鄧 濤，楊 華，肖英平，汪 雯，呂文濤，王小驪，吳 振，*，吉小鳳，*

(1.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021)

在嬰兒階段，母乳是嬰兒理想的食品，但隨著嬰兒長(zhǎng)大，單一食用母乳或者嬰兒配方乳粉無(wú)法滿足嬰兒的營(yíng)養(yǎng)需求。嬰兒成長(zhǎng)到6個(gè)月后，在母乳或嬰幼兒配方乳粉基礎(chǔ)上逐步添加?jì)胗變狠o助食品。除了谷類和肉類輔助食品，果泥輔食是必不可少的[1]。市場(chǎng)上嬰幼兒果泥種類有蜜桃泥、蘋果泥、紅棗泥、香蕉泥等。果品在收貯運(yùn)過程中易發(fā)生真菌性病害，從而引起腐爛或腐敗，部分霉菌產(chǎn)生真菌毒素，對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)[2]。因?yàn)閶胗變罕旧砩硖攸c(diǎn)，如代謝率低，體重小，而食物攝入量大(相對(duì)同等體重)等，對(duì)于食物中真菌毒素污染膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)，嬰幼兒屬于敏感群體。

真菌毒素是一類由絲狀真菌在適宜條件下產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物。果品中引起質(zhì)量安全隱患的真菌毒素主要有展青霉素、黃曲霉毒素、鏈格孢霉毒素和赭曲霉毒素A等[2]。鏈格孢霉毒素是鏈格孢霉菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。目前研究較多的5種代謝產(chǎn)物為細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid，TeA)、騰毒素(tentoxin，TEN)、交鏈孢酚單甲醚(aletrnariol monomethyl ether，AME)、交鏈孢酚(alternariol，AOH)和交鏈孢烯(altenuene，ALT)等[3-6]。相關(guān)研究表明[7-13]，鏈格孢霉菌分泌的代謝產(chǎn)物大都具有致癌性、致突變性、細(xì)胞毒性、胚胎毒性、基因毒性、急性毒性等毒性，對(duì)人類的身體健康造成一定的危害。

真菌毒素常用的前處理方法有固相萃取技術(shù)[14-16]、液液萃取技術(shù)[17-19]、QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)方法[20-24]、加速溶劑萃取技術(shù)[25-30]等方法。QuEChERS方法具有回收率高、簡(jiǎn)單、高效等特點(diǎn)，且適用于大批量樣品的檢測(cè)[21]。真菌毒素常用的檢測(cè)方法有薄層色譜法[29，31]、氣相色譜法[30，32]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[33-34]、液相色譜法[35]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[36-39]等方法。LC-MS/MS技術(shù)因具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高通量等特點(diǎn)[37]，在污染物篩查分析和確證方面應(yīng)用廣泛。本研究建立了QuEChERS前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒輔食果泥中TeA、TEN、AME、AOH、ALT 等5種鏈格孢霉毒素，該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效，適用于嬰幼兒輔食果泥中鏈格孢霉毒素的確證分析，為政府部門監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

TeA、TEN、AME、AOH和ALT 標(biāo)準(zhǔn)品，奧地利RomeLab公司；果膠酶(純度95%)，美國(guó)Sigma Aldrich 公司；分析純氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水乙酸鈉，山東美正生物科技有限公司；乙酸銨(純度≥99%)，華東醫(yī)藥股份有限公司；色譜純甲酸(純度≥98%)，美國(guó)TEDIA公司；色譜純甲醇和乙腈，美國(guó)Merck公司；PSA和C18吸附劑，天津博納艾杰爾科技有限公司。

LC 30AD超高效液相色譜儀，日本島津公司；AB SCIEX 6500 Qtrap 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀，美國(guó)AB SCIEX公司；Waters ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，美國(guó)Waters 公司；230 volt TALBOYS 旋渦混合器，美國(guó)Troemner公司；KQ-250B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BIOFUGE PRIMO R型高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；微孔板振蕩器，維根技術(shù)(北京)有限公司；Milli-Q A10 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；0.22 μm有機(jī)濾膜，北京頗賽科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用乙腈將TeA、TEN、AME、AOH和ALT標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置于-20 ℃ 下，避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：從100 μg·mL-1的TeA、TEN、AME、AOH和ALT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中，分別移取500 μL 至50 mL 的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，配制成1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置于-20 ℃ 下，避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：用甲醇-水混合液(1∶1，V/V)按比例稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成濃度為0.1、1、5、10、20、50、100、200 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。置于-20 ℃ 下，避光保存。

