蔡 琛,程先先,吳學森
(1蚌埠醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院,安徽蚌埠 233000;2蚌埠市疾病預防控制中心,安徽蚌埠 233000)
交鏈孢霉在自然界中分布范圍極其廣泛,對一些植物不僅具有腐生性,還具有致病性[1]。低溫條件下交鏈孢霉菌能夠正常生長繁殖,因此在冷鏈儲藏和運輸過程中食品也會存在腐敗和變質(zhì)[2]。該菌能產(chǎn)生多種有毒代謝產(chǎn)物,對人畜具有致癌作用并影響人畜健康。有研究表明,攝入被交鏈孢毒素污染的食品可能造成我國某些地區(qū)食管癌高發(fā)[3]。因此,食品中交鏈孢毒素的污染情況已成為重要的危害人體健康的公共衛(wèi)生問題。橄欖油含有較高水平的單不飽和脂肪酸,研究表明,食用單不飽和脂肪酸有降低血糖[4]、調(diào)節(jié)血脂[5]、降低膽固醇[6]等功效,越來越多居民選擇橄欖油。2019—2020年,我國已成為橄欖油進口量增長的第二大市場,我國將成為未來世界第一大橄欖油消費國[7]。本研究就固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定橄欖油中4種交鏈孢霉毒素含量及其分布狀況進行分析。
污染食品的交鏈孢霉種類多種多樣,其產(chǎn)生的交鏈孢毒素主要包括交鏈孢菌酮酸(TeA) 、交鏈孢酚(AOH)、騰毒素(TEN)、交鏈孢酚單甲醚(AME) 4類毒素[8]。
大多數(shù)交鏈孢毒素對人體造成的急性毒性程度較低。但有研究表明,AOH、AME對細胞產(chǎn)生遺傳毒性[9]和導致細胞突變[10]。FehR等[11]研究認為,AOH和AME在微摩爾濃度下顯著增加了人類癌細胞(HT29,A431)的DNA鏈斷裂率,其中AOH有效地抑制了DNA的松弛,并刺激了拓撲異構酶I、IIα和IIβ的DNA裂解活性從而引起細胞 DNA損傷。YEKELER等[12]研究認為,AME和TeA對小鼠食道可能產(chǎn)生毒性影響。實驗表明,每天給小鼠喂食AME或TeA,持續(xù)10個月后,通過光鏡檢查,在TeA處理的動物中觀察到中度和嚴重的發(fā)育不良,其特征是極性喪失、核多形性和超色性,表現(xiàn)為食管粘膜出現(xiàn)癌前病變。Lehmann等[13]用AOH 處理V79細胞,發(fā)現(xiàn)細胞分裂周期停滯在G2和S期。Wollenhaupt等[14]研究發(fā)現(xiàn),AOH對豬子宮內(nèi)膜細胞的生存能力有影響。在用 AOH處理后,S期的細胞明顯減少,而G(0)/G(1)期的細胞停滯,因此認為AOH在翻譯水平上影響基因的表達。Liu等[15]發(fā)現(xiàn),AME和AOH可與從人胎兒食道上皮細胞中分離出的DNA結合,激活其中的致癌物質(zhì)c-H-ras和c-mys,并在體外促進人胎兒食道上皮細胞的增殖,其次在食道癌高發(fā)區(qū)林縣的糧食中分離出來的主要污染性真菌為AOH和AME,因此認為進食被交鏈孢毒素污染的食品可能與中國某些地區(qū)食管癌高發(fā)有關。
3.1.1 材料 包裝橄欖油,市場購買。
3.1.2 試劑 細交鏈格孢菌酮酸(TeA,純度>99%)、鏈格孢酚(AOH,純度>99%)、騰毒素(TEN,純度>99%)和交鏈格孢酚單甲醚(AME,純度>99%)標準品,均購于美國 ROMER 公司;同位素內(nèi)標:細交鏈格孢菌酮酸-D13(TeA-D13,純度>99%)、鏈格孢酚-D2(AOH-D2,純度>99%)、騰毒素-D3(TEN-D3,純度>99%)、交鏈格孢酚單甲醚-D3(AME-D3,純度>99%)、標準品,均購于加拿大 TRC 公司;乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純),購于美國Thermor Fisher公司;無水磷酸二氫鈉(色譜純),購于天津科密歐化學試劑有限公司;碳酸氫銨(色譜純),上海羅恩化學試劑有限公司;磷酸(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0):稱取6.0 g無水磷酸二氫鈉,溶解于950 mL水中,用磷酸調(diào)節(jié)pH 3.0,用水定容至1 000 mL,混勻;固相萃取柱(Waters Oasis HLB 200 mg/6cc);樣品提取液:取550 mL乙腈,加到450 mL 0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)中,混勻;水(符合GB/T 6682規(guī)定的一級水)。
Thermo Fisher 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國ThermoFisher公司,配有Hypersil Gold VANQUISH C18色譜柱(1.9 μm,2.1 mm×100 mm);超聲波清洗器,上??破鲀x器設備有限公司;多管渦旋混勻儀,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;離心機,美國ThermoFisher公司;1/千電子天平,瑞士Mettle公司;50 mL塑料離心管,浙江拱東醫(yī)療器械股份有限公司;Milli-QA10 超純水器,美國 Millipore公司;固相萃取儀,上海力辰邦西儀器科技有限公司;氮吹儀,上海喬躍電子有限公司;移液器(1~10、10~100、100~1 000 μL),德國eppendorf公司。
