孫 乾，郭增錚，鄭瑋雯，吳鈺涵，郭澤鑌

(1福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350000；2福建農(nóng)林大學(xué)中愛國際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計研究中心，福州 350000；3福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院，福州 350000)

蓮子為睡蓮科植物蓮的成熟種子，是中國特有的種質(zhì)資源和經(jīng)濟(jì)作物。蓮子營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)[1-3]，因種質(zhì)資源的不同，蛋白含量最高可達(dá)25%[4]，且富含多種氨基酸成分[5]。國內(nèi)外研究學(xué)者對蓮子蛋白分離以及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，如Zeng等[6]采用Osborne法對蓮子蛋白進(jìn)行分離，并采用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和紫外可見光譜(UV)對分離蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析。另有研究者分析了湘蓮等蓮子蛋白的組成結(jié)構(gòu)以及氨基酸特性，并對蓮子蛋白進(jìn)行了物理與酶法的改性處理[7-8]。Zhang等[9]綜述了蓮子的營養(yǎng)成分、生理功能及加工，并詳細(xì)介紹了有關(guān)蓮子蛋白的不同研究成果。

目前，有關(guān)蓮子中不同蛋白的研究報道較少，因而深入研究不同蓮子蛋白的氨基酸組成結(jié)構(gòu)以及熱特性有助于了解蓮子蛋白的分子特性，為研究蓮子蛋白多尺度結(jié)構(gòu)與功能特性間的構(gòu)效關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

(1)材料：蓮子，福建閩江源綠田實業(yè)投資發(fā)展有限公司。(2)試劑：NaOH、HCl、無水乙醇，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、考馬斯亮藍(lán)G250/R250等(均為分析純)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

SQP型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；FE 28 pH計：梅特勒-托多利儀器(上海)有限公司；L8900全自動氨基酸分析儀，日立高新技術(shù)公司；K-AlphaX射線光電子能譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；DSC 214差示掃描量熱儀，德國耐馳儀器公司；TG 209F3熱重分析儀，德國耐馳儀器公司。

2 方法

2.1 蓮子分離與分級蛋白的制備

2.1.1 蓮子分離蛋白的制備 蓮子→磨粉過篩得蓮子粉→加去離子水→0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至9.0→4 000 r/min離心8 min→收集上清液→0.5 mol/L HCl調(diào)pH至4.9→4 000 r/min離心8 min→收集沉淀→復(fù)溶水洗至中性→真空冷凍干燥→蓮子分離蛋白(LSPI)。

2.1.2 蓮子分級蛋白的制備 參考Sun等[10]的方法并修改。蓮子→磨粉過篩得蓮子粉→加去離子水→4 000 r/min離心10 min→收集上清液(蓮子清蛋白，LSA)、沉淀→加NaCl→4 000 r/min離心10 min→收集上清液(蓮子球蛋白,LSGlo)、沉淀→加70%乙醇→4 000 r/min離心8 min→收集上清液(蓮子醇溶蛋白,LSP)、沉淀→0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至9.0→4 000 r/min離心10 min→收集上清液→0.5 mol/L HCl調(diào)pH至4.9→離心→4 000 r/min離心8 min→復(fù)溶水洗至中性→真空冷凍干燥→蓮子谷蛋白(Lotus Seed Glutein,LSGlu)。

2.2 氨基酸測定

精確稱取50 mg蓮子蛋白樣品于水解管中，加入10 mL HCl，1 g苯酚進(jìn)行酸水解，充氮封管后，密封條件下在110 ℃烘箱中水解24 h。水解完成后取出冷卻，加去離子水定容到50 mL，混合均勻后吸取1 mL到小燒杯中，在烘箱中60 ℃脫酸蒸干處理，加適量超純水溶解，重復(fù)蒸干1～2次后加入樣品稀釋液復(fù)溶，震蕩混勻，0.22 μm濾膜過濾，采用L8900全自動氨基酸分析儀進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸組成的分析[11]。

