陳瑜，王偉，焦迎春，蔣濤*

（1.青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021）

青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.）為禾木科大麥屬植物，抗逆性強，適宜在寒冷的高海拔地區(qū)生長，在青藏高原上的種植歷史已有3 500年[1]，是我國青海地區(qū)重要的糧食作物[2]。青稞中富含粗纖維、蛋白質、維生素等營養(yǎng)物質，且脂肪、總糖含量低，是適合糖尿病患者食用的主食之一[3]。除此之外，青稞中還含有大量黃酮、多酚、β-葡聚糖、γ-氨基丁酸等生物活性成分[4-5]，使其營養(yǎng)價值更加豐富，是功能食品開發(fā)的良好原料，在功能性食品領域具有廣闊的應用前景。青稞中的β-葡聚糖含量遠高于燕麥、小麥等其他谷物作物[5-6]，主要存在于籽粒胚乳細胞壁與糊粉層中，具有調節(jié)血脂、血糖、腸胃健康、提高免疫力、抗氧化應激損傷等功能[7-10]，目前已開發(fā)出不同形式的功能食品，如β-葡聚糖膠囊、粉劑以及咀嚼片等[11]。

β-葡聚糖主要提取方法有水提法[12]、堿提法[13]、亞臨界萃取法[14]以及超聲波輔助提取法[15]等，但這些方法耗時較長，且獲得的β-葡聚糖純度低，后續(xù)仍需純化處理，導致提取β-葡聚糖的工序繁瑣，生產(chǎn)成本較高[16-17]。微生物發(fā)酵法是近些年新興的β-葡聚糖提取方法[18]，該法較傳統(tǒng)水提等方法具有成本低、富集量高、發(fā)酵條件要求低的優(yōu)點[19]。張玉良[20]運用黑曲霉菌株發(fā)酵富集燕麥麩中β-葡聚糖，結果顯示純度可達52.53%，且溫度對其含量影響顯著，而pH值對β-葡聚糖的含量影響不顯著。劉新琦等[18]通過酵母菌發(fā)酵法提取的青稞β-葡聚糖得率為5.21%，比傳統(tǒng)的水提法得率提高了60.80%。微生物生長過程中以還原糖、蛋白質等其他物質作為營養(yǎng)物進行生長，同時利用復雜的酶系統(tǒng)分解碳水化合物，而不消耗青稞中β-葡聚糖[21-22]，從而可以達到提高β-葡聚糖得率及去雜純化的效果。此外部分微生物在生長過程中會產(chǎn)生一些含有β-葡聚糖的黏液[23]，所以利用發(fā)酵法提取青稞中的β-葡聚糖可以使植物以及微生物中的β-葡聚糖得到更好的應用。

目前，通過微生物富集β-葡聚糖的工藝多采用單一菌種發(fā)酵，復合菌種發(fā)酵法富集β-葡聚糖的研究較少。本試驗以高活性干酵母、釀酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌6種菌種對青稞進行單菌發(fā)酵以及復合菌發(fā)酵，通過分析對比以及響應面試驗篩選出最優(yōu)復合發(fā)酵劑和最優(yōu)發(fā)酵工藝，并對發(fā)酵富集得到的β-葡聚糖抗氧化活性進行了測定，以期為微生物發(fā)酵法富集β-葡聚糖、生產(chǎn)富含β-葡聚糖的青稞功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶皮黑青稞：青海鑫寧生物科技有限公司；高活性干酵母、釀酒干酵母、葡萄酒酵母[屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）類的不同類產(chǎn)品]：安琪酵母有限公司；植物乳桿菌LK-1（Lactiplantibacillus plantarum LK-1）：青海大學農(nóng)牧學院微生物實驗室保藏；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）：鄭州百益寶生物技術有限公司；β-葡聚糖標準品（純度≥95%）：美國 Sigma公司；維生素 C（＞99.0%）：河北源創(chuàng)生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽 [2，2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（均為分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司；苯酚、無水乙醇、硼酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、重蒸試劑、次氯酸鈉、剛果紅、二甲基亞砜、硫酸鉀（均為分析純）：上海長青化工有限公司。

