占敏, 卓豐, 吳敏, 李科浩, 張守華, 楊豆

江西省兒童醫(yī)院 1普外科， 2心臟病中心(江西南昌 330038)； 3南昌大學(xué)藥學(xué)院(江西南昌 330006)

阿霉素(adriamycin, ADM)是一種含醌的蒽環(huán)類藥物，廣泛用于治療實(shí)體和血液系統(tǒng)惡性腫瘤，但其嚴(yán)重不良反應(yīng)的心臟毒性導(dǎo)致臨床上應(yīng)用受制約。ADM所致心臟毒性呈劑量依賴性，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失、線粒體功能障礙、肌原纖維變性和預(yù)后不良的充血性心功能衰竭[1]。血小板反應(yīng)蛋白1(thrombospondins-1, TSP1)是細(xì)胞外基質(zhì)中的基質(zhì)細(xì)胞蛋白，在各種心血管疾病的病理過(guò)程中起著重要作用。TSP-1通過(guò)直接或間接與配體相互作用來(lái)調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)和活性，從而調(diào)節(jié)不同類型細(xì)胞對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)活性。許多心血管疾病的病理過(guò)程都與細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解和重塑以及細(xì)胞遷移、功能障礙和凋亡有關(guān)，這可能通過(guò)不同的機(jī)制受到TSP-1的調(diào)節(jié)[2]。TSP-1在多種心血管疾病的病理過(guò)程中起著重要作用，可能為在分子水平上治療不同的心血管疾病提供新的靶點(diǎn)，特別是TSP1在心臟病中的作用仍然是正在進(jìn)行的研究的重點(diǎn)。代謝組學(xué)是一門繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)后的新興學(xué)科，它通過(guò)檢測(cè)樣本中的小分子化合物及多變量分析，發(fā)現(xiàn)和確定與病理相關(guān)的差異代謝物。對(duì)于心臟疾病中TSP1相關(guān)基因的表達(dá)情況已有相關(guān)研究，但是至今未見(jiàn)其調(diào)控小分子代謝物方面的研究報(bào)道。2020年10月至2022年1月，本研究以野生型C57BL/6和TSP1基因敲除后的小鼠(TSP1-/-)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)比ADM所致的心肌損傷小鼠體內(nèi)代謝物的變化情況，探討TSP1敲除減弱ADM造成的心肌損傷的代謝機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?C57BL/6小鼠購(gòu)自湖南斯萊克生物技術(shù)有限公司。TSP1-/-小鼠由C57BL/6背景產(chǎn)生，購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室。ADM購(gòu)自瀚暉制藥。所有研究均經(jīng)江西省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(JXSETYY-YXKY-20220162)。24只野生型C57BL/6和24只TSP1-/-小鼠(20～25 g)分為4組：WM組(n=12)、TSP1-/-組(n=12)和WM-ADM組(n=12)、TSP1-/--ADM組(n=12)。WM組和TSP1-/-組小鼠腹腔注射生理鹽水，WM-ADM組和TSP1-/--ADM組小鼠腹腔注射ADM以建立慢性心功能衰竭(CHF)模型，直至ADM累計(jì)劑量達(dá)15 mg/kg(2.5 mg/kg，溶于生理鹽水中，每3 d 1次，共6次)。注射ADM后常規(guī)喂養(yǎng)，觀察和記錄小鼠體重情況，最后一次給藥后3 d處死小鼠[1]，收集血液和心臟。血液樣本靜置1 h后3 000g離心10 min以采集血清，并儲(chǔ)存在-80℃。心臟用生理鹽水沖洗干凈，中性甲醛溶液溶液固定用于病理分析，剩余部分-80℃保存。

1.2 血液生化檢測(cè) 肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 組織學(xué)分析 心臟組織在甲醛溶液固定后，常規(guī)切片(4 μm)進(jìn)行常規(guī)蘇木精和伊紅染色，觀察組織形態(tài)變化。

