趙金紅,孫曉燕,蔣 婧通信作者

1.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 402460 2.重慶市草業(yè)工程技術(shù)研究中心,重慶 402460 3.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心,重慶 402460

0 引言

動(dòng)物的毛色和膚色變異主要受黑色素細(xì)胞的增殖、分化、遷移,以及黑色素的合成與運(yùn)輸?shù)壬镞^程調(diào)控[1]。黑色素的合成是一個(gè)由酶催化的復(fù)雜過程[2],由多個(gè)基因位點(diǎn)編碼產(chǎn)物共同調(diào)控。黑色素細(xì)胞的增殖分化亦受多種相關(guān)基因表達(dá)和酶活性的影響,它們形成了1個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3]。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)是神經(jīng)嵴細(xì)胞定向分化發(fā)育成黑色素細(xì)胞過程中出現(xiàn)的最早標(biāo)記基因之一,對(duì)黑色素細(xì)胞的存活、遷移、增殖和分化起著重要的作用[4]。此外,MITF處于黑色素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心位置,一方面同時(shí)受上游cAMP、Wnt、Kit信號(hào)通路的調(diào)控,另一方面調(diào)控下游酪氨酸基因家族(TYR、TYRP1、DCT)基因的表達(dá),進(jìn)而影響黑色素的生成[5]。本研究分析MITF基因在黑色素細(xì)胞(B16-F10)增殖和分化過程中的表達(dá)規(guī)律,探尋其是否參與了黑色素細(xì)胞行為學(xué)的調(diào)控,為MITF基因在皮膚色素沉積方面的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實(shí)驗(yàn)使用的主要試劑與材料如表1所示。

表1 主要試劑與材料

1.2 B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)的步驟如下:在37 ℃ 水浴中復(fù)蘇B16-F10細(xì)胞,離心3 min去除細(xì)胞凍存液,用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,放入10 cm培養(yǎng)皿中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5% CO2,37 ℃ 條件);觀察細(xì)胞,待融合度達(dá)到90 %左右時(shí)除去培養(yǎng)液,加入0.25 %胰蛋白酶進(jìn)行消化,1 000 r/min離心10 min;棄上清液,用完全培養(yǎng)基RPMI 1640重懸后,按照1.0×105個(gè)/mL的密度接種于10個(gè)6孔板中,每板重復(fù)3次。其中5個(gè)六孔板置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2,37 ℃ 條件),每2 d更換1次培養(yǎng)基,在接種后的6 h、24 h、72 h、120 h、168 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照記錄,并在對(duì)應(yīng)的各個(gè)時(shí)間收集細(xì)胞,用于提取總RNA備用;另外5個(gè)六孔培養(yǎng)板,當(dāng)其融合度達(dá)到80%左右時(shí)除去培養(yǎng)基,用含2% 馬血清的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化,每2 d更換1次培養(yǎng)基,分別在分化的6 h、24 h、72 h、120 h、168 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),分別收集對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞,用于提取總RNA。

1.3 熒光定量PCR與結(jié)果分析

用TRIzol Reagent提取B16-F10細(xì)胞的總RNA,用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和質(zhì)量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。所用引物信息見表2,以β-actin為內(nèi)參基因,采用ABI stepone實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,按照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒說明書中的體系與條件進(jìn)行操作。結(jié)果使用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

表2 引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 MITF基因在B16-F10增殖階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)

為了探究MITF基因是否參與了對(duì)黑色素細(xì)胞行為的調(diào)控,本研究檢測(cè)了它們?cè)贐16-F10增殖期過程中(1 d、3 d、5 d、7 d)的表達(dá)量。如圖1所示,B16-F10細(xì)胞增殖培養(yǎng)1 d和3 d時(shí),細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量不斷增加,結(jié)構(gòu)越來越模糊,到7 d時(shí),細(xì)胞已完全鋪滿整個(gè)六孔板,無法辨清單個(gè)細(xì)胞。

圖1 B16-F10細(xì)胞不同時(shí)間的增殖培養(yǎng)結(jié)果(標(biāo)尺=200 μm)

表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),MITF基因相對(duì)表達(dá)量在B16-F10細(xì)胞增殖階段前期快速增加,隨后進(jìn)入一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài),在3 d、5 d、7 d的表達(dá)量極顯著高于1 d(P<0.01),在7 d的相對(duì)表達(dá)量顯著低于3 d和5 d(P<0.05),如圖2所示。