1.2 儀器與設備

鼓風干燥箱（101-3AB）：上海川宏實驗儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-B）；艾爾斯儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；紫外可見分光光度計（UV-6600）：上海科那美科學儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（YM50）：上海沙鷹科學儀器有限公司；臺式高速離心機（GL-168）：德國Eppendorf公司；超凈工作臺（ZHJH-C1112B）：上海智城分析儀器制造有限公司；多功能粉碎機（HY-400）：北京恒奧德儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵法富集青稞中的β-葡聚糖

準確稱取4.5 g青稞粉于150 mL錐形瓶中，加入54 mL蒸餾水，即料液比為1∶12（g/mL），高壓蒸汽滅菌鍋105℃滅菌20 min。取出冷卻后，在超凈工作臺中加入青稞粉質量5%（質量分數(shù)）的菌粉，于恒溫發(fā)酵箱中34℃發(fā)酵26 h。調發(fā)酵液pH值為6.0，按4 U/g加入耐高溫α-淀粉酶，水浴溫度90℃～95℃進行酶解去淀粉30min，碘液檢測不含淀粉為止，冷卻至室溫。將除去淀粉的發(fā)酵液放入離心機，設置轉速5 000 r/min離心15 min。收集上清液，加入3倍體積95%乙醇，醇沉3 h。收集沉淀真空冷凍干燥，得到青稞β-葡聚糖粗品。

1.3.2 熱水浸提法提取青稞β-葡聚糖

參考李楠等[24]關于水提裸燕麥β-葡聚糖條件的優(yōu)化方法并加以改進。具體工藝：準確稱取4.5 g青稞粉于150 mL錐形瓶中，加入54 mL蒸餾水，即料液比為 1∶12（g/mL），在 52℃下提取 3 h。取出冷卻后，調節(jié)發(fā)酵液pH值為6.0，按4 U/g加入耐高溫α-淀粉酶，水浴溫度90℃～95℃進行酶解去淀粉30 min，碘液檢測不含淀粉為止，冷卻至室溫后，同1.3.1中的試驗方法，得到青稞β-葡聚糖粗品。

1.3.3 青稞β-葡聚糖得率的測定

采用剛果紅標準曲線法得到β-葡聚糖標準曲線方程：y=6.664x+0.022 2，R2=0.998 7。測定青稞提取物中β-葡聚糖含量，按下述公式計算青稞β-葡聚糖得率[25]。

式中：M1為提取的青稞β-葡聚糖質量，g；M為干燥的青稞原料質量，g。

1.3.4 青稞β-葡聚糖發(fā)酵富集的條件優(yōu)化

1.3.4.1 菌種篩選及復配條件確定

固定基本條件為接種量5%（菌種/黑青稞粉，g/100 g），料液比 1∶12（g/mL），發(fā)酵時間 26 h，發(fā)酵溫度34℃。研究不同菌種（高活性干酵母、釀酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）、不同復配比（高活性干酵母∶釀酒干酵母∶嗜熱鏈球菌）1∶1∶1、2∶1∶1、3∶1∶1（質量比）對青稞麩皮 β-葡聚糖得率的影響。

1.3.4.2 單因素試驗

以黑青稞為發(fā)酵底物，固定料液比1∶12（g/mL）、接種量5%、發(fā)酵時間26 h，發(fā)酵溫度34℃。分別考察接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、發(fā)酵時間（22、24、26、28 h）和發(fā)酵溫度（30、32、34、36℃）對發(fā)酵富集青稞 β-葡聚糖的影響，根據(jù)單因素試驗結果和實際情況，選出對β-葡聚糖得率影響顯著的因素進行響應面試驗。

1.3.4.3 響應面優(yōu)化試驗

參考程洋洋等[25]的方法，根據(jù)單因素試驗結果，對發(fā)酵影響較顯著的3個因子發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）設計三因素三水平的Box-Behnken中心復合試驗，測定各組β-葡聚糖得率并作為響應值，共設計17組試驗，試驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.5 體外抗氧化活性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

參考DPPH自由基清除法[26-27]，用95%乙醇配制0.1 mmol/L DPPH溶液，取2 mL不同濃度待測樣品加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，避光反應30 min后5 000 r/min離心5 min，取上清液在517 nm處測定吸光值，以蒸餾水代替上述操作中的樣品溶液為空白組調零。以VC做陽性對照，重復3次取平均值，并按下列公式計算DPPH自由基清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為無水乙醇代替DPPH反應液所得吸光值。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除率的測定