1.41HNMR檢測(cè)樣本處理 取WM組小鼠、TSP1-/-組小鼠、WM-ADM組和TSP1-/--ADM組小鼠對(duì)應(yīng)的血清各12例用于1HNMR檢測(cè)。4℃解凍血清樣本，取血清200.0 μL加入800.0 μL甲醇，混勻后12 000g離心5 min，取上清液800.0 μL使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于35℃下?lián)]發(fā)干溶劑以得到濃縮樣本。加入550 μL氘代甲醇復(fù)溶，渦旋混勻，超聲5 min，于12 000 r/min離心5min，取上清液550 μL移入5 mm核磁管。NMR譜采樣前，將樣本置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹3-5]。

每個(gè)1H NMR光譜強(qiáng)度數(shù)據(jù)集被歸一化為整個(gè)光譜的總譜強(qiáng)度。歸一化后數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P (version 14.1)，采用UV標(biāo)度化預(yù)處理后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析如主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析法(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)[6]。通過(guò)OPLS-DA其載荷圖和變量重要性(variance importance, VIP)數(shù)據(jù)獲得引起分類差異的特征變量[7]。通過(guò)將其化學(xué)位移和耦合模式與相應(yīng)值進(jìn)行比較，在1H NMR光譜中確定了代謝物[8]。

通過(guò)將1H-NMR光譜中的代謝物的化學(xué)位移和耦合方式與文獻(xiàn)和公開(kāi)的可訪問(wèn)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.bmrb.wisc.edu, http://www.hmdb.ca)中參數(shù)進(jìn)行對(duì)比，以鑒定出代謝物。對(duì)上述已鑒別的特征核磁峰在一定的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行積分，并對(duì)其在TSP 1-/-和WM兩組的平均值是否存在差異進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn) (SPSS 23.0)。 將具有顯著性差異的代謝物導(dǎo)入在線的MetaboAnalyst分析軟件，對(duì)其中所涉及的代謝通路進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 敲除TSP1對(duì)ADM致急性心功能衰竭小鼠心肌酶的作用 注射ADM后WM-ADM組小鼠CK、CK-MB、LDH均明顯升高，分別是(1.86±0.16)U/mL、(159.68±12.37) U/mL以及(7 257.76±430.83) U/L，與WM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而TSP1-/--ADM組小鼠CK、CK-MB相比WM-ADM組顯著降低(P<0.05)，分別為(1.46±0.12)U/mL及(128.84±8.30)U/mL；LDH為(6 848.49±282.92)U/L，LDH差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

注：*P<0.05

2.2 敲除TSP1對(duì)急性心功能衰竭小鼠心肌損傷的改善作用 心肌組織HE染色顯示，WM組小鼠心肌纖維排列平行，胞核清晰，未見(jiàn)胞體水腫，組織間隙正常。WM-ADM組心肌組織受損，纖維中斷，排列錯(cuò)綜交叉無(wú)規(guī)律，部分心肌細(xì)胞水腫和呈空泡樣變性，心肌纖維斷裂，呈小灶狀或片狀壞死;心肌細(xì)胞間隙明顯增寬。與WM-ADM組相比，TSP1-/--ADM組心肌組織受損程度明顯減輕(圖2)。

2.31H NMR 數(shù)據(jù)的聚類分析 我們以基于1H NMR的非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法對(duì)WM小鼠、TSP1-/-小鼠、WM-ADM小鼠和TSP1-/--ADM小鼠血清進(jìn)行分析。WM組、WM-ADM組和TSP1-/--ADM組小鼠血清樣本的1H NMR一維圖譜如圖3所示，三組間的1H NMR譜存在共同的物質(zhì)峰，同時(shí)觀察到在某些化學(xué)位移處的波峰大小有明顯差異。

將歸一化后1H NMR數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件行多變量分析，四組小鼠血清PCA 得分圖和OPLS-DA得分圖如圖4所示。經(jīng)PCA后前兩個(gè)主成分能大致的反映數(shù)據(jù)集所包含的信息(累積方差>60%)，從該圖可以看出各組樣品基本聚集在一區(qū)域，TSP1-/-和WM-ADM組均遠(yuǎn)離WM，說(shuō)明各組血清的代謝表型具有差異。

