何敏，苗僑偉，劉偉，劉軍海

(1.陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué)陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000)

紅甜菜是藜科甜菜屬的變種[1]，也稱火焰菜、紫菜頭[2-3]。紅甜菜富含糖類、維生素等，內(nèi)含多種微量元素和大量甜菜苷，營養(yǎng)成分豐富，醫(yī)用價(jià)值高，是世衛(wèi)組織確定的最佳蔬菜之一[4]。甜菜紅素[5-6]是一種水溶性天然色素[7-8]，色澤鮮艷、著色性好，在甜菜色素中含量高達(dá)90%。甜菜紅素具有較好的抗氧化能力，可作為保健品、藥品和食品添加劑。目前甜菜紅素的提取工藝收率較低，對(duì)其穩(wěn)定性的研究較少[9-11]，因此，對(duì)甜菜紅素提取優(yōu)化和穩(wěn)定性的研究很有必要[12-13]。常用的提取方法有超聲輔助提取法、溶劑提取法、微波輔助提取法等，超聲輔助提取技術(shù)具有提取效率高、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)勢，在提取生物活性物質(zhì)方面應(yīng)用廣泛[14-15]。本研究以紅甜菜為原料，采用超聲輔助提取甜菜紅素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步探究甜菜紅素的穩(wěn)定性，為提取甜菜紅素及其在食品添加劑中的應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

新鮮甜菜：市售；無水乙醇、乙醚、鹽酸、丙酮、氫氧化鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鈣、硫酸銅、硫酸鉛：均為分析純。

BSA224S-CW型分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；BCD-218ZM2D型冰箱 合肥美菱股份有限公司；H1850型低速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；DF-101S型恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；MT-5000型pH計(jì) 上海亞榮生化儀器廠；GW1030型超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；WGLL-230BE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；Cary 50型紫外分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 甜菜紅素的提取及測定

1.2.1 原料預(yù)處理

將新鮮紅甜菜洗凈，放入干燥箱中除去表面水分，將干燥好的甜菜切絲備用。

1.2.2 甜菜紅素的提取及測定

稱取1.0 g 甜菜絲，加入50 mL的蒸餾水進(jìn)行浸泡，用保鮮膜密封后，設(shè)置超聲波清洗機(jī)溫度為40 ℃，提取40 min后，將提取液放入離心機(jī)中以3 000 r/min 離心10 min，抽濾得到甜菜紅素提取液。

取25 mL甜菜紅素提取液稀釋于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線并充分搖勻，將所得溶液在200～800 nm波長處掃描，確定最大吸收波長。

1.2.3 甜菜紅素提取的單因素試驗(yàn)

在1.2.2提取試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別改變料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察各因素對(duì)甜菜紅素提取的影響。參數(shù)考察范圍分別為料液比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 (g/mL)；提取溫度20，30，40，50，60 ℃；提取時(shí)間20，30，40，50，60 min；提取pH 2，3，4，5，6，每組平行提取3次。

1.2.4 甜菜紅素提取的正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取料液比、提取時(shí)間、pH、提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化甜菜紅素的提取條件，以甜菜紅素最大吸收波長535 nm處的吸光度為指標(biāo)，優(yōu)化甜菜紅素提取條件。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Design of factors and levels of orthogonal test

1.3 甜菜紅素的穩(wěn)定性研究

以單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)所得最優(yōu)提取條件提取甜菜紅素，取5 mL提取液加入50 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，取稀釋液5 mL置于5個(gè)25 mL的具塞刻度試管中，待用。

分別考察溫度、光照、金屬離子、防腐劑對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響。參數(shù)考察范圍分別為溫度20，40，60，80，100 ℃；光照 2，8，24，48，120 h；金屬離子Fe3+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Pb2+0.01 g/mL；防腐劑1%苯甲酸鈉、1%山梨酸鉀、對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜紅素浸提劑的選擇與最大吸收波長的確定

甜菜紅素在不同提取溶劑下的溶解性見表2。

表2 甜菜紅素在不同提取劑下的顏色及溶解性Table 2 Color and solubility of betacyanin under different extractants

由表2可知，甜菜紅素在蒸餾水中提取液為紅色，溶解性最強(qiáng)，吸光度值為 0.783 5；微溶于乙醇，提取液呈淡紅色，不溶于無水乙醇、乙醚和丙酮；在乙醚中提取液為黑紫色，可能是乙醚促進(jìn)了色素氧化。用蒸餾水作提取溶劑時(shí)，甜菜紅素在535 nm處出現(xiàn)最大吸光度值，故選用蒸餾水為最佳提取劑。

2.2 單因素試驗(yàn)分析

2.2.1 料液比對(duì)甜菜紅素提取的影響

以蒸餾水為提取劑，在不同料液比條件下，對(duì)提取的甜菜紅素溶液的吸光度進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對(duì)甜菜紅素提取的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of betacyanin

由圖1可知，隨著料液比的增大，甜菜紅素的提取效率逐漸增大，吸光度值在達(dá)到最大后開始減小，當(dāng)料液比達(dá)到1∶5 (g/mL)時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，隨后吸光度值減小，這可能是由于甜菜中的甜菜紅素是有限的，繼續(xù)增加料液比，多余的提取劑稀釋了提取液，因此吸光度小幅度降低。綜上，選擇料液比為1∶5 (g/mL)更合適。

2.2.2 提取溫度對(duì)甜菜紅素提取的影響

不同溫度下甜菜紅素的提取結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)甜菜紅素提取的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction of betacyanin