3.3.1 超高效液相色譜條件 色譜柱型號:Hypersil Gold VANQUISH C18液相色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱溫條件:40℃;流動相配比:A(1.0 mmol/L碳酸氫銨溶液)+B(甲醇),采用梯度洗脫;梯度洗脫程序見表1;進樣量:2 μL;流速:0.25 mL/min。
表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序
3.3.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件 離子化模式:采用電噴霧離子源(ESI);電離方式:負離子模式;質(zhì)譜掃描方式:多反應監(jiān)測(MRM);電離電壓:3 500V;離子源溫度:350℃;鞘氣流量:35 Arb;碰撞氣流量:10 Arb;反吹氣流量:1 Arb。4種鏈格孢霉毒素及同位素內(nèi)標物的保留時間、監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。
表2 4種交鏈孢霉菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)
3.3.3 標準溶液的配制 (1)同位素內(nèi)標儲備液:分別準確稱取4種交鏈孢霉毒素內(nèi)標標準品,用乙腈溶解并定容,混勻,得到TeA-D13儲備液(100 μg/mL)、AOH-D2儲備液(100 μg/mL)、TEN-D3儲備液(100 μg/mL)、AME-D3儲備液(100 μg/mL),密封后置于-20℃避光保存。(2)標準儲備液:分別準確稱取適量4種鏈格孢霉毒素標準品,用甲醇溶解并定容,混勻,得到TeA標準儲備液(100 μg/mL)、AOH標準儲備液(100μg/mL)、TEN標準儲備液(100 μg/mL)、AME標準儲備液(100 μg/mL),密封后置于-20℃避光保存。(3)混合標準工作液(TeA:500 ng/mL,AOH:200 ng/mL,TEN:100 ng/mL,AME:20 ng/mL):分別準確移取50 μLTeA標準儲備液(100 μg/mL)、20 μLAOH儲備液(100 μg/mL)、10 μLTEN儲備液(100 μg/mL)、2 μLAME儲備液(100 μg/mL)至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混勻,密封后置于4℃避光保存。(4)混合內(nèi)標工作液(TeA-D13:500 ng/mL,AOH-D2:200 ng/mL,TEN:100 ng/mL,AME:20 ng/mL):分別準確移取50 μLTeA-D13標準儲備液(100 μg/mL)、20 μLAOH-D2儲備液(100 μg/mL)、10 μLTEN-D3儲備液(100 μg/mL)、2 μLAME-D3儲備液(100 μg/mL)至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混勻,密封后置于-20℃避光保存。(5)標準曲線繪制:取適量混合標準工作液和混合內(nèi)標工作液,用甲醇和水配置成標準系列,具體配置信息見下表3。將標準系列溶液注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,得到4種交鏈孢霉菌毒素的色譜圖和峰面積。分別以TeA、AOH、TEN、AME的濃度為橫坐標,以TeA、AOH、TEN、AME的峰面積與各自內(nèi)標峰面積之比為縱坐標,繪制TeA、AOH、TEN、AME標準曲線圖。
表3 4種交鏈孢霉菌毒素標準系列的配置方法
3.3.4 樣品前處理方法 (1)提取:橄欖油置于常溫避光保存,稱樣前需充分混勻。然后稱取橄欖油5 g(精確至0.001 g)于50 mL刻度離心管中,加入100 μL混合內(nèi)標工作液,渦旋混勻10 s,靜置過夜。樣品中加入25 mL樣品提取液,旋緊蓋子,渦旋混勻10 s,高速渦旋振蕩器震蕩提取20 min,于4℃,10 000 r/min離心10 min,室溫靜置2 h,待溶液明顯分層且上清液無細小油粒后,移取5 mL上清液,加入15 mL 0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0),混勻,10 000 r/min離心10 min,上清液待凈化。(2)凈化:HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化。將稀釋后的上清液(20 mL)全部過柱,再用5 mL 20%甲醇溶液淋洗,于負壓狀態(tài)下抽干柱子5 min。將小試管放于固相萃取柱下,依次用5 mL甲醇和5 mL乙腈洗脫,收集洗脫液于小試管中,45℃水浴氮吹近干,殘渣先用200 μL甲醇復溶,渦旋混勻10 s,再加1.8 mL水,渦旋混勻10 s。4℃,10 000 r/min下離心5 min,取上清液過0.22 μm有機濾膜,濾液經(jīng)LC-MS/MS進行檢測。