OPLS-DA模型擬合的質(zhì)量通常用R2Y (cum)和Q2(cum)兩個(gè)參數(shù)評(píng)估，R2Y(cum)表示模型的解釋力，Q2(cum)表示模型的預(yù)測(cè)能力，一般情況下, R2Y(cum)和Q2(cum)>0.5時(shí),說(shuō)明模型較好[9]。本研究所建立四組小鼠組血清OPLS-DA模型中R2Y=0.961，Q2=0.615，表明OPLS-DA模型均可行。同時(shí)，為避免所得結(jié)果具有偶然性，并檢驗(yàn)該模型的重現(xiàn)性是否良好和數(shù)據(jù)是否過(guò)擬合，我們通過(guò)200次7倍交叉檢驗(yàn)及置換檢驗(yàn)來(lái)考查該模型的有效性。以Q2回歸線與軸的截距值作為衡量模型是否過(guò)擬合的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Q2的截距為負(fù)值時(shí),模型有效[10]。結(jié)果顯示，四組小鼠組血清樣本模型中Q2=-0.265，表明OPLD-DA模型有效。綜上，我們確定所建立的OPLS-DA模型可用于篩選WM小鼠和TSP1-/-小鼠、WM-ADM小鼠和TSP1-/--ADM小鼠血清中的差異代謝物。

2.4 WM，TSP1-/-，WM-ADM，TSP1-/--ADM小鼠差異代謝物的篩選與鑒定 我們以基于OPLS-DA模型的VIP值為篩選標(biāo)準(zhǔn)，一般而言，VIP值>1.0的變量對(duì)模型的聚類有貢獻(xiàn)[11-12]。本研究以VIP>1.0為標(biāo)準(zhǔn)，在四組小鼠血清篩選和鑒定出了16種代謝物，其中血清代謝物結(jié)果見(jiàn)表1。我們發(fā)現(xiàn)與WM組小鼠相比，TSP1-/-組小鼠多種氨基酸類物質(zhì)受到影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)WM-ADM組小鼠血清亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸、丙酮酸共7種代謝物差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相比WM組，WM-ADM組亮氨酸、丙酮酸水平分別下調(diào)至6.79±0.82、15.94±0.51，乳酸水平上升至3.76±0.05；而在TSP1-/--ADM組小鼠血清如亮氨酸、異亮氨酸、丙酮酸具有明顯的回調(diào)ADM造成的下降，分別回調(diào)到7.86±0.36、22.74±0.93、16.13±0.50，乳酸下降到3.51±0.07。 代謝通路分析也進(jìn)一步驗(yàn)證了WM-ADM與TSP1-/--ADM小鼠血清氨基酸和糖代謝通路受到明顯影響(圖5)。

3 討論

心功能衰竭是臨床常見(jiàn)的危重癥之一，是多種心血管疾病的末期表現(xiàn)。阿霉素是一種有效的腫瘤化療藥物，具有明顯的心臟毒性，可引起心肌炎及心功能衰竭。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在野生型和TSP1-/-小鼠腹腔注射阿霉素建立了CHF模型。

TSP1介導(dǎo)的信號(hào)通路在心臟疾病中有著重要作用，有研究表明，衰竭心臟中TSP1的表達(dá)降低，這可能與心室擴(kuò)張有關(guān)[13-14]。用激活cd47的TSP1衍生肽治療心肌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，這表明TSP-1可能導(dǎo)致左心室肥大和心功能衰竭[15]。通過(guò)對(duì)血清中CK、CK-MB、LDH等指標(biāo)和心臟組織HE染色分析，我們亦發(fā)現(xiàn)TSP1-/--ADM組小鼠心臟損傷顯著減輕。為進(jìn)一步研究TSP1敲除后減弱ADM所致心臟損傷的機(jī)制，我們從代謝組學(xué)的角度來(lái)分析其可能的原因。

本研究中，我們利用基于1HNMR的代謝組學(xué)方法對(duì)未注射ADM的野生小鼠和TSP1-/-小鼠的血清中的差異代謝物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)敲除TSP1后，小鼠體內(nèi)多種氨基酸代謝類物質(zhì)代謝明顯不同。對(duì)注射ADM后WM小鼠研究分析，我們發(fā)現(xiàn)ADM會(huì)影響小鼠體內(nèi)的氨基酸和糖代謝，并且注射ADM后TSP1-/-小鼠體內(nèi)的氨基酸和糖代謝影響程度顯著低于野生型小鼠。由此，我們推斷敲除TSP1可能通過(guò)調(diào)節(jié)氨基酸和糖代謝來(lái)減弱ADM造成的心肌損傷。