參考ABTS+自由基清除法[27-28]，以蒸餾水為溶劑配制7 mmol/L ABTS溶液與2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液后分別定容至10 mL，在燒杯中混合，避光保存12 h后即為ABTS儲備液，然后用無水乙醇將其稀釋成734 nm下OD值為（0.70±0.02），即得ABTS工作液。將1 mL樣品-無水乙醇稀釋液與2 mL ABTS工作液在5 mL離心管中混勻，避光反應10 min，于734 nm處測定吸光值A1，無水乙醇代替樣品測得吸光值A0，無水乙醇代替ABTS工作液測得吸光值A2，用無水乙醇調零，以VC為陽性對照，平行操作重復3次，ABTS+自由基清除率按下式計算。

ABTS+自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗均重復3次，采用Origin 8作圖，單因素試驗均采用SPSS Statistics 23進行數(shù)據(jù)分析，采用One-Way ANOVA進行單因素方差分析，采用Duncans'法進行多重比較檢驗，采用Design-Expert 13軟件進行響應面試驗設計及數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結果與討論

2.1 富集菌種及復配條件對青稞β-葡聚糖得率的影響

2.1.1 富集菌種對青稞β-葡聚糖得率的影響

選擇6種常用的菌種作為富集β-葡聚糖的菌種，分別為高活性干酵母、釀酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳桿菌LK-1、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，添加量均為青稞粉質量的5%，不同菌種對β-葡聚糖得率的影響如圖1所示。

圖1 不同菌種對青稞β-葡聚糖得率的影響Fig.1 Yield of β-glucan from highland barley fermented with different strains

由圖1可知，微生物發(fā)酵法提取青稞中β-葡聚糖效果均顯著高于熱水浸提法。這可能是因為發(fā)酵過程中，微生物豐富的酶系統(tǒng)使青稞中的大分子物質被更好的利用分解，從而溶解出較多的β-葡聚糖，提高β-葡聚糖的提取效率。其中，高活性干酵母發(fā)酵提取的β-葡聚糖得率最高，這可能是因為糊化后的青稞發(fā)酵液中充足的碳源使酵母菌的活性較高，從而解離出較多的β-葡聚糖。釀酒干酵母與嗜熱鏈球菌發(fā)酵富集的β-葡聚糖得率較熱水浸提法分別提高了55%和56%，差異顯著（P＜0.05）。因此，根據(jù)發(fā)酵液中β-葡聚糖得率篩選出高活性干酵母、釀酒干酵母、嗜熱鏈球菌進行下一步試驗。

2.1.2 復配條件對青稞β-葡聚糖得率的影響

不同復配比對青稞β-葡聚糖得率的影響結果見圖2。

由圖2可知，隨著高活性干酵母∶釀酒干酵母∶嗜熱鏈球菌復配比的增大，發(fā)酵液中的β-葡聚糖得率呈先增加后減少的趨勢。當高活性干酵母釀酒干酵母、嗜熱鏈球菌復配比為2∶1∶1時β-葡聚糖得率最高為（31.14±0.07）%，與其他提取條件相比差異顯著（P＜0.05），說明在此復配比下的青稞發(fā)酵液中微生物的比例較為平衡，彼此之間不存在相互競爭，但隨著復配比的增加，發(fā)酵液中微生物的數(shù)量過多，而發(fā)酵液已經(jīng)不能夠為微生物提供充足的營養(yǎng)成分，彼此之間出現(xiàn)了相互競爭，所以導致β-葡聚糖得率減少。因此選擇2∶1∶1為最佳復配比富集β-葡聚糖。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 接種量對青稞β-葡聚糖得率的影響

不同接種量對青稞β-葡聚糖得率的影響結果見圖3。

圖3 接種量對青稞β-葡聚糖得率的影響Fig.3 Effect of inoculum on yield of β-glucan from highland barley

