王一然，康志超，朱國鵬，王 洋，其格其，*，于洪文，*

(1.中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長春 130102；2.長春理工大學 化學與環(huán)境工程學院，吉林 長春 130022；3.興安盟農(nóng)牧局 興安盟農(nóng)牧科學研究所，內(nèi)蒙古 興安 137400)

東北地區(qū)作為我國糧食主產(chǎn)區(qū)，是保障國家糧食安全的“穩(wěn)壓器”和“壓艙石”。2021年全國糧食總產(chǎn)量6.829×1010kg，東北地區(qū)糧食產(chǎn)量達全國糧食總產(chǎn)量的20.3%[1]。伴隨著農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，農(nóng)作物秸稈產(chǎn)出過剩，秸稈處理不當將帶來嚴重的環(huán)境污染。其中，農(nóng)作物秸稈的合理處理對于發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)、保護環(huán)境、提高資源利用率、改善土壤基質(zhì)、提升東北農(nóng)業(yè)發(fā)展質(zhì)量具有重要意義[2]。受限于東北整體的經(jīng)濟狀況與地區(qū)氣候特點，作物秸稈在自然條件下降解緩慢，目前對于農(nóng)作物秸稈的處理較為粗放，大多仍采用焚燒處理的方法，既不利于環(huán)境保護，也不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展與耕地的良性循環(huán)[3]。在自然環(huán)境下降解作物秸稈則面臨諸多問題：第一，秸稈的主要成分木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等均屬于芳香族高分子化合物，具有難以在自然環(huán)境中被降解的復雜三維結(jié)構(gòu)[4]；第二，東北較低的平均氣溫與土壤凍融頻繁的特點進一步降低了秸稈的自然降解速度[5]。因此，針對東北低溫特點，開發(fā)高效可行、綠色節(jié)能的秸稈處理方法迫在眉睫。

基于微生物的秸稈處理方法是近年的研究熱點[6]。通過在土壤中添加可利用木質(zhì)纖維素的微生物，可有效加速秸稈降解，實現(xiàn)秸稈自然還田。有研究者發(fā)現(xiàn)，構(gòu)筑復合菌系可有效彌補單一菌系酶活性較弱與降解效率低的缺點，大幅提升秸稈的降解速率[7-8]。例如，蘇鑫[9]以堿木質(zhì)素為碳源，選擇性地篩選出可降解秸稈的單菌，再通過單菌有效復配構(gòu)建復配菌系，從而達到利用微生物降解秸稈的目的。張必周等[10]構(gòu)建的菌群GZ-4在8 ℃仍具有良好的秸稈降解能力。楊夢雅等[11]篩選出的菌群在20 ℃下秸稈降解率可達43.65%。

并非菌群豐富度越高越好，菌株之間可能存在一定的拮抗作用或資源競爭，導致菌群產(chǎn)酶效果下降，無法達到理想的秸稈降解效果[12]。本實驗室前期在低溫條件下，成功篩選出6個菌屬共20株耐低溫秸稈降解菌。本研究基于宏基因組分析的菌屬相關(guān)性，在原始菌群JZ5的基礎(chǔ)上，優(yōu)化構(gòu)建了菌群CJZ1、CJZ2，通過分析3個菌群降解秸稈過程中的pH值、酶活性和秸稈降解率的變化，比較優(yōu)化菌群的降解效果。主要通過減少菌群中菌種類別，降低菌群復雜性，達到菌群優(yōu)化的目的，為秸稈還田等實際應用提供理論基礎(chǔ)和優(yōu)質(zhì)菌群。

1 材料與方法

1.1 材料

供試玉米秸稈來自中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所長春農(nóng)業(yè)綜合試驗站。秸稈打碎過20目篩(孔徑0.85 mm)備用。供試菌株來自實驗室現(xiàn)有的20株菌，篩選自吉林省長春市長春凈月潭國家森林公園。

1.2 試驗設(shè)計

將實驗室已鑒定過的20株菌株全部活化，構(gòu)成菌群JZ5?；趯嶒炃捌诰篔Z5宏基因組數(shù)據(jù)分析菌種之間相關(guān)性，結(jié)果表明鞘氨醇桿菌、鞘氨醇單胞菌、代爾夫特菌3個屬間互為正相關(guān)，黃桿菌屬與代爾夫特菌屬呈負相關(guān)；節(jié)桿菌屬與鞘氨醇桿菌、代爾夫特菌、鞘氨醇單胞菌亦為負相關(guān)。在菌群JZ5基礎(chǔ)上重新構(gòu)建2個菌群：CJZ1、CJZ2，并對3組菌群之間的生理生化指標和秸稈降解情況進行比較。每組進行3次平行實驗。菌群組成如表1所示。

表1 菌群組成

1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH值7.4。

R2A培養(yǎng)基：酵母提取物0.5 g·L-1，可溶性淀粉0.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，丙酮酸鈉0.3 g·L-1，酪蛋白氨基酸0.5 g·L-1，磷酸氫二鉀0.3 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，七水合硫酸鎂0.05 g·L-1，pH值7.0[13]。

赫奇遜氏培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀1.0 g·L-1，硝酸鈉2.5 g·L-1，氯化鈉0.1 g·L-1，氯化鈣0.1 g·L-1，七水合硫酸鎂0.3 g·L-1，氯化鐵0.01 g·L-1，pH值7.2。

