摘要 目的：基于HL-1細胞自噬水平及相關(guān)通路關(guān)鍵蛋白表達探討速效救心丸經(jīng)Alk B同源蛋白5（ALKBH5）信號轉(zhuǎn)導調(diào)控糖原合成酶激酶3β（GSK3β）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路抑制過度自噬而發(fā)揮對心肌細胞缺氧/復氧（H/R）損傷保護作用的機制。方法：構(gòu)建慢病毒干擾載體，篩選最佳干擾慢病毒。將HL-1細胞隨機分為3組，并進行空白轉(zhuǎn)染、ALKBH5轉(zhuǎn)染、GSK3轉(zhuǎn)染，各組再隨機分為4組分別進行缺氧/復氧（模型組）、缺氧/復氧＋速效（速效組）、缺氧/復氧＋川芎嗪（川芎嗪組）、缺氧/復氧＋冰片（冰片組）處理。通過自噬雙標腺病毒（mRFP-eGFP-LC3）雙熒光染色檢測自噬流，細胞計數(shù)法（CCK8）檢測細胞增殖，雙染色雙變量流式細胞分析法（Annexin V/PI）檢測細胞凋亡，透射電鏡觀察自噬小體的數(shù)量和形態(tài)，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測GSK3β、mTOR含量及自噬相關(guān)基因（Atg）5、芐氯素1（Beclin1）、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/Ⅰ）、自噬標志物p62蛋白表達。結(jié)果：ALKBH5過表達可抑制GSK3β表達，增強mTOR表達（P＜0.05）。CCK8法檢測mRFP-eGFP-LC3的雙熒光染色檢測自噬流結(jié)果顯示，與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可促進自噬，GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制自噬（P＜0.05）。CCK8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示，與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可促進細胞增殖；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5組可抑制細胞增殖，GSK3β可促進細胞增殖（P＜0.05）。Annexin V/PI雙染色法檢測心肌細胞凋亡顯示，與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可抑制細胞凋亡；與空白組比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染及GSK3β轉(zhuǎn)染均可增加細胞凋亡（P＜0.05）。Western Blot檢測LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達顯示，與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，增強mTOR表達（P＜0.05）。與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可增強LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，抑制mTOR表達；GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，增強mTOR表達（P＜0.05）。結(jié)論：速效救心丸及其有效成分冰片、川芎嗪經(jīng)ALKBH5/GSK3β/mTOR信號通路抑制過度自噬，減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷。

關(guān)鍵詞 心肌細胞；缺氧/復氧損傷；速效救心丸；Alk B同源蛋白5，ALKBH5；糖原合成酶激酶3β，GSK3β；雷帕霉素靶蛋白，mTOR；自噬；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.24.007

Mechanism of Suxiao Jiuxin Pills on Hypoxia/Reoxygenation Injury in Cardiomyocytes Based on ALKBH5 Regulation of GSK3β/mTOR Pathway to Inhibit Excessive Autophagy

LI Cha， LI Yiping， WANG Keyan， WANG Dan， WANG Xiaolong

Shuguang Hospital Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Baoshan Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Shanghai 201203， China

Corresponding Author WANG Xiaolong， E-mail： wxlqy0214@163.com

Abstract Objective：Based on the level of autophagy in HL-1 cells and the expression of key proteins of related pathways，to explore the mechanism of Suxiao Jiuxin Pills on hypoxia/reoxygenation（H/R） injury through the Alk B homolog 5（ALKBH5） regulation of glycogen synthetase kinase 3beta（GSK3β）/ mammalian target of rapamycin（mTOR） pathway to inhibit excessive autophagy.Methods：After construction of lentiviral interference carrier and screening of optimal interfering lentiviruses，the HL-1 cells were randomly divided into 3 groups and" blank transfection，ALKBH5 transfection，and GSK3β transfection.Each group was randomly divided into 4 groups;hypoxia/reoxygenation（model group），hypoxia/reoxygenation＋Suxiao Jiuxin Pills treatment（Suxiao group），hypoxia/reoxygenation＋ligustrazine treatment（ligustrazine group），hypoxia/reoxygenation ＋borneol treatment（borneol group）.Autophagy flow was detected by double fluorescence staining of autophagy double-labeled adenovirus（mRFP-eGFP-LC3），cell proliferation was detected by cell counting（CCK8），apoptosis was detected by double-stained bivariate flow cytometric analysis（Annexin V/PI），the number and morphology of autophagic vesicles were observed by transmission electron microscopy，and GSK3β，mTOR content，and autophagy-related gene（autophagy-related gene，Atg5），benzyl chloride 1（Beclin1），autophagy-related protein microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/Ⅰ），and autophagy marker p62 were detected by Western Blot.Results：ALKBH5 overexpression inhibited GSK3β expression and enhanced mTOR expression（P＜0.05）.mRFP-eGFP-LC3 dual fluorescence staining for autophagy flow detection showed that compared with the blank transfected under the condition of H/R，ALKBH5 transfection promoted autophagy and GSK3β transfection inhibited autophagy（P＜0.05）.The results of CCK8 assay" showed that compared with the model group，cell proliferation was promoted in the Suxiao group，ligustrazine group，and borneol group.Compared with the blank transfection，cell proliferation was inhibited in the ALKBH5 group，and cell proliferation was promoted in the GSK3β group（P＜0.05）.