圖2 B16-F10細(xì)胞增殖階段MITF基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 MITF基因在B16-F10分化階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)

進(jìn)一步分析MITF等基因在B16-F10分化過程中(1 d、3 d、5 d、7 d)的表達(dá)規(guī)律,B16-F10細(xì)胞隨著分化培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量越來越少,細(xì)胞突觸增多、變長(zhǎng)、相互交聯(lián),細(xì)胞核周圍出現(xiàn)越來越多黑素體,黑色素分泌增多(見圖3)。mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示,MITF基因相對(duì)表達(dá)量先下降后上升,在5 d的相對(duì)表達(dá)量最低,極顯著低于1 d和3 d(P<0.01),顯著低于7 d(P<0.05),如圖4所示。

圖3 B16-F10細(xì)胞不同時(shí)間分化培養(yǎng)結(jié)果(標(biāo)尺=200 μm)

圖4 B16-F10細(xì)胞分化階段MITF基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論與分析

動(dòng)物皮膚中黑色素沉積情況影響著動(dòng)物的毛色和膚色,黑色素的生物合成受多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控,并且不同的通路之間可發(fā)生交叉作用,體現(xiàn)了黑色素生成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性[3],MITF基因是該網(wǎng)絡(luò)的樞紐因子,在上游同時(shí)受cAMP、Wnt、Kit 3條信號(hào)通路和TNF-α、PAX3、SOX10、BRN-2等基因的調(diào)控,在下游則通過調(diào)控起關(guān)鍵限速作用的酪氨酸酶,來影響黑色素的生物合成[5]。干擾B16-F10細(xì)胞中MITF基因表達(dá)[6-7]或轉(zhuǎn)染MITF優(yōu)勢(shì)負(fù)性突變[8]能夠抑制色素合成有關(guān)基因TYR、TYRP1的表達(dá)量和活性,在綿羊黑素細(xì)胞中過表達(dá)MITF基因能增加TYR、TYRP1和DCT的表達(dá)量[9]。

大量研究表明[4,10-11],MITF基因能直接調(diào)控黑色素細(xì)胞生存、增殖周期、分化過程相關(guān)的基因,從而參與這些生物過程。在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中下調(diào)MITF的表達(dá)水平可以抑制瘤細(xì)胞的增殖,促使細(xì)胞發(fā)生凋亡,說明MITF在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn),MITF基因在B16-F10細(xì)胞增殖前期的mRNA相對(duì)表達(dá)量快速上升,隨后進(jìn)入一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài),最后略有降低,這一結(jié)果與項(xiàng)目組前期研究DCT基因在B16-F10細(xì)胞增殖過程中的表達(dá)趨勢(shì)一致[13]。該基因在小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞快速增殖時(shí)期高表達(dá),而當(dāng)細(xì)胞增殖速度慢下來后,它的相對(duì)表達(dá)量也趨于穩(wěn)定,表明MITF基因高表達(dá)與黑色素瘤細(xì)胞的快速增殖有一定的正向關(guān)系。在黑色素瘤細(xì)胞分化過程中干擾MITF基因表達(dá)能抑制黑色素的合成與分泌,說明MITF基因?qū)谏亓黾?xì)胞的分化功能造成直接的影響[6]。本研究發(fā)現(xiàn)MITF基因相對(duì)表達(dá)量在B16-F10細(xì)胞分化前期呈下降趨勢(shì),可能跟B16-F10細(xì)胞分化前期,細(xì)胞數(shù)量急劇下降有關(guān),但在后期又顯著上升,可能是由于分化后期,細(xì)胞內(nèi)、外黑色素大量分泌導(dǎo)致的。這一結(jié)果再次說明,MITF基因高表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞的增殖和分化均有促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

MITF基因的高表達(dá)對(duì)黑色素合成的限速酶活性有促進(jìn)作用,同時(shí)促進(jìn)黑色素的合成與分泌,從而促進(jìn)動(dòng)物皮膚黑色素的沉積,進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物的毛色和膚色表型。MITF基因?qū)谏亓黾?xì)胞的增殖和分化均有一定的促進(jìn)作用。這些結(jié)果為MITF基因在皮膚色素沉積分子機(jī)制研究方面提供了理論依據(jù)。