譚小雨,楊 洋,郭紫晶,李彥敏,張志東通信作者

1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730046

0 引言

羊口瘡(orf),又被稱為羊傳染性膿皰,是由嗜上皮細(xì)胞的羊口瘡病毒(orf virus,ORFV)引起的接觸性傳染病[1]。該病呈現(xiàn)出全球性分布,對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)影響。ORFV是一種雙鏈DNA病毒,其基因組大小約為140 kb,屬于痘病毒科(Poxviridae)脊椎動(dòng)物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)副痘病毒屬(Parapoxvirus),編碼蛋白種類多且病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜[2-4]。羊痘(capripox,CaP)是由羊痘病毒(Capripoxvirus,CaPV)感染引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病[5-9],是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病,是所有動(dòng)物痘病中最為嚴(yán)重的。CaPV屬于痘病毒科(Poxviridae)脊索動(dòng)物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)成員。這些病毒主要感染綿羊和山羊,在羊群中廣泛存在或流行,給羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。盡管根據(jù)被感染動(dòng)物表現(xiàn)出的臨床癥狀和流行病學(xué)調(diào)查,可以作出初步診斷,但是往往很難進(jìn)行確診。

近年來(lái),除傳統(tǒng)的病毒分離與鑒定方法,快速、特異性的PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)等分子檢測(cè)技術(shù)在orf和CaP等病毒病診斷中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[10-16]。研究表明,除檢測(cè)試劑盒特異性、敏感性和重復(fù)性等因素外,核酸提取對(duì)病毒分子檢測(cè)的準(zhǔn)確性和快速性有較大影響[10]。然而,常用的核酸提取方法操作過(guò)程復(fù)雜,費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此,本研究采用2種商品化的核酸快速提取試劑:Cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠核酸提取方法(InnuPREP MP Basic Kit A)。提取臨床樣本(鼻棉拭子、口腔棉拭子、肺臟、脾臟、腎臟)中的ORFV和CaPV核酸,利用qPCR和側(cè)流式免疫層析RPA(RPA-LFD)分析比較核酸提取效果,為合理選擇病毒快速核酸提取方法提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒(寶生物)、Cell-to-cDNA裂解液、InnuPREP MP Basic Kit A、TwistAmp nfo 試劑盒(Cambridge,United Kingdom)、SYBR Green Master Mix(Life,Applied Biosystems)和Hybridetect 2 T(Milenia Biotec GmbH,Germany)。

1.2 儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(安捷倫,Stratagene Mx3005P)、電泳儀(Bio-Rad,1645050)、離心機(jī)(Thermo,Legend Micro 21R)、組織破碎儀(MP,FastPrep?-24)、恒溫水浴鍋(其林貝爾,GL-150)、渦旋儀(桑澤,Vortex-Genie 2)及高壓滅菌器(Zealway,GI54TR)。

1.3 樣品

本研究涉及的樣品均經(jīng)過(guò)相應(yīng)病毒qPCR的檢測(cè),有關(guān)樣品詳細(xì)描述和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)Yang et al.公開(kāi)發(fā)表的論文[11-12,14]。Orf疑似樣品和CaP疑似樣品均采集自甘肅省,采集的拭子放置在1 mL磷酸鹽緩沖鹽水,于-80 ℃保存?zhèn)溆?。Orf疑似臨床樣品共98份,其中52份組織樣品、26份鼻拭子和20份口腔拭子。CaP疑似臨床樣品共113份,包括61份組織樣品、26份鼻拭子和26份口腔拭子。

1.4 核酸提取

病毒核酸提取分別按Cell-to-cDNA裂解液(A法)、基于磁珠核酸提取方法的InnuPREP MP Basic Kit A(B法)和寶生物病毒DNA/RNA提取試劑盒(C法)操作說(shuō)明進(jìn)行,然后用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)核酸的濃度,于-80 ℃保存?zhèn)溆?每份樣品平行進(jìn)行2次核酸提取。

A法用于鼻拭子和口腔拭子樣品中病毒核酸提取,取200 μL鼻拭子或口腔拭子浸泡液加入EP管中,隨后加入400 μL的Cell-to-cDNA裂解液混合均勻,75 ℃,10 min;將EP管放在冰上冷卻并加入1 μL DNase I混合均勻,75 ℃,10 min;隨后取5 μL裂解產(chǎn)物直接用于核酸擴(kuò)增。

B法分別用于組織、鼻拭子和口腔拭子樣品DNA或RNA的提取。對(duì)于鼻拭子和口腔拭子,取200 μL拭子浸泡液與300 μL Solution RL/Carrier Mix和20 μL的蛋白酶混合均勻;在用于組織樣品時(shí),取1～5 mg組織樣品與500 μL Solution RL/Carrier Mix和20 μL的蛋白酶K,震蕩混勻10 s;隨后按InnuPREP MP Basic Kit A提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取樣品中病毒核酸,核酸洗脫液體積為50 μL。

