武 嫻,魯紹芳,陳 帥,王夢瑤,李夢莉,趙 瑜,張喜文通信作者

1.信陽農(nóng)林學(xué)院 動物科技學(xué)院,河南 信陽 464000 2.信陽農(nóng)林學(xué)院動物科技學(xué)院河南省水禽資源開發(fā)利用與疫病防控工程技術(shù)研究中心,河南 信陽 464000

0 引言

遺傳變異分鴨圓環(huán)病毒病(duck circovirus disease,DuCVD)是由鴨圓環(huán)病毒(duck circovirus,DuCV)感染各種日齡和品種的鴨而引起的傳染病[1],臨床表現(xiàn)為羽毛蓬亂、呼吸困難、貧血、生長遲緩、體重下降、甚至零星死亡。2003年,DuCV被Hattermann et al.[2]在德國首次報道,之后在美國、匈牙利、韓國等多個國家和地區(qū)相繼被發(fā)現(xiàn)。近年來,中國大陸各養(yǎng)鴨業(yè)較為發(fā)達(dá)的省市也報道了該疾病的流行。DuCV通過侵害免疫系統(tǒng)而引起被感染鴨發(fā)生免疫抑制,導(dǎo)致機(jī)體的免疫機(jī)能下降,對其他條件性病原抵抗性下降,使其更易受到其他病原的侵襲[3],最終形成嚴(yán)重混合感染,導(dǎo)致鴨群的疾病更加復(fù)雜,發(fā)病率和死亡率增加[4]。DuCV多以亞臨床感染的形式出現(xiàn),近些年,該病已受到大部分鴨養(yǎng)殖國家的特別關(guān)注。

DuCV基因組為單股環(huán)型DNA,長度為1988～1996 nt[5]。全基因組中存在3個保守的開放閱讀框(open reading frame,ORF),即ORF1編碼復(fù)制蛋白(REP蛋白),ORF2編碼衣殼蛋白(CAP蛋白)及ORF3編碼細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)蛋白[1]。REP蛋白由292個氨基酸組成,氨基酸同源性較高,是病毒復(fù)制所必須的蛋白。CAP蛋白由257個氨基酸組成,是DuCV僅有的結(jié)構(gòu)蛋白,具有良好的免疫原性[6]。根據(jù)Cap基因的堿基數(shù)量不同,DuCV可被分為DuCV-1型和DuCV-2型[7]。DuCV ORF3調(diào)控細(xì)胞凋亡并可引起鴨淋巴細(xì)胞損傷[8]。

目前,DuCVD已成為危害養(yǎng)鴨行業(yè)最重要的傳染病之一,每年給我國養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于各地區(qū)的DuCV流行毒株不同,我國DuCVD疫情變得更加復(fù)雜[3]。DuCV發(fā)現(xiàn)較晚,目前國內(nèi)外對鴨圓環(huán)病毒的研究還處于起步階段。為了解在廣東省佛山地區(qū)鴨群流行DuCV的優(yōu)勢基因型,以及Rep基因和Cap基因的遺傳變異情況,本研究通過對廣東佛山地區(qū)的已確診為DuCV感染陽性病鴨組織擴(kuò)增出Rep基因部分片段和Cap基因,進(jìn)行核苷酸序列測定,對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建、相似性和氨基酸變異分析,為該地區(qū)有效防控DuCV在鴨群中的流行提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣對象

樣品采自廣東佛山地區(qū)的3個鴨養(yǎng)殖場,且為已經(jīng)確診為DuCV感染的病鴨組織(包括肝臟、肺臟、腎臟、脾臟等),送至信陽農(nóng)林學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;DNA Ladder 2000、2×Taq Master Mix購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司,瓊脂糖購自廣州賽國生物科技有限公司?？焖僮詣泳庉婸CR儀(Bio-Rad C1000 Touch型)、電游儀(Bio-Rad PowerPac Basic)購自伯樂實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;紫外透射分析儀(UV-3A)購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2)購自常州朗越儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)張濟(jì)培 等[9]報道合成擴(kuò)增Rep基因部分片段的引物DuCV1-F/DuCV1-R。參照GenBank中登錄的DuCV全基因序列(登錄號:MT084134),利用軟件Premier premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含有Cap基因的片段的引物Cap-F/Cap-R,序列見表1。引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。

表1 DuCV擴(kuò)增引物序列

1.2.2 組織處理及DNA提取

將采集的病鴨組織經(jīng)玻璃勻漿器制成勻漿,用滅過菌的PBS按1：5稀釋。反復(fù)凍融3次,4 ℃、12 000 r/min離心5 min,取上清液置于滅菌離心管中備用。使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?分別命名為GDFS-1、GDFS-2、GDFS-3。

