方秋野，張馳松*，狄飛達，劉一靜，李雨遲

(1.成都市農林科學院，成都 613000；2.陜西師范大學，西安 710000)

豆豉是一種傳統發(fā)酵類豆制品,在我國具有悠久的歷史。根據前發(fā)酵時微生物的不同[1],可分為曲霉型豆豉、毛霉型豆豉、細菌型豆豉和根霉型豆豉。其中,毛霉型豆豉作為川渝等西南地區(qū)的特色發(fā)酵食品,顏色呈現黑色,質地油光潤滑,粒粒成型,色澤飽滿,香味濃郁,具有入口即化的良好口感。在擁有獨特風味的同時,其還具有較高的營養(yǎng)價值與特殊的醫(yī)學價值。以成都“太和豆豉”、三臺“潼川豆豉”和永川“永川豆豉”為代表的毛霉型豆豉尤其受到廣大消費者的喜愛。

毛霉型豆豉的發(fā)酵過程是在微生物與酶的作用下,將原料中的有機大分子物質進行分解重組及一系列生物化學反應的過程,最終代謝生成蛋白質、可溶性糖等基本營養(yǎng)物質和大豆多肽[2-3]、大豆異黃酮[4]等生物活性成分。而這些功能性物質能在預防疾病[5]、抗氧化[6-8]、降血壓[9]、降血糖[10]、抗癌[11-12]等生理功能上發(fā)揮至關重要的作用。

然而隨著時代的變遷,現代毛霉型豆豉發(fā)酵生產工藝被不斷地改進,國內外的研究工作也取得了一定的進展。近幾年,相關研究主要包含毛霉型豆豉發(fā)酵工藝與品質風味的關系、發(fā)酵中物質變化及營養(yǎng)功能性之間的關系、發(fā)酵過程與微生物的關系以及發(fā)酵過程變化與安全性等方面。而在毛霉型豆豉發(fā)酵工藝與品質關系的研究中,主要集中在對前發(fā)酵和后發(fā)酵過程中溫度、濕度、時間以及后發(fā)酵食鹽、白酒添加量等條件進行優(yōu)化的研究上,對于光質條件與品質之間關系的研究未見報道。本試驗以不同光質條件下發(fā)酵的毛霉型豆豉為研究對象,通過測定前發(fā)酵過程中水分、氨基酸態(tài)氮、酸性蛋白酶活力等理化指標及三代測序得到的微生物群落結構,對其發(fā)酵品質的影響進行了初步的探究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃豆:產自哈爾濱;總狀毛霉(Mucorracemosus)菌種CICC40241:由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供;馬鈴薯葡萄糖水:青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):北京奧博星生物技術有限責任公司;酚酞(指示劑IND)、無水乙醇、甲醛、鄰苯二甲酸氫鉀、乳酸、乳酸鈉、無水碳酸鈉、鹽酸、三氯乙酸、福林(Folin)試劑、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(均為分析純AR)、干酪素(化學純CP)、L-酪氨酸(生化試劑BR):成都市科隆化學品有限公司;氫氧化鈉(分析純AR):四川西隴科學有限公司。

1.1.2 試驗設備

KW-ZWD03-T8型18 W 防水光照燈 宸華節(jié)能照明有限公司;AUY220型電子天平 日本SHIMADZU公司;XY-110MW型水分含量測定儀 常州市幸運電子設備有限公司;XMTD-204型HH-S數顯恒溫水浴鍋 天津塞多利斯實驗分析儀器制造廠;MS7-H550-Pro型磁力攪拌器 大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司;UV1801型紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司;ZDX-150型智能培養(yǎng)箱 寧波賽福實驗儀器有限公司;YJY-1102C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;PH818型筆式pH 檢測計 香港?，攦x器儀表有限公司;YR-PTB型真空泵 上海亞榮生化儀器廠;電子萬用爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;1580R型高速臺式冷凍離心機 基因有限公司;YA.ZDI-10自控型不銹鋼電熱蒸餾水器 上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

大豆篩選→清洗→浸泡→瀝干→蒸煮(濕蒸)→ 冷卻→接種(菌種擴大培養(yǎng))→前發(fā)酵制曲→前發(fā)酵產品。

1.2.2 待測樣品制備

試驗光質條件的設置見表1。

表1 光質條件編號Table 1 Serial numbers of light quality conditions

在前發(fā)酵過程中，每日定時采集定量的樣品。D1～D5分別代表前發(fā)酵時期每日的毛霉型豆豉樣品，見表2。

表2 試驗樣品編號Table 2 Serial numbers of experimental samples

1.3 指標的測定

1.3.1 水分含量的測定

每種光質條件下的樣品各取3份,將稱量好的樣品直接采用水分含量測定儀進行測定。3個樣品測定的水分含量平均值作為同一光質條件下的水分含量百分比。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮含量的測定