圖3 WM組、WM-ADM組和TSP1-/--ADM組小鼠血清1H NMR圖譜比較

注：A：血清PCA評(píng)分圖；B：血清PLS-DA評(píng)分圖；C：血清OPLS-DA評(píng)分圖；D：200次交叉驗(yàn)證圖

表1 各組血清代謝物的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

注：a：丙酮酸代謝；b：糖酵解/糖異生；c：檸檬酸鹽循環(huán)；d：纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成；e：氨基?；?tRNA生物合成

心臟代謝主要分為3個(gè)部分,細(xì)胞膜吸收和胞質(zhì)激活,線粒體氧化和進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA),最終通過(guò)電子鏈和ATP合成酶進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移和氧化還原合成ATP。為了維持ATP的產(chǎn)生,心臟可以代謝一系列底物,包括脂肪酸、糖、酮體、乳酸和氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)心功能衰竭時(shí),脂肪酸的攝取和氧化降低,葡萄糖代謝增加。心肌梗死和心功能衰竭時(shí)可以導(dǎo)致如支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)(BCAA),牛磺酸或谷氨酰胺等氨基酸代謝的異常[16-18]。亮氨酸的輔酶衍生物還可繼續(xù)參與支鏈脂肪酸的合成。本研究WM-ADM小鼠血清中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸含量與WM小鼠相比具有顯著差異，說(shuō)明支鏈氨基酸代謝發(fā)生紊亂。而在TSP1-/--ADM組小鼠血清中相關(guān)氨基酸含量變化程度低于WM組小鼠。由此，我們認(rèn)為ADM會(huì)顯著影響小鼠體內(nèi)的氨基酸代謝，加重心肌組織的損傷。而TSP1-/-組小鼠可能通過(guò)維持其心臟中氨基酸代謝的平衡，最終減弱ADM造成的心肌損傷。

心血管疾病的發(fā)展過(guò)程主要受糖脂代謝因素的影響，糖脂代謝紊亂是多重代謝紊亂的核心。糖代謝異常包括乳酸、丙酮酸的代謝異常。研究表明BCAA在BCAA轉(zhuǎn)氨酶的作用下進(jìn)行可逆反應(yīng)，生成各自的支鏈α酮酸及谷氨酸，后者能夠促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)氨至丙氨酸。在正常心臟中，支鏈氨基酸直接抑制丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDH)活性，從而減少葡萄糖氧化并促進(jìn)脂肪酸氧化。在支鏈氨基酸分解代謝缺陷的心臟中，葡萄糖攝取，氧化，糖原含量和蛋白質(zhì)糖基化顯著降低[19]。同時(shí)BCAA代謝產(chǎn)物還會(huì)經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)形成終末產(chǎn)物乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，進(jìn)一步參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量和糖異生過(guò)程[20]。本研究中WM-ADM小鼠血清中乳酸、丙酮酸含量與WM小鼠相比具有顯著差異說(shuō)明糖代謝發(fā)生紊亂，而在TSP1-/--ADM組小鼠血清中乳酸、丙酮酸含量變化程度低于WM組小鼠。由此，我們認(rèn)為ADM會(huì)顯著影響小鼠體內(nèi)的糖代謝，加重心肌組織的損傷。而TSP1-/-組小鼠可能通過(guò)維持其心臟中糖代謝的平衡，最終減弱ADM造成的心肌損傷。本研究不足之處在于僅采用了1H NMR進(jìn)行代謝組學(xué)研究，未對(duì)標(biāo)志性差異物采用UPLC-MS進(jìn)行靶標(biāo)分析，從而對(duì)相關(guān)代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

本研究發(fā)現(xiàn)敲除TSP1可有效地減弱ADM造成的心肌損傷，通過(guò)基于1HNMR的代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與通過(guò)維持與氨基酸和糖相關(guān)的代謝平衡相關(guān)。

利益相關(guān)聲明：論文所有作者共同認(rèn)可論文無(wú)關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：研究設(shè)計(jì)為占敏與楊豆，研究方案執(zhí)行與實(shí)施為占敏、卓豐與吳敏，數(shù)據(jù)整理為李科浩與張守華，統(tǒng)計(jì)分析及論文撰寫為李科浩，論文審閱為楊豆。