林 淼 時文興 金曉芬 劉海燕

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 奉賢 201403）

二氧化鈦俗稱鈦白粉，化學(xué)式為TiO2，是世界上最白的物質(zhì)，l g 二氧化鈦可以把450 cm2的面積涂白[1]。二氧化鈦跟鉛白相似，但又不會像鉛白那樣會變黑；同時二氧化鈦又具有鋅白一樣的持久性，因此，二氧化鈦是一種性能非常穩(wěn)定的惰性顏料。二氧化鈦可以作為一種允許使用的食品色素[2]，添加到果醬、話梅、糖果、膨化食品中；也可以作為油漆中的白色顏料等。到目前為止，雖然還沒有關(guān)于二氧化鈦對人體產(chǎn)生毒性的報道，但是其安全性問題還是引起各領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛關(guān)注[3-5]。

雙孢蘑菇色白味美，為百姓所喜愛，但因其易氧化褐變，影響賣相。筆者團隊在采樣過程中發(fā)現(xiàn)：不法商販和生產(chǎn)者會將雙孢蘑菇投入一種液體中浸泡后出售，浸泡后表面略顯干燥，色白，褐變現(xiàn)象極其緩慢。筆者經(jīng)過多次試驗驗證，發(fā)現(xiàn)浸泡劑為二氧化鈦，而雙孢蘑菇等食用菌自身并不含二氧化鈦。用國標(biāo)方法[6]檢測食用菌中二氧化鈦含量時，由于土壤（含鈦元素）背景吸收的干擾，使得檢測結(jié)果常常偏高，容易引起較大誤差。目前測定二氧化鈦含量的方法主要有ICP-MS[7]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[8]，X 射線熒光光譜法[9]等，因其儀器昂貴，維護及運行費用高，不利于普及。比色法操作簡單，重現(xiàn)性好，對儀器設(shè)備的要求不高，比較適合推廣應(yīng)用[10-11]。因此，筆者在對比研究樣品消化方法的基礎(chǔ)上，采用比色法測定食用菌中二氧化鈦的含量，以期建立一種簡單快速、方便有效、準(zhǔn)確度高的食用菌二氧化鈦檢測方法，以便于相關(guān)部門監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高氯酸、濃硫酸、濃硝酸、濃鹽酸、硫酸銨（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司（抗壞血酸溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配）；二安替比林甲烷（分析純），上海源葉生物科技有限公司；鈦標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 mg∕mL），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；5%二安替比林甲烷溶液：稱取5 g二安替比林甲烷，用鹽酸（鹽酸與水的體積比為1∶23）溶解并定容至100 mL。

1.2 主要儀器和設(shè)備

分析天平（精確到0.1 mg），AL204-IC 型，梅特勒托利多（中國）有限公司；電熱板，JH404 型，上海錦凱科學(xué)儀器有限公司；高溫電阻爐，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；分光光度計（420 nm），8453 型，安捷倫科技有限公司；食品處理機，歐麥斯，市購；樣品粉碎機，DFT系列，上海鼎廣機械設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 消化方式的選擇

目前應(yīng)用于食品中二氧化鈦檢測的消化方式主要有兩種：濕式消化法與干式消化法。干式消化法是近幾年提出的一種消化方法，操作較為簡單，時間短，過程干擾少，但適用的范圍較窄，適應(yīng)于易灰化的面粉等極少數(shù)食品；濕法消化耗時較長，但是應(yīng)用范圍較廣，兩者各有優(yōu)缺點。

1.3.2 食用菌干品消化條件優(yōu)化

以銀耳干品為例（樣品中添加二氧化鈦，添加量為25 mg∕kg，添加方法如下：根據(jù)稱樣量換算標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量，以干品1 g 為例，加入體積質(zhì)量為1 mg∕mL 的鈦標(biāo)準(zhǔn)溶液25 μL，靜置4 h，先小火加熱樣品充分碳化至無煙，將碳化完全的樣品轉(zhuǎn)移至高溫電阻爐中，于（525±25）℃，灼燒灰化3 h，冷卻。試驗優(yōu)化濃硫酸的加入量和微沸時間，樣品灰化后，分別加入2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL 濃硫酸和1 g硫酸銨，蓋上表面皿，加熱至冒硫酸煙，微沸時間保持5 min、10 min、15 min、20 min。