由圖3可知，隨著接種量的增加，β-葡聚糖的得率先增加后趨于穩(wěn)定，接種量太少時β-葡聚糖無法充分釋放，接種量增大后得率也隨著增大；當接種量為5%時，β-葡聚糖得率為25.64%，與接種量為6%、7%結果無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于接種量3%、4%（P＜0.05），說明過大的接種量增加了釀酒干酵母、嗜熱鏈球菌、高活性干酵母菌的消耗，對富集β-葡聚糖無效果，因此選取接種量5%。

2.2.2 發(fā)酵時間對青稞β-葡聚糖得率的影響

不同發(fā)酵時間對青稞β-葡聚糖得率的影響結果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對青稞β-葡聚糖得率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on yield of β-glucan from highland barley

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，β-葡聚糖得率逐漸增加，在26 h時達到最高值，之后逐漸下降。發(fā)酵26 h與發(fā)酵22 h時的β-葡聚糖得率相比，提高了26.19%，差異顯著（P＜0.05），可能是因為前 24 h菌種開始利用自身的酶系統(tǒng)發(fā)酵分解纖維素，到26 h時反應完全，因此最佳發(fā)酵時間為26 h。

2.2.3 發(fā)酵溫度對青稞β-葡聚糖得率的影響

不同發(fā)酵溫度對青稞β-葡聚糖得率的影響結果見圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對青稞β-葡聚糖得率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on yield of β-glucan from highland barley

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度升高，青稞β-葡聚糖的得率逐漸增加，在34℃達到峰值之后下降，與30℃條件下的β-葡聚糖得率相比較，34℃時提高70.20%，差異顯著（P＜0.05）。這可能是由于溫度升高，分子熱運動加快，導致單位時間內(nèi)β-葡聚糖的溶出率升高。因此確定最佳發(fā)酵溫度為34℃。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性分析

從上述單因素試驗結果可知，發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）對富集β-葡聚糖效果顯著，以接種量5%、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時間26 h為中心點，β-葡聚糖得率為響應值進行響應面優(yōu)化，響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface test

使用軟件JMP11對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到二次多項響應面回歸模型：Y=42.42-0.0625A+2.49B+1.78C+0.35AB+1.83AC+0.1750BC-8.46A2-11.41B2-9.53C2。

對響應面試驗得到的結果進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。

表3 方差分析及顯著性檢驗Table 3 ANOVA and significance test

分析表3可知，響應面回歸模型的F值為93.72，達到極顯著水平（P＜0.000 1），表明該模型顯著；由F值大小得知，各因素對β-葡聚糖得率的影響大小順序為接種量（B）＞發(fā)酵時間（C）＞發(fā)酵溫度（A），其中接種量（B）和發(fā)酵時間（C）為極顯著因素；交互項中AC為顯著因素（P＜0.05），二次項中 A2、B2、C2為極顯著因素（P＜0.01），說明以上顯著因素和極顯著因素與β-葡聚糖得率之間存在明顯的數(shù)學關系；失擬項不顯著（P=0.163 9＞0.05），相關系數(shù)R2=0.991 8，校正系數(shù)R2adj=0.981 2，表明該模型擬合效果良好，98.12%的β-葡聚糖得率變化值可通過該模型解釋，能較好地反映試驗中3個影響因素與響應值的變化情況；變異系數(shù)為4.61%＜15.00%，信噪比為24.78%＞4%，表明該模型試驗誤差小、可靠性高。

2.3.2 響應面交互作用分析

為探究雙因素交互作用對β-葡聚糖得率的影響，利用Design-Expert 13軟件對試驗數(shù)據(jù)進行交互作用分析。先固定3個因素中的1個因素在零水平，再分析另外兩個因素的交互作用，若響應曲面坡度越陡峭，說明因素影響越大，反之影響越小。

當發(fā)酵時間固定時，發(fā)酵溫度和接種量相互作用見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度與接種量的交互作用Fig.6 Interaction between fermentation temperature and inoculum

由圖6可知，發(fā)酵時間固定時，發(fā)酵溫度和接種量相互作用獲得的響應面圖較為平緩，說明發(fā)酵溫度與接種量間的相互作用變化對β-葡聚糖得率的影響不顯著，并且該結果與方差分析結果一致。

當接種量固定時，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度相互作用見圖7。

圖7 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間的交互作用Fig.7 Interaction between fermentation temperature and fermentation time