基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：以嬰幼兒輔食果泥空白樣品為基質(zhì)材料，采用本實(shí)驗(yàn)前處理方法制備空白基質(zhì)溶液?？瞻谆|(zhì)溶液按比例稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成濃度為0.1、1、5、10、20、50、100、200 μg·L-1的基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。置于-20 ℃ 下，避光保存。

1.2.2 樣品提取和凈化

準(zhǔn)確稱取嬰幼兒輔食果泥樣品5 g(準(zhǔn)確至0.01 g)于50 mL 離心管中，依次加入200 μL果膠酶和25 mL 乙腈-水-甲酸混合液(79∶20∶1，V/V/V)，常溫超聲提取30 min，渦旋振蕩15 min，加入4 g 無(wú)水硫酸鎂，0.5 g 氯化鈉和0.5 g 無(wú)水乙酸鈉，劇烈振蕩1 min，8 500 r·min-1離心5 min，吸取上清液1.5 mL于裝有100 mg C18的2 mL 離心管中，12 000 r·min-1離心3 min，吸取上清液1 mL 過0.22 μm 有機(jī)濾膜后進(jìn)UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.2.3 儀器條件

色譜：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液；梯度洗脫程序：0～1.0 min，95% B；1.0～4.0 min，95%～5% B；4.0～8.0 min，5% B；8.0～8.1 min，5%～95% B；8.1～10 min，95% B。進(jìn)樣體積為5 μL；流速為0.2 mL·min-1。

質(zhì)譜：離子源為電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)；離子源噴霧電壓為+5 500/-4 500 V，離子源溫度為500 ℃，氣體1壓力為50 psi，氣體2壓力為55 psi。離子源氣體為空氣，碰撞氣體為高純度氮?dú)?純度99.99%)，該氣體由Peak Scientific(英國(guó)蘇格蘭)氮?dú)獍l(fā)生器提供。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Multiquant V3.0.3軟件對(duì)UPLC-MS/MS檢測(cè)后樣品中目標(biāo)化合物的峰面積、信噪比進(jìn)行分析。Microsoft Excel 2007軟件對(duì)添加回收率、校正曲線、基質(zhì)效應(yīng)、定量限、檢出限和精密度等進(jìn)行整理計(jì)算。SPSS 21.0 軟件對(duì)整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差和顯著性分析。Origin 2018軟件對(duì)目標(biāo)化合物色譜圖進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇及優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和2 mmol·L-1乙酸銨水溶液、甲醇和5 mmol·L-1乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明當(dāng)流動(dòng)相為甲醇和5 mmol·L-1乙酸銨水溶液時(shí)，通過梯度洗脫，5種鏈格孢霉毒素在10 min內(nèi)達(dá)到良好的分離。5種鏈格孢霉毒素MRM離子色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種鏈格孢霉毒素MRM離子色譜圖

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別配制濃度為1.0 μg·mL-1的TeA、TEN、AOH、AME和ALT的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在ESI模式下，分別通過針泵進(jìn)樣，采用一級(jí)質(zhì)譜掃描(Q1掃描)，確定目標(biāo)化合物的母離子和其質(zhì)荷比(m/z)。然后將掃描模式更改為二級(jí)質(zhì)譜掃描(子離子掃描)，調(diào)節(jié)碰撞電壓，選擇信號(hào)響應(yīng)最強(qiáng)和最穩(wěn)定的子離子為定量離子和定性離子，繼續(xù)在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下優(yōu)化最佳去簇電壓(DP)和最佳碰撞能量(CE)，以達(dá)到最佳的檢測(cè)靈敏度。5種鏈格孢霉毒素質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 五種鏈格孢霉毒素質(zhì)譜參數(shù)

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑

本實(shí)驗(yàn)以有機(jī)溶劑甲醇、乙腈、乙腈-水混合液(80∶20，V/V)、乙腈-水-甲酸混合液(79∶20∶1，V/V/V)、乙腈-水-乙酸混合液(79∶20∶1，V/V/V)作為提取溶劑，比較了嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素(TeA，AOH、AME、TEN和ALT)添加回收率的差異。結(jié)果表明，乙腈對(duì)TEN、AME、AOH和ALT的提取效果明顯優(yōu)于甲醇，回收率范圍為76.8%～93.9%，而TeA回收率為47.4%(圖2)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[23]，真菌毒素提取過程中，樣品中加一定量的去離子水，充分浸潤(rùn)樣品，幫助提高有機(jī)溶劑對(duì)非水溶性基質(zhì)的滲透性和提取效率；提取液中加入適量的酸，可增加對(duì)pH值、極性范圍敏感的真菌毒素提取效果，達(dá)到提高目標(biāo)化合物添加回收率的目的。所以，本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水混合液(80∶20，V/V)、乙腈-水-甲酸混合液(79∶20∶1，V/V/V)、乙腈-水-乙酸混合液(79∶20∶1，V/V/V)為提取溶劑對(duì)嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素添加回收效果。結(jié)果表明，以乙腈-水-甲酸混合液(79∶20∶1，V/V/V)為提取溶劑時(shí)，提取效果好于另外兩種提取溶劑，回收率為82.6%～116.9%，其中TeA的回收率達(dá)到82.6%，相比乙腈-水混合液(80∶20，V/V)和乙腈-水-乙酸混合液(79∶20∶1，V/V/V)為提取溶劑，TeA的回收率增加了20.0%和12.7%(圖2)。因此，本實(shí)驗(yàn)確定乙腈-水-甲酸混合液(79∶20∶1，V/V/V)為提取溶劑。