2.3 X射線光電子能譜測定

采用X射線光電子能譜測試蓮子蛋白樣品，干燥處理，以A1 Ka X(1 486.6 eV)射線源為激發(fā)源，發(fā)射電壓12 kV，電流3 mA，束斑直徑0.5 mm，全掃描通道能量100 eV，窄掃描通道能量20 eV。

2.4 DSC測定

根據(jù)Jing等[12]的方法加以修改，精確稱量1 mg蓮子蛋白樣品置于DSC鋁盤中，空鋁盒作為對照。N2保護(hù)，N2流速40 mL/min[13-14]。樣品升溫掃描范圍為30～260 ℃，升溫速率10 ℃/min。

2.5 TG熱重測定

準(zhǔn)確稱取10 mg蓮子蛋白樣品，升溫區(qū)間：30～600 ℃[15-16]，升溫速率：10 ℃/min，N2保護(hù)并控制流速：50 mL/min，記錄水分含量、熱分解速率峰值溫度、質(zhì)量變化過程[17]。

2.6 數(shù)據(jù)處理

各組試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，P<0.05被認(rèn)為數(shù)據(jù)之間具有顯著差異；研究結(jié)果采用Origin 8.5作圖，光譜圖采用自帶軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 氨基酸分析

氨基酸的組成與比例決定了蛋白的營養(yǎng)質(zhì)量。表1顯示，必需氨基酸含量占氨基酸總量的(E/T)37.22%～42.87%，亮氨酸含量占比最高(15.11%～25.39%)，且大多為疏水氨基酸；非必需氨基酸與必需氨基酸之比(E/N)為59.29%～75.04%，含量占氨基酸總量的(N/T)57.13%～62.79%，谷氨酸含量占比最高18.42%～25.91%；支鏈氨基酸含量占氨基酸總量的(B/T)18.83%～19.91%。

表1 蓮子蛋白必需氨基酸、非必需氨基酸組成(g/100 g蛋白質(zhì))

蓮子蛋白的E/T、E/N比值與FAO/WHO提出的必需氨基酸占總氨基酸的比值為40%、必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為60%以上的參考蛋白模式相符且部分含量高于參考比值[18]，說明蓮子蛋白氨基酸組成與含量均衡，具有在食品加工中綜合利用的潛能。由表2與圖1可知，非極性氨基酸含量占比35.24%～38.61%；不帶電荷的極性氨基酸含量占比19.35%～25.13%；疏水性氨基酸及芳香族氨基酸含量占比33.45%～36.16%。通過以上數(shù)據(jù)表明，在蓮子各蛋白中，谷氨酸的含量均占比最高，表明含有較多帶負(fù)電荷的非極性氨基酸基團(tuán)。此外，谷蛋白、醇溶蛋白中所占疏水性氨基酸較多，而清蛋白、球蛋白、分離蛋白中所占親水性氨基酸較多，這種組成差異與蓮子蛋白的溶解度等理化功能特性密不可分。

表2 蓮子蛋白極性與非極性氨基酸組成形式(g/100 g蛋白質(zhì))

圖1 氨基酸組成與分類(g/100 g蛋白質(zhì))

3.2 X射線光電子能譜

X射線光電子能譜分析(XPS)用于固體表面成分分析，包括表面的化學(xué)元素組成、原子價態(tài)及表面能態(tài)分布等。如圖2所示，廣譜顯示出非常高強(qiáng)度的C1S、O1S元素信號，而N1S、S2P信號相對較弱。但較為明顯的是，蓮子分離蛋白與分級蛋白中均含有C、N、O、S這4種元素，沒有新共價鍵的產(chǎn)生，即C、N、O、S元素的價態(tài)、峰值變化只有略微漂移。在各種信號中，清蛋白在含量上與其他蛋白有較大差異，這可能與清蛋白的所含極性氨基酸的組成結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。C1S光電子能譜中主峰位置出現(xiàn)在284.5 eV附近(即C-C鍵合)，這個主峰由典型的碳原子所發(fā)出的光電子產(chǎn)生[23-24]。清蛋白與谷蛋白的O/C值與其他蛋白相比，有不同程度的增加，這是由于其中含有氧自由基、-OH基團(tuán)等含氧高能粒子基團(tuán)，在分子鏈中有-OH、C-O、-COOH、C=O等含氧官能團(tuán)，使氧元素增加，提高了O/C值[24]。在399 eV附近的為N峰，除谷蛋白的峰值較強(qiáng)外，其余蛋白均不十分明顯。結(jié)合能在163 eV附近位置是-SH的出峰位置，在S元素的分峰圖譜中，球蛋白的峰值強(qiáng)度最大，而其他蛋白的峰值相對較弱，表明其他蛋白中-S-S-相對更多，降低了-SH含量[25]。

