李文超 苗艷

（1.黑龍江省方正縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，黑龍江哈爾濱 150800；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

ESBL（extended-spectrum β-Lactamase）是指超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，是一類能水解青霉素類、頭孢菌素類，以及單環(huán)類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶。ESBL 基因通常由質(zhì)粒攜帶，促進(jìn)其在革蘭氏陰性菌中的傳播。一些監(jiān)測研究表明在亞太地區(qū)產(chǎn)ESBL 的生物高度流行，其中以TEM 型β-內(nèi)酰胺酶、SHV 型β-內(nèi)酰胺酶和CTX-M 型β-內(nèi)酰胺酶最為常見，尤其是β-內(nèi)酰胺酶（bla）中的CTX-M 基因型在亞洲占優(yōu)勢，且在很多國家呈現(xiàn)大規(guī)模流行[1]。由于該基因多定位于質(zhì)粒，容易通過接合性轉(zhuǎn)導(dǎo)在不同細(xì)菌間傳遞。因此，本實(shí)驗(yàn)通過接合轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，以進(jìn)一步確定雞大腸桿菌分離株ESBL 耐藥基因的可轉(zhuǎn)移性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)選取11 株blaCTX-M 基因型ESBL 大腸桿菌分離株（不攜帶其他基因型，由吉林大學(xué)動(dòng)物傳染病診斷與防治教研室提供）平板復(fù)蘇，37℃恒溫箱培養(yǎng)16～18h，挑取單菌落，接種于LB 固體培養(yǎng)基，37℃恒溫箱培養(yǎng)16～18h；利福平抗性的DH5α 標(biāo)準(zhǔn)株購于北京華越洋生物，質(zhì)控菌株ATCC25922 購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.1.2 藥物及培養(yǎng)基

瓊脂粉、培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限公司；頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松和氨曲南藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司；抗生素干粉購自哈藥集團(tuán)制藥總廠；質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification kit）購 自QIAGEN 公 司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品購自TIANGEN 生化科技有限公司；Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs 購自TaKaRa 公司；DNA 凝膠回收、純化試劑盒購自長春百奧生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自Spanish 公司；溴化乙錠（EB）購自北京愛普華美生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備

挑取利福平抗性DH5α 和供體菌病雞ESBL 型大腸桿菌分別在含有利福平抗性終濃度為50μg/mL 和頭孢唑林4μg/mL 的LB 固體平板上劃線，置于37℃溫箱中，培養(yǎng)過夜，次日，分別挑取利福平抗性DH5α和供體菌病雞ESBL 型大腸桿菌單菌落接入5mL 的LB 中，置于37℃搖床，180～200r/min，震蕩過夜。

1.2.2 體外接合轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

取供體菌大腸桿菌菌液1mL 和受體菌DH5α 菌液2mL 充分混合，過微孔濾膜。取下濾膜，置于LB固體培養(yǎng)基中（菌體面向上，不與瓊脂面接觸），平板倒置于37℃溫箱孵育4h 以上。

1.2.3 體外轉(zhuǎn)導(dǎo)成功菌株篩選

取下濾膜，使用1mL 0.85%的生理鹽水清洗膜上的細(xì)菌，1000r/min 離心1min，收集菌體，然后用100μL 的生理鹽水重懸菌體，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)涂布于雙抗板（終濃度利福平200μg/mL 和頭孢唑林50μg/mL 的胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基）上上篩選接合轉(zhuǎn)導(dǎo)子。

1.2.4 接合轉(zhuǎn)導(dǎo)子的檢測

在上述雙抗板上挑取單個(gè)菌落，接種于雙抗液體胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h，進(jìn)一步篩選接合轉(zhuǎn)導(dǎo)子，并對篩選到的接合子進(jìn)行ESBL 初篩和確證。根據(jù)我國藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）推薦使用的ESBL 初篩實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，MH 瓊脂培養(yǎng)基接種接合子，選用頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松和氨曲南按照標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作[2]，記錄各紙片抑菌環(huán)直徑與標(biāo)準(zhǔn)對比進(jìn)行初篩（表1）。