氨基酸態(tài)氮含量的計算參照GB 5009.235—2016[13]的方法。

1.3.3 蛋白酶活力的測定

參照GB/T 23527—2009[14]中的福林法對酶液中的酸性蛋白酶活力進行測定。

1.3.4 真菌群落結構的測定

1.3.4.1 樣品預處理

在無菌環(huán)境中,將一定量的樣品經過磷酸緩沖溶液及無菌水的多次沖洗,獲得微生物懸浮液。將懸浮液于-20 ℃環(huán)境下進行離心處理,獲得外測送檢樣品。

1.3.4.2 樣品測定

將已預處理的樣品液氮速凍,送至武漢生物科技有限公司,采用PacBio進行測序。

2 結果與分析

2.1 不同光質對毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中水分的影響

在毛霉型豆豉生產過程中,前發(fā)酵制曲是一種極具代表性的多酶多菌發(fā)酵過程[15]。水分含量對微生物的生長繁殖、新陳代謝會產生直接影響,并間接影響酶的代謝活力,使毛霉型豆豉在前發(fā)酵過程中產生的營養(yǎng)物質種類及含量發(fā)生變化,從而對豆豉品質造成影響。

圖1 毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中水分含量變化Fig.1 Changes of moisture content during pre-fermentation of Mucor-type fermented soybeans

蒸煮后的大豆初始含水量為64.7%。由圖1可知,在藍光、紅光、白光、避光4種不同光質條件下,毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中,其水分含量都有不同程度的下降。藍光條件下降最多,D5水分含量為39.4%,避光條件下降最少,D5水分含量降低至47.6%。但在不同光質條件下,水分含量變化程度仍然存在一定差異,初步推測是因為光質條件的不同,在前發(fā)酵過程中,造成了水分散失程度以及各類微生物生長代謝活動對水分利用程度的差異。其中,D3～D4的發(fā)酵過程中,水分含量下降趨勢增強,可能是在此進行前發(fā)酵期間,以總狀毛霉為優(yōu)勢發(fā)酵菌的各類微生物相對于其他階段對水分的需求量更高,生長代謝狀態(tài)更加活躍造成的。

2.2 不同光質對毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的影響

在毛霉型豆豉前發(fā)酵期間,原料大豆中的蛋白質、碳水化合物等基本營養(yǎng)物質在各種微生物的作用下,會生成對成品豆豉品質產生巨大影響的風味物質。氨基酸態(tài)氮就是通過蛋白質分解而形成的重要風味物質之一[16],主要表現為鮮味。其含量與豆豉風味呈明顯的正相關關系。同時,氨基酸態(tài)氮含量的高低不僅能夠反映出蛋白質水解程度,還能充分反映出前發(fā)酵過程中微生物和酶對蛋白質分解能力的大小[17]。

圖2 毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen content during pre-fermentation of Mucor-type fermented soybeans

由圖2可知,在藍光、紅光、白光、避光4種不同光質條件下進行前發(fā)酵,原料大豆的氨基酸態(tài)氮含量總體變化規(guī)律基本一致,呈上升趨勢?？沙醪酵茰y主要是由于各種微生物代謝活動中產生的酶種類和數量隨著發(fā)酵時間的增加而不斷積累,且酶活力也隨著時間的增加而逐漸增強,從而形成前發(fā)酵期間氨基酸態(tài)氮含量隨著前發(fā)酵時間的增加呈現出明顯的正相關變化趨勢。其中,不同光質條件下,氨基酸態(tài)氮含量的差異可能主要是因為4種光質條件對各類微生物產生酶的途徑造成了不同程度的影響,從而導致酶的種類、數量以及活躍程度產生差異。另外值得注意的是,氨基酸態(tài)氮含量在D1～D4處于緩慢上升狀態(tài),在D4～D5期間成倍增長,可能是因為在最后的前發(fā)酵階段,以總狀毛霉為主的各類微生物中酶種類和數量積累至最大值,其酶活力增至最高,從而使營養(yǎng)物質得到了充分的作用,使氨基酸態(tài)氮含量得以大量增加。

同時,在避光狀態(tài)下,前發(fā)酵各個階段的氨基酸態(tài)氮含量皆處于最高點,可初步推斷避光的光質條件最有利于毛霉型豆豉中的蛋白質進行水解和積累氨基酸態(tài)氮,且此條件下毛霉型豆豉中所含微生物和酶對蛋白質的分解能力達到最高。

2.3 不同光質對毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活力的影響

豆豉前發(fā)酵制曲階段是微生物進行生理活動、產生并積累以蛋白酶為主的酶系的過程。毛霉型豆豉中的毛霉菌會大量分泌酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶。其中,酸性蛋白酶最多,中性蛋白酶次之,堿性蛋白酶最少[17]。同時,前發(fā)酵期間蛋白酶的種類和酶活力與豆豉的制曲質量呈正相關關系,也以此對毛霉型豆豉的品質產生直接的影響[18-19]。

圖3 毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活力變化Fig.3 Changes of acid protease activity during pre-fermentation of Mucor-type fermented soybeans