Annexin V/PI double staining assay was used to detect apoptosis in cardiomyocytes，the result suggested that compared with the model group，in the Suxiao group，ligustrazine group，and borneol group apoptosis was inhibited，and ALKBH5 transfection and GSK3β transfection" increased apoptosis compared with the blank group（P＜0.05）.Western Blot suggested that in the Suxiao group，ligustrazine group，and borneol group" LC3Ⅱ/Ⅰ，Atg5，Atg7，and p62 expressions were inhibited and mTOR expression was enhanced（P＜0.05）.Compared with blank transfection，ALKBH5 transfection enhanced LC3Ⅱ/Ⅰ，Atg5，Atg7，p62 expression and inhibited mTOR expression; GSK3β transfection inhibited LC3Ⅱ/Ⅰ，Atg5，Atg7，p62 expression and enhanced mTOR expression（P＜0.05）.Conclusion：Suxiao Jiuxin Pills could inhibit excessive autophagy via the ALKBH5/GSK3β/mTOR signaling pathway，and alleviate the hypoxia/reoxygenation injury in cardiomyocytes.

Keywords cardiomyocytes; hypoxia/reoxygenation injury; Suxiao Jiuxin Pills; Alk B homolog 5，ALKBH5; glycogen synthetase kinase 3beta， GSK3β; mammalian target of rapamycin， mTOR; autophagy; experimental study

基金項目 國家自然科學基金面上項目（No.82174152，82074222）；上海市臨床重點?？祈椖浚∟o.shslczdzk05301）

作者單位 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（上海" 201203）

通訊作者 王肖龍，E-mail：wxlqy0214@163.com

引用信息 李檫，李益萍，王可妍，等.基于ALKBH5調(diào)控GSK3β/mTOR通路抑制過度自噬探討速效救心丸減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用機制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（24）：4510-4519.

隨著人們生活節(jié)奏加快及壓力增加，全球心血管病患病率逐年升高，急性心血管疾病具有較高的致死率和致殘率，嚴重危害人類生命健康［1］。ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）是急性心血管疾病的常見類型，也是主要的致死原因之一。STEMI主要是通過直接經(jīng)皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）進行早期心肌再灌注治療［2］。缺血再灌注是指缺血組織、器官重新得到血液灌注后，功能及結(jié)構(gòu)損傷得以恢復或修復。某些情況下，缺血再灌注反之加重組織、器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷［3］，即缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）。PCI后引發(fā)的心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是導致STEMI病人出現(xiàn)心功能減退甚至心源性休克的重要原因之一。因此，要增加PCI治療血運重建的獲益，減少IRI是重要環(huán)節(jié)。目前認為心肌細胞自噬的過度激活在MIRI中發(fā)揮著重要的作用［4-6］。有研究顯示，再灌注期間，心肌細胞產(chǎn)生大量氧自由基，自噬被持續(xù)過度激活，導致心肌細胞發(fā)生自噬性死亡，進而加重心肌損傷［7］。因此，抑制MIRI過程中的過度自噬可能起到保護作用。