圖2 不同蓮子蛋白XPS(LSPI為蓮子分離蛋白、LSA為蓮子清蛋白、LSGlo為蓮子球蛋白、LSP為蓮子醇溶蛋白、LSGlu為蓮子谷蛋白)

3.3 DSC分析

差示掃描量熱分析(DSC)是反映物質(zhì)發(fā)生物理或化學(xué)變化時吸收或釋放熱量的多少，是分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的一種有效方法[26]。T0為起始變性溫度、Td為最大變性溫度，Td越高則熱穩(wěn)定性越高。熱轉(zhuǎn)變半峰寬值(T1/2)可判斷蛋白質(zhì)變性協(xié)同，若蛋白質(zhì)變性在較窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，說明蛋白質(zhì)變性具有較好的協(xié)同性[26]。變性焓值(ΔH)使蛋白質(zhì)變性所需要的熱量，與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有序程度有關(guān)，破壞氫鍵產(chǎn)生吸熱焓，蛋白質(zhì)聚集或疏水反應(yīng)產(chǎn)生放熱焓。由圖3可以看出，在90 ℃附近的峰值變化說明了蛋白質(zhì)開始逐漸向變性轉(zhuǎn)變，內(nèi)部的有序結(jié)構(gòu)也開始向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。

圖3 不同蓮子蛋白DSC(LSPI為蓮子分離蛋白、LSA為蓮子清蛋白、LSGlo為蓮子球蛋白、LSP為蓮子醇溶蛋白、LSGlu為蓮子谷蛋白)

分離蛋白的T0為70.10 ℃，均比分級蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白)高，其次為醇溶蛋白(60.90 ℃)與谷蛋白(55.57 ℃)。分離蛋白初始變性溫度較高，可能是因為分離蛋白中含有多種蛋白以及雜蛋白，導(dǎo)致不同蛋白分子間，以及蛋白分子內(nèi)部相互作用。而醇溶蛋白、谷蛋白的疏水性氨基酸相對較多，且在蛋白質(zhì)內(nèi)部不易暴露出來，因而使蛋白質(zhì)具有保持三級結(jié)構(gòu)的能力。Td值的變化趨勢與T0相同，最高為分離蛋白的101.42 ℃，表明蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密。張羽[27]認(rèn)為，由于分離蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白中-S-S-含量較高，打破-S-S-解旋蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)所需的能量更多，因而熱變性溫度相對越高。協(xié)同性最好的是球蛋白，T1/2只有22.12 ℃，這可能是因為球蛋白親水與疏水的雙面性更好，與極性分子接觸時，可展現(xiàn)出更好的分子柔性和協(xié)同性。表3中數(shù)據(jù)說明，分離蛋白ΔH為1.41 J/g，分級蛋白ΔH大小依次為谷蛋白>醇溶蛋白>清蛋白>球蛋白，球蛋白的ΔH值僅是分離蛋白的0.11倍。有相關(guān)研究表明，ΔH值的增加反映了蛋白質(zhì)在升溫過程中的綜合吸熱效應(yīng)，例如氫鍵的斷裂等，其值的高低與蛋白質(zhì)內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)的有序排列有關(guān)[28]。因而可以說明，谷蛋白的空間結(jié)構(gòu)有序性高于分離蛋白，比清蛋白、球蛋白的空間結(jié)構(gòu)更加有序和穩(wěn)定[29]。但這與蔡聯(lián)輝等[30]之前的研究并非相同，其認(rèn)為清蛋白、球蛋白的穩(wěn)定性要高于醇溶蛋白、谷蛋白，這可能是因為蓮子的不同分類，其分子結(jié)構(gòu)與功能特性的不同。蛋白在生產(chǎn)應(yīng)用過程中，受熱是最為常見的加工方式之一，而蛋白質(zhì)在受熱后分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生伸展、聚集等狀態(tài)，由此其功能特性也會受到相應(yīng)的影響[31]。受熱過程可以破壞氫鍵、疏水、靜電以及二硫鍵等相互作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)發(fā)生變化[32]。