由圖3可知,在白光條件下,D2～D5酸性蛋白酶活力增加速率最慢,從10.51,15.38,16.59 U/mL上升至18.46 U/mL。在藍光條件下,D2～D5酸性蛋白酶活力增加速率略高于白光,從11.90,16.74,17.81 U/mL上升至20.08 U/mL。在紅光條件下,D2～D5酸性蛋白酶活力增加速率較快,從13.81,20.04,21.68 U/mL上升至23.87 U/mL。在避光條件下,D2～D5酸性蛋白酶活力達到最高,從15.07,23.81,28.66 U/mL上升至36.78 U/mL。

由此可知,接種后的原料大豆在藍光、紅光、白光、避光4種不同光質條件下進行前發(fā)酵的過程中,酸性蛋白酶活力都呈現出上升趨勢。其中,不同光質條件下酸性蛋白酶活力存在明顯的差異,可初步推測是因為整體前發(fā)酵階段,4種光質條件對酸性蛋白酶系產生了不同程度的影響,從而使酸性蛋白酶活力產生了顯著差異。另外,在避光條件下,酸性蛋白酶活力變化趨勢在整個前發(fā)酵過程中一直處于大幅度上升狀態(tài),而其他3種光質條件下,從D3開始逐漸趨于平緩上升,因此可初步推斷毛霉型豆豉前發(fā)酵制曲階段在避光條件下最有利于酸性蛋白酶系的積累以及其活性的增加;并且可以此來提高制曲的質量,對毛霉型豆豉的前發(fā)酵品質產生最有益的影響。

2.4 不同光質條件下毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中微生物群落結構

在發(fā)酵類食品中,微生物種類與數量對其最終品質會造成巨大影響。毛霉型豆豉采取的前發(fā)酵方法為以總狀毛霉為主要發(fā)酵菌種，該期間配合多種菌系,在開放式制曲的條件下進行[20]。豆豉中的毛霉菌作為優(yōu)勢菌,在整個前發(fā)酵制曲過程中,會優(yōu)先產生各種酶類，對原料大豆中的基本營養(yǎng)物質進行分解代謝。該過程不僅為產品提供了風味物質、活性營養(yǎng)成分,同時也為其他菌類的生長繁殖創(chuàng)造了良好的環(huán)境和物質基礎[21],從而進一步促進了毛霉型豆豉前發(fā)酵制曲階段的微生物多樣化[22]。

在藍光、紅光、白光及避光4種不同的光質條件下,毛霉型豆豉前發(fā)酵結束后,微生物中真菌在種水平上的相對豐度見圖4。

圖4 不同光質條件下毛霉型豆豉前發(fā)酵結束后真菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of fungi after pre-fermentation of Mucor-type fermented soybeans under different light quality conditions注：M0、M1、M2、M3分別為避光、紅光、藍光、白光條件；-1，-2，-3代表3次平行試驗。

由圖4可知,在不同光質條件下,前發(fā)酵結束后的毛霉型豆豉中的真菌種類隨著制曲時間的增加而逐漸豐富。其中,毛霉型豆豉微生物中的真菌以毛霉屬、曲霉屬和青霉屬等為主。同時,總狀毛霉菌屬作為明顯的絕對優(yōu)勢菌屬存在。該分析結論與索化夷等、李薇等[22]的相關研究基本一致。

另外,在紅光條件下,前發(fā)酵結束后的豆豉中共有178種真菌;藍光條件下共有104種真菌;白光條件下共有114種真菌;避光條件下共有118種真菌。通過數據可知,各光質條件下真菌物種總數量存在較大差異,可進行初步推測,不同光質條件會對毛霉型豆豉前發(fā)酵階段各種真菌的生長繁殖造成不同程度的影響,并以此影響豆豉的品質。

3 結論

在毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中,藍光、紅光、白光、避光4種不同光質條件對所檢測的理化指標都產生了相應的影響。整個前發(fā)酵過程中,水分、氨基酸態(tài)氮、酸性蛋白酶活力在4種不同光質條件下的變化趨勢相似。水分含量都呈現逐漸降低趨勢,氨基酸態(tài)氮和酸性蛋白酶活力都呈現上升趨勢。其中,避光條件下的氨基酸態(tài)氮含量和酸性蛋白酶活力達到最高,紅光條件下氨基酸態(tài)氮含量和酸性蛋白酶活力都略微高于藍光,而白光條件下氨基酸態(tài)氮含量和酸性蛋白酶活力最低。以此初步探究認為,避光條件下毛霉型豆豉前發(fā)酵的品質最佳。

另外,通過微生物三代測序法對毛霉型豆豉前發(fā)酵階段微生物中的真菌群落結構進行檢測,所得到的檢測結果可初步探究認為，不同光質條件可對毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中微生物的真菌群落結構產生不同程度的影響,從而進一步使前發(fā)酵結束后的產品品質出現差異。