近年來，表觀遺傳學的RNA甲基化修飾調(diào)節(jié)細胞自噬水平受到重視，已成為研究的熱點。表觀遺傳學修飾包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)的化學修飾。N6-腺嘌呤甲基化（m6a）是高等生物mRNA上普遍、重要的RNA甲基化修飾［8］。一類由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白（METTL）3、METTL14和甲基轉(zhuǎn)移酶腎母細胞瘤1相關(guān)蛋白（WTAP）形成的核心甲基化酶復合體，主要功能是“寫入”，即增加RNA上的m6a甲基化修飾；另外一類包括肥胖相關(guān)基因蛋白（FTO）、Alk B同源蛋白5（ALKBH5）等的去甲基化酶，主要功能是“清除”，即去除RNA上的m6a甲基化修飾［9］。有研究顯示，m6a去甲基化酶FTO通過上調(diào)UNC-51類似自噬激活激酶1（UNC-51 like autophagy activating kinase1，ULK1）蛋白的豐度，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，Atg）5、Atg7表達，進而發(fā)揮促進自噬的作用［10-11］。Song等［12］研究顯示，缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）后野生型小鼠心肌細胞METTL3上調(diào)可促進自噬并加劇H/R處理的心肌細胞凋亡；RNA去甲基化酶ALKBH5的過表達可逆轉(zhuǎn)METTL3引起的心肌細胞損傷。上述研究證實m6a修飾可對細胞自噬發(fā)揮作用。

自噬的調(diào)控是由一系列信號通路完成的，糖原合成酶激酶3（GSK3）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是重要的組成部分［13］。mTOR是多個自噬相關(guān)通路的下游，是整個自噬的關(guān)鍵核心之一，抑制mTOR表達可促進自噬［14-15］。GSK3是一種在細胞中普遍表達的絲氨酸-蘇氨酸激酶，可調(diào)節(jié)糖原代謝和轉(zhuǎn)錄的過程。GSK3有不同基因編碼的兩個密切相關(guān)的蛋白亞型，分別為GSK3α（51 kDa）和 GSK3β（47 kDa）［16］。相關(guān)研究顯示，GSK3β通過抑制心肌細胞過度自噬減輕MIRI［17-18］。

速效救心丸是臨床治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的經(jīng)典中成藥，療效確切。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，速效救心丸對急性冠脈綜合征病人血運重建術(shù)后具有良好的臨床療效［19-20］。本研究觀察速效救心丸對m6a甲基化修飾通過調(diào)控GSK3β/mTOR通路抑制細胞自噬，探討速效救心丸保護MIRI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 心肌細胞

HL-1心肌細胞購自上海諾百生物有限公司。

1.2 實驗藥品

速效救心丸（天津中新藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字Z12020025），其濃度基于前期基礎(chǔ)研究［21］，分別采用無水乙醇將速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片稀釋溶解至50、100、25 mg/mL，與細胞共培養(yǎng)時使給藥終濃度為50、100、25 μg/mL。。

1.3 實驗試劑

實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（promega公司）；三氯甲烷（上海國藥集團化學試劑公司）；異丙醇（上海國藥集團化學試劑公司）；SYBR Green熒光染料（美國ABI公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Corning公司）；蛋白質(zhì)提取試劑盒、電化學發(fā)光（ECL）試劑盒、配膠試劑盒、Tris、Glycine、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（上海碧云天生物技術(shù)公司）；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/Ⅰ）、p62、Atg5、Atg7、mTOR、GSK3β單克隆抗體（美國Abcam 公司）；miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）（上海生工生物工程股份有限公司）；miRNA熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（染料法）（上海生工生物工程股份有限公司）；雙染色雙變量流式細胞分析法（Annexin V/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（M30233，Mbchem）；Trizol（invitroqen公司）；m6a RNA Methylation Assay試劑盒（Colorimetric）ab185912（美國Abcam 公司）。

1.4 實驗儀器

S1000 Thermail Cycler（美國BIO-RAD）；高速冷凍離心機（Neofuge13R，Heal Force）；Labsystems multiskan MS Microplate Reader 型酶標儀（芬蘭制造）；電泳裝置（美國BIO-RAD）；Beckman coulter 離心機（美國貝克曼）；渦旋振蕩器votex-2（海門市其林貝爾儀器制造公司）；高速冷凍離心機（Neofuge13R，Heal Force）；StepOnePlus REAL-TIME PCR儀（美國Thermo公司）；SDS-PAGE電泳儀（美國BIO-RAD公司）；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀（美國BIO-RAD公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 H/R模型的建立