在優(yōu)化的高效液相色譜、質(zhì)譜和前處理條件下對空白基質(zhì)的標準系列進行檢測。表4結果表明,4種交鏈孢霉毒素在一定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關系,R>0.99。在信噪比為3 時,TeA 、AOH 、TEN、AME的檢出限在0.20~2.00 μg/kg 范圍之間。
表4 4種交鏈孢霉菌毒素的線性范圍、線性方程、R、檢出限
30份樣本中隨機選擇3份樣本,分別取其平行樣,在每份樣本平行樣中分別加入50 ngTeA、20 ngAOH、10 ngTEN、2 ngAME,與該樣本進行相同處理后經(jīng)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,計算得出回收率范圍92.25%~124.66%,精密度范圍3.79%~10.58%(表5)。
表5 4種交鏈孢霉菌毒素的加標回收率
本次橄欖油樣本量30份,每份樣本平行檢測6次取平均值。4種交鏈孢霉菌毒素在30份橄欖油中有不同濃度水平的檢出,總檢出率93.33%,總含量范圍0.631~4.261 μg/kg。AME檢出率最高93.33%,含量范圍0.631~9.098,最大濃度9.722 μg/kg,平均濃度2.361 μg/kg;AOH檢出率20.00%,含量范圍2.760~4.261,最大濃度4.261 μg/kg,平均濃度3.351 μg/kg;TEN檢出率10.00%,含量范圍0.705~1.288,最大濃度1.288 μg/kg,平均濃度0.959 μg/kg;TeA在30份樣本中未檢出,檢出率0.00%(表6)。
表6 4種交鏈孢霉菌毒素檢出率、含量范圍、最大濃度、平均濃度
30份橄欖油樣本中1種交鏈孢霉菌毒素檢出率93.33%,其中AOH檢出率20.00%、TEN檢出率10.00%、AME檢出率93.33%;2種交鏈孢霉菌毒素同時檢出率30.00%,其中TEN+AME同時檢出率10.00%、AOH+AME同時檢出率20.00%;3種交鏈孢霉菌毒素AOH+TEN+AME同時檢出率3.33%(表7)。
表7 交鏈孢霉菌毒素疊加檢出個數(shù)、檢出率
5份國產(chǎn)橄欖油中均檢測出交鏈孢霉菌毒素,檢出率100.00%。25份進口橄欖油中檢測出23份含有交鏈孢霉菌毒素,檢出率92.00%(表8)。但在5份國產(chǎn)橄欖油中交鏈孢霉菌毒素檢出成分均為AME,其他3種交鏈孢霉菌毒素均未檢出。25份進口橄欖油中AOH檢出6份,檢出率24.00%;TEN檢出3份,檢出率12.00%;AME檢出23份,檢出率92.00%(表9)。
表8 不同產(chǎn)地交鏈孢霉菌毒素檢出率
表9 不同產(chǎn)地4種交鏈孢霉菌毒素檢出率
建立固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定橄欖油中4種交鏈孢霉毒素的分析方法。本方法樣本檢測量小、靈敏度高、準確度高、精密度高,重現(xiàn)性好,是檢測橄欖油中交鏈孢霉毒素的理想方法。對采集的30份橄欖油進行檢測,結果發(fā)現(xiàn),93.33%(28/30)的樣品至少受到1種交鏈孢霉毒素污染。橄欖油中4種交鏈孢霉毒素檢出率AME>AOH>TEN>TeA,AME毒素是橄欖油中最主要的檢出毒素。在交鏈孢霉菌毒素疊加檢出率分析中發(fā)現(xiàn)30.00%(9/30)的樣品受到2種及2種以上交鏈孢霉菌毒素污染。國產(chǎn)和進口橄欖油中分析發(fā)現(xiàn),國產(chǎn)橄欖油中交鏈孢霉菌毒素檢出成分均為AME,進口橄欖油檢出成分有AOH、TEN、AME。
本研究僅測定包裝橄欖油中4種交鏈孢霉毒素,有文獻顯示[16],糧油作物在入庫儲存前若水分未降至安全水分界限(≤14%) 則易發(fā)生霉變產(chǎn)生交鏈孢霉毒素。橄欖油中交鏈孢霉毒素的檢出,不確定是橄欖中本身含有還是儲存過程中產(chǎn)生,又或者壓榨工藝中存在污染,還需要進一步探討。目前交鏈孢霉毒素種類繁多,在食物中污染范圍較廣,尤其是存在于小麥、玉米等農(nóng)作物及其制品中[17-18],其對人體健康的危害性尚沒有引起廣泛的關注。Lattanzio等[19]對97份意大利谷物、番茄和葵花籽樣本中均檢出TeA、AOH、TENA、ME,其中,TeA污染水平最高為16 752 μg/kg,TEN污染水平最高為570 μg/kg。李磊等[20]研究發(fā)現(xiàn),20份菜籽油中,2份樣品檢出TeA,3份樣品檢出AOH,本次研究填補了固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定橄欖油中交鏈孢霉毒素的空白。由于我國目前尚未對食品中交鏈孢霉毒素的檢出方法、限量標準進行規(guī)定,本次研究為將來交鏈孢霉毒素的風險評估和標準制定提供技術支持,從而更好地保護消費者健康。