C法用于組織、鼻拭子和口腔拭子樣品中DNA或RNA的提取。組織樣品首先用組織破碎儀打碎(組織質(zhì)量：PBS體積=1：10),隨后按操作說(shuō)明進(jìn)行核酸提取,核酸洗脫液體積為50 μL。

1.5 病毒核酸檢測(cè)

本研究采用公開(kāi)發(fā)表的相關(guān)病毒qPCR和RPA-LFD核酸檢測(cè)方法[11-12,14],檢測(cè)組織、鼻拭子和口腔拭子樣品中相應(yīng)病毒核酸。每份樣品重復(fù)檢測(cè)3次。qPCR使用SYBR? Select Master Mix試劑盒并按操作說(shuō)明進(jìn)行,反應(yīng)體系為25 μL,包括SYBR? Select Master Mix(2×),上下游引物(10 μmol/L),熱循環(huán)參數(shù)為50 ℃,5 min;95 ℃,10 min,40個(gè)循環(huán);95 ℃,15 s和60 ℃,1 min;在Stratagene Mx3005P上進(jìn)行,分析溶解曲線以驗(yàn)證特異性擴(kuò)增和Mx3005P系統(tǒng)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。RPA-LFD使用TwistAmp nfo試劑盒并按操作說(shuō)明進(jìn)行,其反應(yīng)體系為25 μL,包括水解緩沖液、引物和探針(10 μmol/L),恒溫?cái)U(kuò)增溫度參數(shù)為37 ℃,20 min;擴(kuò)增完成后使用Hybridetect 2T試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,含有標(biāo)記物的特異核酸擴(kuò)增產(chǎn)物可以在含有多抗連接金顆粒的試紙條上顯色,整個(gè)顯色過(guò)程在室溫下完成。本研究所用的qPCR引物和探針、RPA-LFD生物素標(biāo)記引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其中RPA引物和探針的具體信息如表1所示。

表1 本研究使用的RPA引物和探針

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,用PRISM 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 2種快速核酸提取方法提取ORFV DNA效能分析

分別使用A法、B法和C法對(duì)98份ORFV疑似臨床樣品進(jìn)行核酸提取。采用qPCR和RPA-LFD法評(píng)價(jià)病毒核酸提取效果,以C法的結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn),分析A法、B法的核酸提取效能,qPCR對(duì)提取的核酸樣品檢測(cè)結(jié)果如表2所示。在C法提取的98份orf疑似樣品核酸中,32份組織樣品、13份鼻拭子和11份口腔拭子為ORFV核酸陽(yáng)性,與本實(shí)驗(yàn)室之前檢測(cè)的結(jié)果一致。在A法提取的46份鼻拭子和口腔拭子核酸樣品中,9份鼻拭子和8份口腔拭子為ORFV核酸陽(yáng)性,與C法相比,拭子核酸陽(yáng)性符合分別為70.8%;對(duì)組織樣品分析發(fā)現(xiàn),A法無(wú)法用于組織樣品中的核酸提取。在B法提取的52份組織樣品和46份鼻拭子和口腔拭子核酸樣品中,30份組織樣品和21份拭子樣品為核酸陽(yáng)性,與C法相比,陽(yáng)性符合率為93.7%和87.5%;基于全部檢測(cè)的98份樣品,B法提取的核酸樣品陽(yáng)性符合率為91.1%。

表2 利用qPCR比較Cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠的核酸提取試劑盒提取ORFV核酸的性能 單位:份

利用RPA-LFD對(duì)A法、B法和C法提取的核酸樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表3。在C法提取的98份核酸樣品中,53份ORFV陽(yáng)性和45份陰性。在A法和B法提取的46份拭子核酸樣品中,分別檢出16份和19份拭子ORFV核酸陽(yáng)性;與C法相比,陽(yáng)性符合率分別為69.5%和82.6%;在B法提取的52份臨床組織樣品核酸中,檢出28份ORFV核酸陽(yáng)性,與C法相比,陽(yáng)性符合率為93.3%;基于全部的98份臨床樣品,B法提取的ORFV核酸陽(yáng)性符合率為89%。上述結(jié)果表明,在A法和B法2種快速核酸提取方法中,B法快速提取ORFV核酸的效率更高?；诖胖榈暮怂崽崛》椒ㄌ崛〉谋鞘米雍涂谇皇米右约皠?dòng)物組織樣品核酸能夠很好地應(yīng)用于ORFV qPCR和RPA-LFD檢測(cè)方法中。

表3 利用RPA-LFD比較Cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠的核酸提取試劑盒提取ORFV核酸的性能 單位:份