1.2.3 DuCV的Rep和Cap基因克隆

以提取出的DNA為模板,分別進(jìn)行Rep基因部分片段和包含有Cap基因片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×Taq Master Mix 12.5 μL,引物DuCV1-F(Cap-F)1 μL,引物DuCV1-R(Cap-R)1 μL,DNA 1.5 μL,ddH2O 9.0 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性35 s,52 ℃退火35 s,72 ℃延伸45 s,共30個循環(huán);72 ℃再延伸7 min。取 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。使用膠回收試劑盒對擴(kuò)增出的目的基因進(jìn)行純化,膠回收產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

1.2.4 DuCV的Rep和Cap基因序列分析

利用生物學(xué)軟件DNAMAN和MEGA11.0將3株DuCV流行株Rep基因部分片段和Cap基因推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中登錄的30株DuCV參考毒株中的Rep和Cap基因氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和氨基酸變異分析,并構(gòu)建進(jìn)化樹。參考毒株序列信息見表2。

表2 DuCV參考毒株

2 結(jié)果

2.1 DuCV Cap基因和Rep基因部分片段擴(kuò)增

由圖1所示,以病鴨組織DNA為模板,DuCV1-F和DuCV1-R為引物,擴(kuò)增出約990 bp的PCR產(chǎn)物;Cap-F和Cap-R為引物,擴(kuò)增出約774 bp的PCR產(chǎn)物,上述結(jié)果均與預(yù)期相符。經(jīng)核苷酸序列測定,證實(shí)成功擴(kuò)增出DuCVCap基因和Rep基因部分片段。

M—DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2000;1～3—GDFS-1、GDFS-2、GDFS-3 Cap基因擴(kuò)增產(chǎn)物;4～6—GDFS-1、GDFS-2、GDFS-3 Rep基因部分片段擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 DuCV流行株Cap基因遺傳特性分析

采用MEGA 11.0軟件對獲得的3株DuCV流行株與參考毒株Cap基因推導(dǎo)氨基酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果如圖2所示,3株DuCV流行株與30株參考氨基酸序列存在2個明顯的分支,分別以德國株為代表的Group I和以中國臺灣株為代表的Group II。3株DuCV流行株與中國臺灣株(AY3947213)在同一分支,位于Group II。3株DuCV流行株之間相似性為98.8%～100%;與Group II的15株氨基酸序列相似性為96.9%～100%,其中與福建株(EU499310,GQ423741)、廣東株(KF941310,MK814575)、四川株(JX499186)的關(guān)系最近,相似性為98.8%～100%;與同屬于基因2型的4株廣東株參考序列相似性為97.7%～100%。3株DuCV流行株與Group I的16株參考序列的相似性為85.6%～88.7%,其中與江蘇株(GU014543)、廣西株(KC460530)關(guān)系較遠(yuǎn),相似性為85.6%～86%。Cap基因氨基酸變異分析結(jié)果如表3所示,將3株DuCV流行株Cap基因推導(dǎo)氨基酸序列與中國臺灣株(AY3947213)相比較,3株DuCV流行株發(fā)生了4處相同氨基酸置換(F23L、G106N、E193Q、K196T)。DuCV流行株GDFS-1和GDFS-2均在195位發(fā)生氨基酸置換(T195S),DuCV流行株GDFS-3的18位和240位氨基酸發(fā)生置換(G18A、D240N)。

●—本研究測定的毒株;▲—關(guān)鍵的參考毒株

表3 DuCV Rep部分基因和Cap基因推導(dǎo)氨基酸與中國臺灣株(AY3947213)比較發(fā)生氨基酸置換

2.3 DuCV流行株Rep基因部分序列遺傳特性分析

利用MEGA11.0軟件對獲得的3株DuCV與參考毒株的Rep基因部分片段推導(dǎo)氨基酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果如圖3所示。3株DuCV流行株與30株參考氨基酸序列存在2個明顯的分支,分別以德國株為代表的Group I和以中國臺灣株為代表的基因Group II。3株DuCV流行株之間相似性為99.5%～100%,位于Group II,與中國臺灣株(AY3947213)相似性為99.5%～99%;與Group II的14株參考序列相似性為97.2%～100%,其中與廣東株(FJ554673)、四川株(JX499186)、云南株(MK814584)的關(guān)系最近,相似性為99.5%～100%;與同屬于基因2型的4株廣東株參考序列相似性為97.2%～100%。3株DuCV流行株與Group I的16株參考序列的相似性為94.2%～95.7%,其中與河南株(MN928801)的關(guān)系最遠(yuǎn),相似性為94.2%～94.7%。Rep基因氨基酸變異分析結(jié)果如表3所示,與中國臺灣株(AY3947213)相比較,3株DuCV流行株均在第36位發(fā)生相同氨基酸置換(S36A);流行株GDFS-3的213位氨基酸發(fā)生氨基酸置換(Y213F)。