由圖2可知，溫度升高，甜菜紅素的吸光度增大，在30 ℃時(shí)達(dá)到最大值。超過30 ℃時(shí)，色素逐漸分解，吸光度值下降，由此可見溫度對(duì)甜菜紅素提取的影響較大。甜菜紅素易氧化、耐熱性差，所以在生產(chǎn)中甜菜紅素的提取溫度控制在30 ℃左右為宜。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素提取的影響

不同提取時(shí)間下甜菜紅素的提取結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素提取的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of betacyanin

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長，吸光度不斷增大，但在40 min后甜菜紅素的吸光度變化不大，可能是提取過程已經(jīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。其次，在40 min后延長提取時(shí)間，甜菜紅素的吸光度變化不是很大，從經(jīng)濟(jì)成本和時(shí)間效率上考慮，提取時(shí)間為40 min較合適。

2.2.4 pH對(duì)甜菜紅素提取的影響

不同pH下甜菜紅素的提取結(jié)果見圖4。

圖4 pH對(duì)甜菜紅素提取的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction of betacyanin

由圖4可知，提取溶劑的pH增大，甜菜紅素的吸光度增大，在pH為4時(shí)達(dá)到最大值，pH大于4后，吸光度開始減小，呈先增大后減小的趨勢，原因可能是pH的增大破壞了色素結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致吸光度減小，故選擇pH 4為較佳的酸度。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用料液比(A)、提取時(shí)間(B)、pH(C)、提取溫度(D)4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

由表3中極差R分析結(jié)果可知，影響甜菜紅素提取效果的4個(gè)因素由大到小為C>A>B>D，即pH對(duì)甜菜紅素提取效果的影響最大，其次為料液比。甜菜紅素的最佳提取條件為A2B2C2D2，即料液比為1∶5 (g/mL)，提取pH為4，提取溫度為30 ℃，提取時(shí)間為40 min。

驗(yàn)證試驗(yàn)：利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化后的條件提取甜菜紅素，平行3組試驗(yàn)，測定吸光度，取平均值，得到最大吸光度為0.836 4，說明正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的提取條件是可行的。

2.4 甜菜紅素穩(wěn)定性結(jié)果分析

2.4.1 溫度對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響

在波長535 nm處對(duì)處理過的甜菜紅素提取液進(jìn)行吸光度測定，結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of betacyanin

由圖5可知，溫度對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響較大，隨著溫度的升高，吸光度減小，當(dāng)溫度上升到40 ℃后，甜菜紅素的吸光度下降速度加快，可能是溫度過高破壞了甜菜紅素的結(jié)構(gòu)，說明甜菜紅素的熱穩(wěn)定性較差，其儲(chǔ)存環(huán)境的溫度應(yīng)低于40 ℃。

2.4.2 光照對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響

在波長535 nm處對(duì)處理過的甜菜紅素提取液進(jìn)吸光度測定，結(jié)果見圖6。

圖6 光照對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of light on the stability of betacyanin

由圖6可知，在避光條件下，甜菜紅素的吸光度值變化并不是很大；而在日光條件下照射后，甜菜紅素的吸光度值隨著時(shí)間的推移有明顯的下降趨勢，并且兩條折線之間的距離也在變大，說明光照對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性有明顯的影響，這可能是隨著光照時(shí)間的增加，甜菜紅素發(fā)生了氧化變質(zhì)，導(dǎo)致吸光度下降。

2.4.3 金屬離子對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響

對(duì)甜菜紅素在生產(chǎn)加工過程中常使用的儀器設(shè)備及溶液進(jìn)行理化分析，選用Fe3+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Mg2+、Ca2+6種金屬離子作為考察參數(shù)。在波長535 nm處對(duì)加入各金屬離子的甜菜紅素溶液進(jìn)行吸光度測定，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 金屬離子對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of metal ions on the stability of betacyanin

由表4可知，各金屬離子對(duì)甜菜紅素色澤無明顯影響；Ca2+對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響較??；Fe3+和Cu2+對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響較大，所以甜菜紅素應(yīng)盡量避免與Fe3+和Cu2+接觸。

2.4.4 防腐劑對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響

在波長535 nm處對(duì)甜菜紅素在不同防腐劑下的吸光值進(jìn)行測定，結(jié)果見圖7。

圖7 防腐劑對(duì)甜菜紅素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of preservatives on the stability of betacyanin

由圖7可知，苯甲酸鈉和山梨酸鉀均對(duì)甜菜紅素的穩(wěn)定性有一定影響，尤其是添加1%苯甲酸鈉溶液對(duì)甜菜紅素的穩(wěn)定性有明顯加強(qiáng)作用。因此，在甜菜產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)可以添加1%苯甲酸鈉作為防腐劑。

3 結(jié)論

以紅甜菜為原料，采用超聲輔助提取技術(shù)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了甜菜紅素的最佳提取條件。結(jié)果表明甜菜紅素提取的最佳條件為料液比1∶5 (g/mL)、提取pH 4、提取溫度30 ℃、提取時(shí)間40 min。在此條件下，甜菜紅素的最大吸光度可達(dá)到0.836 4，表明提取效果較佳。

甜菜紅素穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，溫度超過40 ℃時(shí)，甜菜紅素的吸光度明顯下降；光照對(duì)甜菜紅素吸光度的影響明顯大于避光條件；Fe3+和Cu2+對(duì)甜菜紅素吸光度的影響較大；山梨酸鉀對(duì)甜菜紅素吸光度的影響小于苯甲酸鈉。因此，甜菜紅素應(yīng)在40 ℃以下避光保存，避免與Fe3+和Cu2+接觸，可與苯甲酸鈉作為食品添加劑共同使用。綜上所述，采用超聲輔助提取的甜菜紅素提取率高、穩(wěn)定性較好。研究結(jié)果可為甜菜紅素的提取及在食品、藥品添加劑方面的應(yīng)用提供參考。