素受體,主要分布于支氣管平滑肌、血管平滑肌和心肌等,介導(dǎo)支氣管平滑肌松弛,血管擴(kuò)張等作用,β2受體激動(dòng)劑治療支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病療效較好[20-21]。SCN5A、KCNH2屬于電壓門控通道,與慢性呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的研究較少,Chatterjee等[22]研究肺內(nèi)皮失去流體剪切應(yīng)力(缺血)時(shí),通過ATP敏感的K+通道關(guān)閉,引起內(nèi)皮質(zhì)膜去極化,啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián),導(dǎo)致NOX2激活和ROS產(chǎn)生。其他多配體靶點(diǎn)還包括激素受體ESR1、AR,神經(jīng)系統(tǒng)的CHRM3、ACHE等。研究表明,肺癌和慢性阻塞性肺病的發(fā)病率在女性中均顯著增加,可能與生殖器官合成的雌激素以及局部肺雌激素合成,參與激活肺中多種細(xì)胞類型表達(dá)的雌激素受體有關(guān),促進(jìn)生長和肺部炎癥表達(dá)[23-24]。

基于String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建陳皮-半夏藥對(duì)治療CB靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),篩選出的核心基因有AKT1、MAPK3、TP53、HSP90AA1、JUN、IL1B、MAPK1等。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是PI3K/AKT信號(hào)通路中核心因子,研究表明,AKT1通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-13來調(diào)節(jié)肺纖維化[25]。MAPK基因編碼絲裂原活化蛋白激酶,是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,能被不同的細(xì)胞外刺激,如細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等激活。研究發(fā)現(xiàn),LPS激活慢性支氣管炎大鼠巨噬細(xì)胞MAPK后,ERK和p38 MAPK抑制劑可顯著抑制其巨噬細(xì)胞中COX-2和TGF-β的表達(dá)[26]。TP53基因是一種抑癌基因,Zhou等[27]研究發(fā)現(xiàn),橙皮素能抑制AKT1、IL6、VEGFA、MMP9上調(diào)TP53蛋白表達(dá),從而降低COPD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展為肺癌。HSP90AA1屬于熱休克蛋白,應(yīng)激狀態(tài)時(shí)幫助細(xì)胞維持正常的生理活動(dòng)。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn),HSP90AA1可能是慢性阻塞性肺疾病潛在的治療靶點(diǎn)。

GO生物學(xué)富集結(jié)果主要集中于細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、脂多糖的反應(yīng)、藥物的反應(yīng)、尼古丁的反應(yīng)、外源刺激的反應(yīng)及老化等。KEGG 通路富集結(jié)果主要集中于AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。AGE-RAGE信號(hào)通路與炎癥和抗氧化應(yīng)激有關(guān),在RAGE的各種配體中,晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)主要與慢性呼吸系統(tǒng)疾病COPD相關(guān)[29]。AGEs作用于GLUTag細(xì)胞,可上調(diào)細(xì)胞RAGE受體表達(dá),激活NADPH 氧化酶,升高 p38MAPK磷酸化水平,促使NF-κB 因子表達(dá),釋放炎癥因子,并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),從而導(dǎo)致細(xì)胞炎癥損傷與凋亡[30]。TNF信號(hào)通路與炎癥有關(guān),半夏能抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6的分泌[31];川陳皮素能通過抑制NF-κB和AKT1激活,來抑制TNF-介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[32]。MAPK信號(hào)通路與炎癥和細(xì)胞凋亡有關(guān),在慢性支氣管炎的進(jìn)程中,p38MAPK通路通過對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞的作用、對(duì)炎癥因子產(chǎn)生的調(diào)控、對(duì)酶的誘導(dǎo),以及促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子活化等機(jī)制來調(diào)節(jié)炎癥過程的發(fā)生發(fā)展[33-35]。PI3K-Akt信號(hào)通路與炎癥有關(guān),實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),PI3K-Akt信號(hào)通路參與支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺炎、肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病[36-38]。

綜上,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討陳皮-半夏藥對(duì)治療CB的潛在活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路。陳皮-半夏藥對(duì)治療CB的作用機(jī)制可能與其中所含的柚皮素、川陳皮素、黃芩素、檸檬烯、γ-萜品烯、β-谷甾醇、橘皮素等多種活性成分,通過調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路發(fā)揮治療慢性支氣管炎的作用相關(guān),為分子機(jī)制研究提供了方向。