圖2 提取液對(duì)5種鏈格孢霉毒素回收率的影響(加標(biāo)濃度20 μg·kg-1)

2.2.2 提取液體積的選擇

樣品基質(zhì)中真菌毒素提取時(shí)，提取溶液的體積對(duì)目標(biāo)化合物的提取效果也會(huì)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)中，樣品量為5 g，分別比較了15、20和25 mL提取液用量對(duì)5種鏈格孢霉毒素添加回收率的影響。結(jié)果表明，提取液體積為25 mL 時(shí)，TEN、AME、AOH和ALT的回收率在91.0%～116.9%。提取液體積為15和20 mL 時(shí)，TEN、AME、AOH和ALT回收率在75.7%～116.7%。對(duì)于TeA，提取液體積為25 mL 時(shí)，添加回收率為82.6%，明顯高于提取液體積15 mL 時(shí)的回收率64.7%和提取液體積20 mL 時(shí)的回收率66.6%(圖3)。因此，本實(shí)驗(yàn)樣品量為5 g，提取液體積為25 mL。

圖3 提取液體積對(duì)5種鏈格孢霉毒素回收率的影響(加標(biāo)濃度20 μg·kg-1)

2.2.3 果膠酶用量

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，果膠酶能夠分解水果基質(zhì)中果膠，從而消除樣品基質(zhì)中背景干擾，提高提取效果[40]。本實(shí)驗(yàn)，通過加標(biāo)回收分別測(cè)試添加150、200、250 μL果膠酶用量到嬰幼兒輔食果泥樣品中測(cè)試5種鏈格孢霉毒素提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種用量的果膠酶對(duì)TeA，AOH和AME的添加回收率影響較小，回收率為82.6%～111.2%；但果膠酶用量為150 μL時(shí)，TEN和ALT的添加回收率為122.1%～125.6%；果膠酶用量為200 μL時(shí)，TEN和ALT的添加回收率為107.7%～116.9%；果膠酶用量為250 μL時(shí)，TEN和ALT的添加回收率分別為106.3%～111.0%(圖4)。考慮到基質(zhì)效應(yīng)、節(jié)省試劑用量等因素的影響，故本實(shí)驗(yàn)選擇果膠酶的用量為200 μL。

圖4 果膠酶用量對(duì)5種鏈格孢霉毒素回收率的影響(加標(biāo)濃度20 μg·kg-1)

2.2.4 超聲時(shí)間

超聲時(shí)間是食品中真菌毒素提取效果的重要影響因素之一。本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)試了15、30、60 min 的超聲時(shí)間對(duì)5種鏈格孢霉毒素添加回收率的影響。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的增加，5種鏈格孢霉毒素的添加回收率均出現(xiàn)了不同程度的下降；但是對(duì)TeA、AME和AOH的影響不顯著，添加回收率為82.6%～110.8%。超聲時(shí)間為15 min 時(shí)，TEN和ALT的添加回收率為125.6%和128.7%，存在明顯基質(zhì)干擾。但超聲時(shí)間為30 min 時(shí)，TEN和ALT的添加回收率為116.9%和107.7%，超聲時(shí)間為60 min 時(shí)，TEN和ALT的添加回收率為110.2%和102.9%，均滿足真菌毒素的檢測(cè)需求[41](圖5)。因此，結(jié)合樣品的基質(zhì)效應(yīng)、前處理時(shí)間等因素，本實(shí)驗(yàn)采用30 min超聲時(shí)間處理樣品。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)5種鏈格孢霉毒素回收率的影響(加標(biāo)濃度20 μg·kg-1)