●—本研究測定的毒株,▲—關(guān)鍵的參考毒株

3 討論

DuCVD比較常見,各種鴨、鵝均可感染,但主要感染鴨[10]。山東、江蘇、福建等省均有DuCV感染,感染率為30%～84%,并有日益嚴(yán)重的趨勢,其危害逐漸增大,因此,引起了人們的重視[10-14]。DuCV主要引起宿主的免疫抑制,與其他圓環(huán)病毒屬成員一樣,DuCV常常呈潛伏感染,并入侵鴨的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致機(jī)體的免疫機(jī)能下降,對其他條件性病原抵抗性下降,使其更易受到其他病原的侵襲[3]。本研究對來自廣東佛山的3株DuCV的Rep基因部分片段和Cap基因進(jìn)行擴(kuò)增和氨基酸遺傳變異分析,對該地區(qū)DuCVD防控具有重要意義。

根據(jù)DuCVRep和Cap基因的遺傳進(jìn)化分析顯示,DuCV的進(jìn)化特點(diǎn)表現(xiàn)為基因型有明顯的地域性,美國和德國都是DuCV-1型,我國臺灣為DuCV-2型[15]。據(jù)多數(shù)分析DuCV全基因序列研究顯示中國大陸流行的DuCV呈現(xiàn)不同的亞型[16-17],而本研究以Rep和Cap基因的遺傳進(jìn)化樹顯示DuCV亞型分類并不明顯,尤其是DuCV-2型,可能是測得的流行株與參考毒株的遺傳關(guān)系較近從而聚集成簇。3株流行株均屬于DuCV-2型,與張濟(jì)培報道的一致[9]。這表明在廣東DuCV-2型為優(yōu)勢流行株。

ORF V1編碼DuCV的REP蛋白,REP蛋白與DuCV復(fù)制有關(guān),含有能夠滾環(huán)復(fù)制的保守序列(TPHLQG、YCSKE)和復(fù)制過程中與酶促反應(yīng)dNTP結(jié)合的保守序列(FTINN、GPPGTGKS、DDFYGW)[18-20]。根據(jù)Rep基因部分片段推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)化樹分析結(jié)果證實(shí),3個DuCV流行株屬于Group Ⅱ,相似性分析結(jié)果表明,3株DuCV流行株相似性均在99.5%以上,與已報道4株廣東株相似性在97%以上。與AY3947213氨基酸序列相比較,第36位發(fā)生相同氨基酸置換(S36A);流行株GDFS-3的213位氨基酸發(fā)生氨基酸置換(Y213F),上述結(jié)果表明DuCVRep基因的氨基酸同源性較高。3株DuCV流行株與中國臺灣株其他位點(diǎn)均一致。DuCVRep基因的氨基酸具有良好的保守性。

ORF C1基因編碼DuCV的衣殼蛋白CAP,CAP蛋白是DuCV的主要免疫保護(hù)性抗原。根據(jù)Cap基因組長度不同可將病毒分為DuCV-1型和DuCV-2型[7]。CAP蛋白氨基酸的進(jìn)化樹結(jié)果證實(shí),3株DuCV流行株與中國臺灣株(AY3947213)在同一分支,位于Group Ⅱ,與Group Ⅱ的相似性為96.9%～100%;與Group Ⅰ參考序列遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),相似性為85.6%～88.7%。與Rep基因結(jié)果相比,Cap基因的同源性較低,與張志龍[3]報道結(jié)果相一致。與中國臺灣株(AY3947213)氨基酸序列相比較,3株DuCV流行株有4處相同氨基酸置換;GDFS-1和GDFS-2均在1處發(fā)生氨基酸置換;GDFS-3有2處氨基酸發(fā)生突變。通過Cap基因和Rep基因氨基酸序列比較,可以發(fā)現(xiàn)CAP蛋白的變異位點(diǎn)要多于REP蛋白,這可能與它們編碼的蛋白質(zhì)的功能有關(guān)。

4 結(jié)論

研究測得的3株DuCV流行株均屬于DuCV-2型,在廣東地區(qū)有一定范圍的流行,且CAP蛋白的變異程度要高于REP蛋白,為該地區(qū)有效防控DuCV在鴨群中的感染提供理論依據(jù)。