將HL-1細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的高糖DMEM中，5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)至第3代后建立H/R模型。更換培養(yǎng)基為低糖無血清的DMEM，在缺氧條件下（1%O2、94%N2、5%CO2）培養(yǎng)2 h后再復氧（95%空氣，5%CO2）4 h后進行各項指標檢測?？瞻捉M將培養(yǎng)的心肌細胞直接放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不進行任何處理。

1.5.2 篩選m6a功能蛋白及分組

首先將HL-1細胞隨機分為模型組、速效組、川芎嗪組和冰片組，采用qPCR檢測m6a甲基化酶及去甲基化酶METTL3、METTL14、ALKBH5、FTO表達，m6a試劑盒檢測m6a水平。選取靈敏度最高的ALKBH5進行實驗，將HL-1細胞分為模型組、速效組、川芎嗪組和冰片組，分別給予空白、ALKBH5、GSK3β轉(zhuǎn)染。

1.5.3 ALKBH5過表達對GSK3β及mTOR的干預

qPCR檢測空白轉(zhuǎn)染與ALKBH5過表達轉(zhuǎn)染對GSK3β及mTOR的影響。

1.5.4 構(gòu)建rat ALKBH5的干擾慢病毒載體

根據(jù)rat ALKBH5（NM_001191643.1）序列，設(shè)計3對Oligo進行基因合成，序列退火成雙鏈DNA后構(gòu)入到慢病毒骨架載體PDS125_pL-U6-SHRNA-CCDB中（酶切位點BsmBI），并測序驗證。

1.5.5 構(gòu)建rat GSK3干擾載體

根據(jù)rat GSK3（NM_032080.1）序列設(shè)計3對Oligo進行基因合成，序列退火成雙鏈DNA后構(gòu)入到慢病毒骨架載體PDS125_pL-U6-SHRNA-CCDB中（酶切位點BsmBI），構(gòu)建rat ALKBH5的干擾慢病毒載體，并測序驗證。

1.5.6 慢病毒包裝

將rat ALKBH5 3個干擾載體：CL1931-PDS125_pL-U6-SHRNA_ALKBH5-599、CL1932-PDS125_pL-U6-SHRNA-ALKBH5-810、CL1933-PDS125_ pL-U6-SHRNA-ALKBH5-1016和rat GSK3 3個干擾載體（CL1937-PDS125_pL-U6-SHRNA-GSK3b-243、CL1938-PDS125_pL-U6-SHRNA-GSK3b-596、CL1939-PDS125_pL-U6-SHRNA-GSK3b-731）分別與包裝質(zhì)粒（packaging mix）共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝病毒，收集病毒液并測定滴度。

1.5.7 最佳干擾慢病毒篩選

分別采用3個rat ALKBH5干擾慢病毒及3個rat GSK3干擾慢病毒侵染rBMSC細胞。設(shè)置陰性慢病毒侵染對照組及空白細胞組，48 h后收集細胞，檢測干擾效率。

1.5.8 檢測m6a甲基化表達

采用Colorimetric法m6a甲基化試劑盒檢測m6a甲基化表達。

1.5.9 mRFP-eGFP-LC3雙熒光染色檢測自噬

使用mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各組HL-1細胞，再以400倍顯微鏡觀察細胞內(nèi)紅色和綠色LC3亮點的變化，隨機選取300個細胞拍照，包括紅色熒光圖、綠色熒光圖，分別計數(shù)自噬體及自噬溶酶體，重復3次，取平均值。

1.5.10 細胞計數(shù)法（CCK8）檢測細胞增殖

將待測細胞以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后采用1mL胰蛋白酶溶液（含有乙二胺四乙酸）消化，以1 000 r/min離心5 min，重懸后進行細胞計數(shù)，于96孔板每孔加入細胞懸液100 μL，待細胞完全貼壁后，吸出各孔中培養(yǎng)基，加入90 μL新鮮DMEM培養(yǎng)基，檢測時直接向每孔加入CCK8溶液10μL，培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標儀檢測各孔在OD450 nm處的吸光度值，分析數(shù)據(jù)。

1.5.11 Annexin V/PI雙染色法檢測心肌細胞的凋亡

將待測細胞PBS沖洗后予1 mL胰蛋白酶溶液（含有乙二胺四乙酸）消化，以1 000 r/min離心5 min，重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光條件下，室溫反應(yīng)10 min，加入400 μL標記緩沖液，混勻，1 h內(nèi)通過流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.5.12 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62、mTOR表達