表1 初篩ESBL 表型解釋標(biāo)準(zhǔn)

只要其中有一種或一種以上抗生素紙片抑菌直徑符合上述標(biāo)準(zhǔn)可視為ESBL 可疑株。將可疑菌株按0.5 麥?zhǔn)蠞岫仍俅瓮坎糓H 瓊脂培養(yǎng)基平板上，按照標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作[2]，選用頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸進(jìn)行ESBL 表型確證實(shí)驗(yàn)（表2）。

表2 確證ESBL 表型解釋標(biāo)準(zhǔn)

再用ESBL 耐藥基因的擴(kuò)增方法對篩選到的接合子進(jìn)行PCR 檢測。由于大多數(shù)的ESBL 基因被證實(shí)是定位在質(zhì)粒上，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取確認(rèn)為ESBL 的大腸桿菌的質(zhì)粒并純化，然后PCR 擴(kuò)增主要常見的TEM、SHV 和CTX-M3 種類型bla 基因，引物由invitrogen 公司合成（表3）。

表3 本試驗(yàn)使用的引物

在反應(yīng)體系下（表4），反應(yīng)條件分別為：

表4 PCR 反應(yīng)體系

SHV 和TEM；94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、48℃退火30s、72℃延伸1min，共30 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。

CTX-M：94℃預(yù)變性7min；94℃變性50s、50℃退火40s、68℃延伸1min，共35 個(gè)循環(huán)；68℃再延伸5min。

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB 染色（0.5μg/mL），觀察結(jié)果。

對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后連接至T 載體（Promega），測序。通過BLAST 進(jìn)行網(wǎng)上序列分析。

2 結(jié)果

接合轉(zhuǎn)導(dǎo)后，對雙抗板上篩選的接合轉(zhuǎn)導(dǎo)子進(jìn)行ESBL 確認(rèn)以及PCR 檢測耐藥基因驗(yàn)證，結(jié)果表明，得到的11 株陽性接合子均呈現(xiàn)ESBL 表型；擴(kuò)增結(jié)果顯示，11 株轉(zhuǎn)移接合子的bla 基因型均為CTX-M型（見圖1），轉(zhuǎn)移率為100%，用TEM 和SHV 引物擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

圖1 接合子CTX-M 基因的檢測（部分結(jié)果）

3 討論

接合是細(xì)菌間DNA 自然傳遞的最常見方式，革蘭氏陰性桿菌耐藥率增長的最重要機(jī)制是質(zhì)粒通過接合播散所攜帶的耐藥基因[3]。產(chǎn)ESBL 大腸桿菌攜帶的質(zhì)粒分為接合性質(zhì)粒與非接合性質(zhì)粒兩種，非接合性質(zhì)粒占小部分。blaCTX-M 基因借助接合性質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，通過菌株接合方式實(shí)現(xiàn)耐藥基因在同種屬的革蘭陰性菌或不同種屬的革蘭陽性菌間遷移擴(kuò)散[4]。

本次接合轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，這些ESBL 表型雞源大腸桿菌所攜帶的CTX-M 型bla 基因能夠通過質(zhì)粒在不同的菌株之間轉(zhuǎn)移，并使受體菌株呈ESBL表型，轉(zhuǎn)移率為100%，說明受體菌獲得bla 基因后能高效表達(dá)。這也在一定程度上說明產(chǎn)ESBL 大腸桿菌耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重的原因。雖然食用動(dòng)物身上的耐藥菌是否能夠通過食物鏈傳播至人類，現(xiàn)在尚未有確鑿證據(jù)，但在食用動(dòng)物上這些ESBL 型菌株的流行和傳播確實(shí)對人類健康構(gòu)成了潛在的威脅。