2.2.5 鹽析劑

QuEChERS方法通常以無(wú)水MgSO4為除水劑，并結(jié)合NaCl的鹽析作用，除去樣品中的水分和雜質(zhì)，從而使目標(biāo)物能夠充分溶解在有機(jī)相中[42]。本實(shí)驗(yàn)比較了4 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉，4 g 無(wú)水硫酸鎂和1 g 無(wú)水乙酸鈉，4 g 無(wú)水硫酸鎂、0.5 g 無(wú)水乙酸鈉和0.5 g 氯化鈉為鹽析劑對(duì)樣品中5種鏈格孢霉毒素添加回收率的影響。樣品加標(biāo)濃度為20 μg·kg-1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種鹽析劑的添加回收率為79.4%～116.9%，差異不顯著(P>0.05)。但采用4 g 無(wú)水硫酸鎂和1 g 氯化鈉為鹽析劑組合時(shí)，TEN、AME和AOH的回收率為92.6%～111.7%，基質(zhì)效應(yīng)為39.0%～72.3%，存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。采用4 g 無(wú)水硫酸鎂和1 g無(wú)水乙酸鈉為鹽析劑組合時(shí)，TEN、AME、AOH和ALT的回收率為86.2%～109.1%，基質(zhì)效應(yīng)為40.8%～78.0%，存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。采用4 g 無(wú)水硫酸鎂、0.5 g無(wú)水乙酸鈉和0.5 g 氯化鈉為鹽析劑組合時(shí)，AME和AOH存在基質(zhì)效應(yīng)，回收率為91.0%～105.9%，基質(zhì)效應(yīng)為 65.2%～123.8%(圖6)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇4 g 無(wú)水硫酸鎂、0.5 g 無(wú)水乙酸鈉和0.5 g 氯化鈉為鹽析劑。

圖6 鹽析劑對(duì)嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素回收率的影響(加標(biāo)濃度20 μg·kg-1)

2.2.6 凈化劑

嬰幼兒輔食果泥中存在許多果膠、色素、有機(jī)酸和糖等物質(zhì)，鹽析后并不能將這些物質(zhì)從樣品基質(zhì)中完全分離，會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物精準(zhǔn)檢測(cè)產(chǎn)生一定的干擾。QuEChERS方法通常選用石墨化炭黑(graphitized carbon black，GCB)、碳18(carbon 18，C18)和乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)等凈化劑清除樣品提取液中雜質(zhì)干擾[24]。食品中真菌毒素污染分析時(shí)，多選用C18和PSA作為凈化劑，故預(yù)實(shí)驗(yàn)中比較了C18和PSA對(duì)提取液凈化效果的影響[24，42]。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用PSA和C18凈化時(shí)，TEN、AME、AOH和ALT的回收率為89.3%～116.9%，但兩種凈化劑對(duì)TeA的回收率影響差異顯著(P<0.05)。采用PSA凈化時(shí)，TeA的回收率只有26.4%；采用C18凈化時(shí)，TeA的回收率為74.4%(圖7)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用C18對(duì)樣品基質(zhì)進(jìn)行凈化。本實(shí)驗(yàn)中比較了0、50、100、200、300 mg C18用量對(duì)嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未凈化的樣品中TEN、AME、AOH和ALT的回收率為125.0%～131.5%，存在明顯基質(zhì)干擾。采用50 mg C18凈化提取液時(shí)，TEN和AOH的回收率為125.6%和122.1%，存在基質(zhì)增強(qiáng)現(xiàn)象。采用100、200、300 mg C18凈化提取液時(shí)，5種鏈格孢霉毒素的回收率為82.3%～117.1%，基質(zhì)干擾可接受。通過對(duì)三種C18用量對(duì)5種鏈格孢霉毒素的回收率的影響顯著性分析，結(jié)果為差異不顯著(P>0.05)(圖8)。所以，綜合考慮目標(biāo)化合物回收率，基質(zhì)效應(yīng)影響以及凈化劑材料用量成本等因素后，本實(shí)驗(yàn)采用100 mg C18凈化樣品提取液。

*表示差異顯著(P<0.05)。

圖8 C18用量對(duì)5種鏈格孢霉毒素回收率的影響(加標(biāo)濃度20 μg·kg-1)

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

配制不同濃度的空白嬰幼兒輔食果泥樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正曲線方程，結(jié)果如表2所示。5種鏈格孢霉毒素在0.1～200 μg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)(R2)均大于0.998(表2)。同時(shí)將檢測(cè)結(jié)果分別以3倍信噪比和10倍信噪比為判斷依據(jù)確定方法的檢測(cè)限(limits of detection，LOD)與定量限(limits of quantification，LOQ)。5種鏈格孢霉毒素(TeA、AOH、AME、TEN和ALT)的檢測(cè)限為0.1 μg·kg-1，定量限為0.3 μg·kg-1(表2)。