由圖7可知，在接種量一定時，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度相互作用獲得的響應面圖較為陡峭，說明發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度的相互作用變化對β-葡聚糖得率的影響顯著，并且該結果與方差分析結果一致。

當發(fā)酵溫度固定時，發(fā)酵時間和接種量相互作用見圖8。

圖8 接種量與發(fā)酵時間的交互作用Fig.8 Interaction between inoculum and fermentation time

由圖8可知，在發(fā)酵溫度一定時，發(fā)酵時間與接種量之間的相互作用獲得的響應面圖較為平緩，說明發(fā)酵時間與接種量間的相互作用變化對β-葡聚糖得率的影響不顯著，并且該結果與方差分析結果一致。

2.4 驗證試驗

將4.5 g的青稞按照料液比1∶12（g/mL）制成青稞液，采用復配比為高活性干酵母∶釀酒干酵母∶嗜熱鏈球菌 2∶1∶1（質量比）的復合菌種為發(fā)酵劑，以青稞 β-葡聚糖得率為指標，經(jīng)過Design-Expert 13軟件優(yōu)化處理后，得到最佳發(fā)酵工藝：接種量5%、發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時間26 h，在此條件下β-葡聚糖得率為（42.80±0.17）%，試驗值與預測值（42.43%）相近，說明建立的模型可靠。

2.5 青稞β-葡聚糖體外抗氧化活性分析

2.5.1 青稞β-葡聚糖對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是以氮原子為中心的自由基，能在短時間內(nèi)測定物質的抗氧化能力[29]。以VC為對照，不同濃度青稞β-葡聚糖和VC的DPPH自由基清除率如圖9所示。

圖9 青稞β-葡聚糖對DPPH自由基的清除能力Fig.9 DPPH-scavenging ability of β-glucan from highland barley

由圖9可知，青稞β-葡聚糖和VC對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，且VC的清除作用大于β-葡聚糖的清除作用，當濃度達到1.0 mg/mL時，VC和青稞β-葡聚糖對DPPH自由基的清除率分別為（93.79±0.12）%、（58.62±0.10）%，VC的 DPPH 自由基清除率是青稞β-葡聚糖的1.6倍。由此說明，經(jīng)發(fā)酵富集的青稞β-葡聚糖具有一定的DPPH自由基清除能力。

2.5.2 青稞β-葡聚糖對ABTS＋自由基的清除作用

不同濃度青稞β-葡聚糖和VC的ABTS＋自由基清除率如圖10所示。

圖10 青稞β-葡聚糖對ABTS＋自由基的清除能力Fig.10 ABTS+-scavenging ability of β-glucan from highland barley

由圖10可知，青稞β-葡聚糖和VC對ABTS＋自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，且VC的清除作用一直大于青稞β-葡聚糖的清除作用，當濃度達到1.0mg/mL，VC和青稞β-葡聚糖對ABTS＋自由基的清除率分別（96.59±0.11）%、（68.06±0.07）%。即 VC的 ABTS＋自由基清除率是青稞β-葡聚糖ABTS＋自由基清除率的1.42倍。

3 結論

采用不同微生物發(fā)酵富集青稞β-葡聚糖，對其最佳富集工藝進行研究，以VC為對照，研究青稞β-葡聚糖的抗氧化能力。結果表明，在料液比為1∶12（g/mL）的青稞發(fā)酵液中按照復配質量比為2∶1∶1（高活性干酵母∶釀酒干酵母∶嗜熱鏈球菌）接種青稞質量分數(shù)5%的菌種，于34℃發(fā)酵26h；在此條件下富集的β-葡聚糖得率可達到42.80%，與富集前相比提高了63.01%，差異顯著（P＜0.05）。同時相較于單一發(fā)酵劑，復合發(fā)酵劑在適宜的發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、復配比下更能富集β-葡聚糖，提高β-葡聚糖得率。當濃度達到1.0 mg/mL時，青稞β-葡聚糖的DPPH自由基、ABTS＋自由基清除率分別為（58.62±0.10）%和（68.06±0.07）%。綜上表明，可以通過發(fā)酵法富集青稞中的β-葡聚糖，使青稞β-葡聚糖具備良好的抗氧化能力，有較好的應用前景。