2.2 2種快速核酸提取方法提取CaPV DNA效能分析

分別使用A法、B法和C法對(duì)113份CaP疑似臨床樣品進(jìn)行核酸提取,采用qPCR和RPA-LFD法評(píng)價(jià)核酸提取效果,以C法的結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn),分析A法、B法的提取效能,qPCR檢測(cè)結(jié)果如表4所示。在C法提取的113份核酸樣品中,37份組織樣品、16份鼻拭子和14份口腔拭子為CaPV陽(yáng)性,與本實(shí)驗(yàn)室之前檢測(cè)的結(jié)果一致。在A法和B法提取的52份拭子核酸中,qPCR分別檢出23份和27份CaPV核酸陽(yáng)性,與C法相比,陽(yáng)性符合率分別為77%和90%。B法提取的61份組織樣品核酸中,35份為CaPV核酸陽(yáng)性,與C法相比,其陽(yáng)性符合率為94.5%。基于B法提取的全部113份樣品,與C法相比,核酸陽(yáng)性符合率為92.5%。

表4 利用qPCR比較Cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠的核酸提取試劑盒提取CaPV核酸的性能 單位:份

利用RPA-LFD,對(duì)A法、B法和C法提取核酸樣品進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果如表5所示。在C法提取的113份核酸樣品中,65份為CaPV陽(yáng)性。隨后對(duì)A法、B法提取的52份拭子核酸進(jìn)行測(cè)定,RPA-LFD分別檢出19份和26份CaPV核酸陽(yáng)性,與C法相比,陽(yáng)性符合率分別為66%和90%。在B法提取的61份組織樣品核酸中,檢出32份CaPV核酸陽(yáng)性,與C法相比,陽(yáng)性符合率為88.9%;基于全部B法提取的113份核酸樣品,陽(yáng)性符合率為89%。上述結(jié)果表明,在A法和B法兩種快速核酸提取方法中,B法快速提取CaPV核酸的效率更高,可用于qPCR和RPA-LFD檢測(cè)方法,快速檢測(cè)CaPV。

表5 利用RPA-LFD比較Cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠的核酸提取試劑盒提取CaPV核酸的性能 單位:份

3 討論

ORFV和CaPV病毒嚴(yán)重影響著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展,快速、特異性的診斷對(duì)疫病防控至關(guān)重要。近年來(lái),快速、特異性的qPCR、RPA等分子檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物病毒性疫病的診斷中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。而病毒病快速分子生物學(xué)檢測(cè),首先要面臨的最大的挑戰(zhàn)就是病毒核酸快速提取。傳統(tǒng)的沉淀法和實(shí)驗(yàn)室常用的離心柱吸附法,雖然可以提取病毒核酸,但是操作過(guò)程復(fù)雜,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且有機(jī)溶劑可能對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成傷害,制約了病毒分子檢測(cè)方法的快速診斷。同時(shí),在開(kāi)展病毒分子檢測(cè)方法過(guò)程中往往重點(diǎn)關(guān)注方法的敏感性、特異性,而忽略了核酸提取對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響。為了評(píng)價(jià)不同類型的快速核酸提取試劑盒對(duì)病毒核酸的提取效率,本研究選取了2種快速核酸提取方法(Cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠的核酸提取方法),分別對(duì)羊鼻拭子、口腔拭子及組織樣品核酸提取進(jìn)行了提取效率比較。Cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠的核酸提取方法InnuPREP MP Basic Kit A均擺脫了核酸提取過(guò)程中離心機(jī)的束縛,可以進(jìn)行核酸快速提取。InnuPREP MP Basic Kit A是通過(guò)蛋白變性劑使得樣本中的蛋白質(zhì)達(dá)到溶解狀態(tài),使得核酸被解離出來(lái),并在磁場(chǎng)和重力的作用下,將雜質(zhì)去除掉,最后獲取較為純凈的核酸樣本。在本實(shí)驗(yàn)中,在提取組織樣品中病毒核酸時(shí),A法對(duì)組織樣品中的核酸無(wú)法進(jìn)行有效提取,但對(duì)鼻拭子和口腔拭子可進(jìn)行有效提取。而B(niǎo)法對(duì)羊鼻拭子、口腔拭子及組織樣品中的ORFV和CaPV核酸進(jìn)行有效提取,與C法相比,一致性良好。

4 結(jié)論

與Cell-to-cDNA裂解液相比,磁珠核酸提取方法的提取效率更高,并且能提取組織樣品的核酸,具有更廣泛的運(yùn)用和推廣價(jià)值,并且與RPA-LFD方法聯(lián)用,可實(shí)現(xiàn)病毒病的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷,為動(dòng)物病毒病的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早防控提供新的技術(shù)支撐。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,將優(yōu)化樣品制備過(guò)程,檢測(cè)更多的臨床樣品,進(jìn)一步評(píng)價(jià)InnuPREP MP Basic Kit A核酸提取效率。