表2 五種鏈格孢霉毒素的線性關(guān)系、檢出限、定量限

2.3.2 加標(biāo)回收率和精密度

采用優(yōu)化后的前處理方法，空白嬰幼兒輔食果泥樣品中加入5、20、50 μg·kg-1三檔濃度的5種鏈格孢霉毒素(AOH、AME、ALT、TeA和TEN)，每個(gè)添加濃度做6個(gè)平行樣，并在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，同時(shí)對(duì)這些樣品進(jìn)行連續(xù)3 d的測(cè)定，得到目標(biāo)化合物的添加回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果如表3所示。5種鏈格孢霉毒素(TeA、TEN、AME、AOH和ALT)在3個(gè)加標(biāo)濃度下回收率范圍為73.8%～118.0%，日內(nèi)精密度范圍為2.3%～8.2%，日間精密度范圍為2.4%～8.5%(表3)，表明該方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)良好，可滿足嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素(AOH、AME、ALT、TeA和TEN)的檢測(cè)需求。

表3 五種鏈格孢霉毒素的回收率和精密度

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由于基質(zhì)本身或前處理過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物在色譜分離過程中產(chǎn)生干擾。這些雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重抑制或增強(qiáng)目標(biāo)化合物的離子化效率。因此，削弱基質(zhì)效應(yīng)的影響可以顯著提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度[41]。通常用基質(zhì)校正曲線線性方程斜率與溶劑校正曲線線性方程斜率的比值評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)影響。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)值越接近100%，基質(zhì)效應(yīng)的影響越小，一般來說基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%，表示其基質(zhì)效應(yīng)可接受；小于80%，則代表基質(zhì)效應(yīng)以抑制為主；大于120%，代表基質(zhì)效應(yīng)以增強(qiáng)為主[43-44]。選取空白嬰幼兒輔食果泥樣品，按優(yōu)化后的前處理方法進(jìn)行處理，所得空白基質(zhì)液，配制成濃度為0.1、1、5、10、20、50、100、200 μg·L-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)配制一系列相同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定。

經(jīng)儀器分析，按各化合物保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的峰面積(y)與其濃度(x)進(jìn)行線性擬合，計(jì)算出基質(zhì)效應(yīng)如圖9所示。5種鏈格孢霉毒素中TeA、TEN和ALT的基質(zhì)效應(yīng)為81.7%～96.4%，表明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)這3種鏈格孢霉毒素的影響較小。AOH和AME的基質(zhì)效應(yīng)分別為123.8%和65.2%，所以樣品基質(zhì)對(duì)AOH有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而對(duì)AME有基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)外標(biāo)法定量分析樣品基質(zhì)中5種鏈格孢霉毒素，從而消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物定量分析過程中的影響。

圖9 嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)采集了30批次嬰幼兒輔食果泥，采用優(yōu)化后的QuEChERS方法對(duì)其進(jìn)行前處理，結(jié)合UPLC-MS/MS檢測(cè)嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素的污染情況。結(jié)果表明，嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素總檢出率為40%。其中ALT檢出率最高為30%，濃度范圍為1.2～5.9 μg·kg-1；其次為TeA和AOH，檢出率分別為26.7%和20%，濃度范圍分別為0.3～31.0 μg·kg-1和0.4～17.2 μg·kg-1；樣品中AME和TEN的檢出率較低，分別為10%和6.7%，濃度范圍分別為1.0～10.9 μg·kg-1和4.1～13.1 μg·kg-1。樣品中檢出的陽(yáng)性樣品質(zhì)譜圖如圖10所示。

圖10 嬰幼兒輔食果泥中AME(10.9 μg·kg-1)，AOH(17.2 μg·kg-1)，TEN(13.1 μg·kg-1)，TeA(31.0 μg·kg-1)檢出質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)提取溶劑、提取液體積、果膠酶用量、超聲時(shí)間，以及鹽析劑、凈化劑等前處理過程的優(yōu)化，采用基質(zhì)外標(biāo)法定量，建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素。經(jīng)方法驗(yàn)證，該方法測(cè)定嬰幼兒輔食果泥中的5種鏈格孢霉毒素，在0.1～200 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，決定系數(shù)(R2)均大于0.998，檢測(cè)限和定量限分別為0.1 μg·kg-1和0.3 μg·kg-1，平均回收率為73.8%～118.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～8.5%。該方法具有選擇性好、高效、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，適用于嬰幼兒輔食果泥中5種鏈格孢霉毒素確證檢測(cè)。