1.3.3 食用菌鮮品消化條件優(yōu)化

以市面購得的2份含有添加二氧化鈦的雙孢蘑菇為例，將樣品置于錐形瓶或高型燒杯中，放數(shù)粒玻璃珠，進行濕式消化。在使用10 mL 硝酸和高氯酸混合酸消化的同時，選擇兩種酸的比例。

1.3.4 顯色過程中各種試劑的選擇

1.3.4.1 鹽酸添加量的選擇

在二氧化鈦檢測的顯色過程中，需要保持在0.5～3.0 mol∕L 的鹽酸酸性溶液中吸光值才能穩(wěn)定，因此考察不同濃度的鹽酸對吸光度的影響。

1.3.4.2 抗壞血酸的選擇

在顯色過程中還需配制抗壞血酸溶液，該溶液可以有效消除鐵等高價離子的干擾。

1.3.4.3 二安替比林甲烷溶液添加量的選擇

試樣經(jīng)酸消解后，在強酸介質(zhì)中鈦與二安替比林甲烷會形成黃色絡(luò)合物，在分光光度計波長420 nm 處可測量。二安替比林甲烷使用鹽酸（鹽酸與水體積比1∶23）溶解，配制成5%的溶液，在比色過程中采取不同的添加量，觀察其對吸光度的影響。選取含較低二氧化鈦和含較高二氧化鈦的食用菌干品、鮮品樣品，然后再分別添加3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL 的二安替比林甲烷溶液顯色劑，以考察其添加量對吸光度的影響。

1.3.4.4 顯色時間的選擇

顯色試劑添加后，優(yōu)化顯色時間，選取含較低二氧化鈦和含較高二氧化鈦的食用菌干品、鮮品樣品。樣品前處理完畢，加入顯色劑定容后，選擇20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 這5 個時間段測定顯色時間對吸光度的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化確定

2.1.1 消化方式的確定

因食用菌鮮樣水分含量較大（約為90%左右），在干式消化的灰化過程中易發(fā)生噴濺或坩堝碎裂等情況；而濕式消化在處理含膠質(zhì)多的樣品如銀耳時同樣會遇到樣品起泡撲出的現(xiàn)象，綜合考慮食用菌樣品的特性和兩種消化方式的適應(yīng)對象以及前處理時間，在樣品前處理過程中食用菌干品采用干式消化法，食用菌鮮品采用濕式消化法。

在消化前的樣品處理過程中需要特別注意，因土壤大多含有鈦元素，且含量較高，為避免樣品測定過程中的外源引入，一定要將食用菌（特別是覆土栽培的食用菌）上粘帶土壤的部分削除干凈后再進行粉碎或勻漿處理。

2.1.2 食用菌干品消化條件的確定

由表1 可知，微沸時間過短，檢測結(jié)果偏低，當(dāng)濃硫酸為5 mL并且微沸時間達10 min時，二氧化鈦的檢測值即趨于穩(wěn)定，并且隨著濃硫酸添加量的增加和微沸時間的增加，對檢測結(jié)果無明顯影響，考慮到檢測效率及試劑使用量，在處理食用菌干品時選擇添加濃硫酸5 mL，保持微沸時間為10 min。