提取各組細胞蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒蛋白定量后變性，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，各目的蛋白一抗（1∶1000稀釋）孵育，4℃過夜，二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育2 h，洗膜，顯影。以目的蛋白條帶和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值為目的蛋白的表達量。以Graph pad作圖。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)（四分位間距）［M（Q1，Q3）］表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism 9.1軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 m6a功能蛋白篩選METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5

與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可降低m6a甲基化及METTL3、WTAP表達，升高ALKBH5的表達（P＜0.05）。詳見圖1。ALKBH5的靈敏度最高。

2.2 ALKBH5過表達對GSK3β及mTOR的影響

與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5過表達可抑制GSK3β表達，增強mTOR表達（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3 rat ALKBH5干擾載體的序列

共獲得3個測序正確的rat ALKBH5干擾載體：CL1931-PDS125_pL-U6-SHRNA-ALKBH5-599、CL1932-PDS125_pL-U6-SHRNA-ALKBH5-810、CL1933-PDS125_pL-U6-SHRNA-ALKBH5-1016。詳見表1。

2.4 rat GSK3干擾載體的序列

共獲得3個測序正確的rat GSK3干擾載體：CL1937-PDS125_pL-U6-SHRNA-GSK3b-243、CL1938-PDS125_pL-U6-SHRNA-GSK3b-596、CL1939-PDS125_pL-U6-SHRNA-GSK3b-731。詳見表2。

2.5 rat ALKBH5最佳干擾慢病毒

共獲得最佳干擾慢病毒rat ALKBH5為VL1931-PDS125_pL-U6-SHRNA-ALKBH5-599；rat GSK3為VL1938-PDS125_pL-U6-SHRNA-GSK3b-596。

2.6 m6a甲基化的表達

與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可抑制m6a甲基化（P＜0.05）；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可促進m6a甲基化（P＜0.05）。詳見圖3。

2.7 mRFP-eGFP-LC3的雙熒光染色

與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可促進自噬，GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制自噬（P＜0.05）。詳見圖4、圖5。

2.8 CCK8法檢測HL-1細胞增殖" 與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可促進細胞增殖（P＜0.05）；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可抑制細胞增殖，GSK3β轉(zhuǎn)染可促進細胞增殖（P＜0.05）。詳見圖6。

2.9 Annexin V/PI雙染色法檢測心肌細胞凋亡

與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可抑制細胞凋亡（P＜0.05）；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可促進細胞凋亡，GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制細胞凋亡（P＜0.05）。詳見圖7、圖8。

2.10 Western" Blot檢測LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62、mTOR表達

與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，增強mTOR表達（P＜0.05）；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可增強LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，抑制mTOR表達；GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，增強mTOR表達（P＜0.05）。詳見圖9～圖14。

3 討 論

隨著對自噬機制的深入研究，通過調(diào)控自噬改善MIRI的治療方法越來越受到重視。有研究表明，表觀遺傳學上RNA甲基化修飾（m6a修飾）與MIRI中自噬密切相關(guān)［22］。m6a修飾功能主要由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶及m6a結(jié)合蛋白組成［23］。其中甲基轉(zhuǎn)移酶主要功能為“編碼器（Writer）”，包括METTL3、METTL14、WTAP等，METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細胞核內(nèi)亞細胞器——核小斑（nuclear speckle）上，表明m6a修飾可能與RNA的剪切加工相關(guān)。WTAP與METTL3-METTL14 二聚體相互作用，共同定位于核小斑，影響甲基化效率，參與mRNA剪切［24］。去甲基化酶主要功能為“消碼器（Eraser）”，包括FTO、ALKBH5等，F(xiàn)TO是ALKB家族的成員，作為第一個被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶，影響富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2（SRSF2）的RNA結(jié)合能力，進而調(diào)控pre-mRNA的剪切加工過程［25］。ALKBH5是ALKB家族中具有去甲基作用的一個成員，可直接催化m6a-甲基化腺苷去除甲基，不同于FTO的氧化去甲基化［26］。