表3 蓮子分離蛋白與蓮子分級蛋白的DSC分析

3.4 TG熱結(jié)構(gòu)性分析

熱重分析儀TGA能夠測量物質(zhì)的質(zhì)量隨溫度(或時間)的變化關(guān)系。10 ℃/min升溫速度后樣品發(fā)生吸熱和放熱改變，氨基酸殘基被降解，進(jìn)一步降低了其熱分解穩(wěn)定性。蓮子蛋白從30～600 ℃的熱分解速率曲線主要分為兩個階段[33]，其熱分解TG、DTG曲線見圖4[34-35]。

圖4 不同蓮子蛋白TGA(LSPI為蓮子分離蛋白、LSA為蓮子清蛋白、LSGlo為蓮子球蛋白、LSP為蓮子醇溶蛋白、LSGlu為蓮子谷蛋白)

第一階段30～150 ℃，初始階段重量有5%～7%的輕微損失，主要為結(jié)合水的揮發(fā)和損失[16,34]，溫度升高引起小分子蛋白(氨基酸殘基肽鍵之間共價鍵的斷裂)的分解并導(dǎo)致蓮子蛋白重量損失[18,33]，降低了蛋白質(zhì)與水的結(jié)合能力[35]；第二階段150～540 ℃，蓮子蛋白骨架結(jié)構(gòu)(S-S、O-N、O-O鍵斷裂[18,34])被分解，釋放出各種氣體，如CO2、CO、NH3等[36]，表明分子內(nèi)-S-S-斷裂，與分離蛋白與清蛋白相比(損失在63%左右)，醇溶蛋白與谷蛋白在此階段重量損失更大(損失在73%左右)，這可能是因為化學(xué)反應(yīng)過程中功能性基團(tuán)改變，蛋白質(zhì)分子逐步完全被分解，醇溶蛋白與谷蛋白在此階段的峰值也比分離蛋白與清蛋白高，說明分離蛋白與清蛋白的分子柔性相比醇溶蛋白與谷蛋白更高，而醇溶蛋白與谷蛋白分子“剛性”更強(qiáng)。由于蛋白類制品在應(yīng)用時常需要高溫處理，利用熱重分析研究蓮子蛋白的熱穩(wěn)定性，可為蓮子蛋白在實際生產(chǎn)加工提供科學(xué)依據(jù)[35]。

4 結(jié)論

本試驗制備了蓮子中不同蛋白，并對各種蛋白的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，蓮子蛋白富含18種氨基酸，是優(yōu)質(zhì)性植物蛋白資源，清蛋白、球蛋白親水性較強(qiáng)，而醇溶蛋白、谷蛋白疏水性較強(qiáng)(含有相對更多的疏水性氨基酸)。熱穩(wěn)定性分析表明，分級蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白)的熱變性起始與終止溫度均較低，其中清蛋白、球蛋白低于醇溶蛋白、谷蛋白。TG與DTG數(shù)據(jù)中，清蛋白、球蛋白的第二階段質(zhì)量變化也低于醇溶蛋白、谷蛋白，說明醇溶蛋白、谷蛋白分子內(nèi)二硫鍵斷裂，更多功能性基團(tuán)發(fā)生變化，因而質(zhì)量損失更多。同理，分離蛋白的熱變性起始與終止溫度均最高，表明分離蛋白耐受熱穩(wěn)定性更強(qiáng)。對蓮子中不同蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，有利于挖掘蓮子蛋白的功能特性，為深入研究蓮子蛋白結(jié)構(gòu)提供科學(xué)依據(jù)。