表1 濃硫酸用量和煮沸時間對食用菌干品中二氧化鈦檢測的影響

2.1.3 食用菌鮮品消化條件的確定

由表2 可知，僅用硝酸消化，檢測結(jié)果偏低，高氯酸在消化中的作用是更好地分解有機質(zhì)，當(dāng)高氯酸與硝酸的比例達1∶9 的時候，檢測二氧化鈦質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，而隨著混合酸中高氯酸比例的提高，樣品檢測二氧化鈦質(zhì)量分?jǐn)?shù)無明顯變化，因此在對食用菌鮮品消化的時候選擇高氯酸與硝酸比為1∶9。然后再加1 g 硫酸銨和5 mL 濃硫酸消化的目的：一是去除殘留的高氯酸，二是溶解二氧化鈦。需要注意的是，在消化過程中如果高氯酸有殘留，其會與二安替比林甲烷顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生白色沉淀[12]，因此在試驗過程中，消化混合酸近干時再加入硫酸銨和濃硫酸，這樣可以大大縮短去除高氯酸的時間。

表2 混合酸比例對食用菌鮮品中二氧化鈦檢測的影響

2.1.4 顯色過程中各類試劑添加量的確定

在顯色過程中所添加的鹽酸濃度高于3.0 mol∕L時吸光值會逐漸降低，而低于0.5 mol∕L 時鈦離子產(chǎn)生聚合，因此配制1∶1的鹽酸溶液，在比色過程中吸取15 mL，保持比色液體（定容至50 mL）中鹽酸的濃度約為1.5 mol∕L。

在顯色過程中配制2%的抗壞血酸溶液，可有效消除鐵等高價離子的干擾。

當(dāng)二安替比林溶液添加量低于4 mL時，會造成吸光值偏低，即樣品測定含量偏低；當(dāng)添加量高于等于5 mL 時，吸光值穩(wěn)定，即二氧化鈦含量測定穩(wěn)定，因此在顯色反應(yīng)中選取5%二安替比林甲烷顯色劑的添加量為5 mL。

顯色時間過短，吸光值沒有達到最高，會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。顯色時間達40 min 及以上時，吸光值維持不變，檢測結(jié)果穩(wěn)定。因此在顯色反應(yīng)中選取顯色時間為40 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)市面上所售食用菌（主要為雙孢蘑菇樣品）中添加二氧化鈦的含量范圍，建立鈦標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.1 μg∕mL、0.5 μg∕mL、1.0 μg∕mL、2.0 μg∕mL、4.0 μg∕mL，線性方程（吸光值為X，鈦濃度為Y）為Y=4.6762X+0.0068，R2=0.9999。

2.3 方法的準(zhǔn)確度

選用4 種常見的白色食用菌樣品（雙孢蘑菇鮮樣、金針菇鮮樣、杏鮑菇鮮樣、銀耳干樣）作為基質(zhì)做添加回收試驗（表3），其中雙孢蘑菇本底值為39.25 mg∕kg。結(jié)果可見，二氧化鈦在食用菌樣品中的加標(biāo)回收率均在86.2%～105.5%，證明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表3 食用菌樣品加標(biāo)回收

2.4 重復(fù)性試驗

將雙孢蘑菇鮮樣樣品按標(biāo)準(zhǔn)處理方法處理后檢測，每個樣品重復(fù)5次，以樣品二氧化鈦的含量測定結(jié)果計算日內(nèi)變異系數(shù)，進行3 批處理以計算日間變異系數(shù)（表4）。

表4 雙孢蘑菇樣品中二氧化鈦精密度

由表4 可知，檢測結(jié)果的日內(nèi)變異系數(shù)為3.65%～5.35%，日間變異系數(shù)為3.69%。

2.5 檢出限的確立

分光光度法的檢出限，根據(jù)國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）的規(guī)定：

式中：K′—根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)，IUPAC 建議取3，此時置信水平大約為90%；Sb—空白多次測得信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差（至少20 次）；κ—方法靈敏度，即校準(zhǔn)曲線的斜率。

通過計算，該方法檢出限為4.77 mg∕kg，為便于計算，該方法檢出限為5 mg∕kg。

3 小結(jié)

用該方法測定食用菌中的二氧化鈦的含量，準(zhǔn)確度好，精密度高，方法快速、簡便，有效避免了樣品粘帶土壤引入的假陽性結(jié)果，能為上海市食用菌安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。