目前，關(guān)于ALKBH5的研究主要集中于腫瘤領(lǐng)域。Zhang等［27］研究顯示，在人乳腺癌細胞中敲低ALKBH5表達的能力可顯著降低啟動腫瘤的能力。Chao等［28］研究顯示，在間歇性缺氧條件下ALKBH5通過下調(diào)m6a修飾抑制肺腺癌細胞的增殖和侵襲。有研究報道，在胃癌及結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤中ALKBH5均有抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用［29-30］。Zhu等［31］研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5通過m6a去甲基化增強B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）mRNA的穩(wěn)定性，從而促進Bcl-2與Beclin-1的相互作用，抑制上皮性卵巢癌細胞中的自噬。Beclin-1在自噬過程中發(fā)揮著重要的作用，提示ALKBH5介導的m6a甲基化修飾對自噬的干預及其與自噬中經(jīng)典信號通路的相關(guān)性可能在MIRI自噬的研究中成為一個關(guān)鍵節(jié)點。一項研究顯示，m6a的甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3可抑制H/R心肌細胞顯示中自噬的表達，ALKBH5可逆轉(zhuǎn)這種作用，這個負反饋通路為METTL3、ALKBH5和自噬之間關(guān)系提供了依據(jù)［12］。

GSK3β/mTOR信號通路是自噬過程中一條經(jīng)典的信號通路，目前關(guān)于ALKBH5與GSK3β相關(guān)性的研究報道較少?？芍貜偷拿庖吖渤恋韺嶒灲Y(jié)果顯示，ALKBH5與較多RNA靶標共沉淀一致，因此ALKBH5證實是mRNA結(jié)合蛋白質(zhì)組成的一部分，提示ALKBH5與其他RNA底物的強相互作用［32］。結(jié)合已有的研究結(jié)果，可知ALKBH5對自噬有明確干預作用且預測其機制可能與自噬相關(guān)經(jīng)典信號通路作用有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，ALKBH5過表達可抑制GSK3β表達，增強mTOR表達。證實ALKBH5調(diào)控自噬的作用機制與GSK3β/mTOR信號通路相關(guān)。

本研究分別通過構(gòu)建rat ALKBH5的干擾慢病毒載體及rat GSK3干擾慢病毒載體經(jīng)慢病毒包裝及篩選獲得了最佳相關(guān)干擾慢病毒。經(jīng)轉(zhuǎn)染HL-1細胞后分為模型組、速效組、川芎嗪組和冰片組。首先采用Colorimetric法m6a甲基化試劑盒檢測m6a甲基化的表達，結(jié)果顯示，與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可抑制m6a甲基化；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可促進m6a甲基化，GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制m6a甲基化。證實了m6a甲基化與自噬存在密切關(guān)系，且速效救心丸及其有效成分可抑制m6a甲基化。mRFP-eGFP-LC3的雙熒光染色檢測自噬流結(jié)果顯示，與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可促進自噬，GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制自噬。CCK8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示，與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可促進細胞增殖；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可抑制細胞增殖，GSK3β轉(zhuǎn)染可促進細胞增殖。Annexin V/PI雙染色法檢測心肌細胞的凋亡結(jié)果顯示，與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組均可抑制細胞凋亡；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可促進細胞凋亡，GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制細胞凋亡。Western Blot法檢測LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62結(jié)果顯示，與模型組比較，速效組、川芎嗪組、冰片組可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，增強mTOR表達；與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可增強LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，抑制mTOR表達，GSK3β轉(zhuǎn)染可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表達，增強mTOR表達。ALKBH5及GSK3β轉(zhuǎn)染通過抑制過度自噬減輕MIRI，且冰片單體效果優(yōu)于速效組及川芎嗪組，分析可能冰片對ALKBH5靈敏度更高有關(guān)。需進一步重復實驗及完善體內(nèi)研究驗證。通過ALKBH5轉(zhuǎn)染對GSK3β及mTOR的干預結(jié)果顯示，與空白轉(zhuǎn)染比較，ALKBH5轉(zhuǎn)染可抑制GSK3β表達，增強mTOR表達。證實ALKBH5對GSK3β/mTOR信號通路有影響。

綜上所述，速效救心丸通過抑制過度自噬發(fā)揮保護MIRI的作用，其作用機制與ALKBH5調(diào)控GSK3β/mTOR信號通路有關(guān)。本研究僅完善了體外部分的實驗，仍需進一步體內(nèi)試驗驗證結(jié)論。目前關(guān)于MIRI仍無較好的治療方法，已有部分研究證實了中草藥可有效減輕MIRI，但多數(shù)研究仍局限于中藥單體成分，關(guān)于中成藥及復方的作用機制有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2022-03-01）

（本文編輯薛妮）