復合菌系接種于以秸稈為唯一碳源的赫奇遜氏培養(yǎng)基中，15 ℃、180 r·min-1下培養(yǎng)12 d。

1.4 pH值測定

在1、2、3、5、7、9、12 d，取5 mL菌液于15 mL無菌離心管中，使用S210 SevenCompactTMpH計(梅特勒-托利多，瑞典)檢測其pH值。

1.5 菌群酶活性測定

漆酶活性測定使用以ABTS為底物的方法[14]：取40 μL粗酶液和760 μL ABTS底物溶液置于1 m L離心管中，在37 ℃恒溫水浴鍋中反應5 min后，測定其吸光度D420變化。以滅活酶液作為對照，計算酶活性。

木質(zhì)素過氧化物酶活性測定采用以天青B為底物的測定方法[15]：取酒石酸鈉緩沖液4 mL、天青B溶液3 mL、粗酶液0.8 mL，加入0.2 mL H2O2開始反應，30 ℃保溫反應5 min后，測定其吸光度D651變化，計算酶活性。

纖維素酶活性采用以羧甲基纖維素鈉作為底物的測定方法[16]：取羧甲基纖維素鈉溶液4 mL，加入4 mL粗酶液，50 ℃保溫30 min，保溫結(jié)束后立即煮沸終止反應，取4 mL反應液，加入3 mL DNS顯色劑，95 ℃水浴保溫10 min，保溫結(jié)束后立即用冷水終止反應，加入10 mL蒸餾水，混勻，測定其吸光度D540，計算酶活性。

半纖維素酶活性采用以木聚糖作為底物的測定方法[17]：取木聚糖溶液4 mL，加入4 mL粗酶液，50 ℃保溫30 min，保溫結(jié)束后立即煮沸終止反應，取4 mL反應液，加入3 mL DNS顯色劑，95 ℃水浴保溫10 min，保溫結(jié)束后立即用冷水終止反應，加入10 mL蒸餾水，混勻，測定其吸光度D540，計算酶活性。

1.6 秸稈降解研究

玉米秸稈打碎后過20目篩烘干，取1 g加入100 mL赫奇遜氏培養(yǎng)基中，121 ℃高壓滅菌，接種菌群后置于恒溫培養(yǎng)箱中，15 ℃ 180 r·min-1培養(yǎng)12 d后，過濾烘干，測定秸稈失重率。采用范式測纖維素方法[18]測定秸稈中各組分含量的變化。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和相關(guān)性分析，利用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始菌群與構(gòu)建菌群pH值變化

JZ5、CJZ1、CJZ2的pH值變化如圖1所示，3組菌群初始pH值均為7.20。在秸稈的組成成分中，半纖維素更易于被微生物利用，且半纖維素降解后會產(chǎn)生酸性物質(zhì)[19]。在15 ℃，原始菌群JZ5在1 d時，發(fā)酵液pH值從初始值7.2下降至7.15；在5 d后，秸稈降解產(chǎn)生了胺類物質(zhì)[18]，發(fā)酵液pH值升高并穩(wěn)定在8.10～8.22，表明復合菌群具有良好的調(diào)節(jié)pH值作用。構(gòu)建菌群CJZ1、CJZ2在發(fā)酵期間，發(fā)酵液pH值緩慢上升，發(fā)酵3 d，CJZ2組pH值小幅下降，表明秸稈在發(fā)酵期間可能會產(chǎn)生有機酸；3 d后，構(gòu)建菌群發(fā)酵液pH值均呈穩(wěn)定上升趨勢，并于12 d達到峰值，此時JZ5組與CJZ1、CJZ2組相比具有顯著差異(CJZ1組pH值為7.96，CJZ2組pH值為7.86)。

圖1 不同菌群的pH值

2.2 菌群酶活性變化

2.2.1 漆酶活性

原始菌群和構(gòu)建菌群漆酶活性變化如圖2所示。原始菌群JZ5在發(fā)酵5 d達到峰值(14.7 U·mL-1)，構(gòu)建菌群CJZ1、CJZ2均在發(fā)酵3 d達到峰值，峰值處酶活性分別為11.12 U·mL-1和10.82 U·mL-1，CJZ1、CJZ2組間并無顯著差異，均顯著低于JZ5組。表明菌群中去掉節(jié)桿菌屬菌株后，菌群酶活性峰值略有降低；但培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗相對緩慢，峰值后，構(gòu)建菌群的漆酶活性下降速度比原始菌群慢。

圖2 不同菌群的漆酶活性

2.2.2 木質(zhì)素過氧化物酶活性

由圖3可知，JZ5組木質(zhì)素過氧化物酶活性變化呈單峰狀，在發(fā)酵5 d時達到峰值(6.17 U·mL-1)，5 d后，JZ5組木質(zhì)素過氧化物酶活性迅速下降，到12 d時酶活性下降至1.21 U·mL-1左右；CJZ1和CJZ2組的木質(zhì)素過氧化物酶活性從發(fā)酵1 d開始迅速上升，均在發(fā)酵7 d達到峰值，CJZ2組峰值處活性顯著高于CJZ1組；發(fā)酵12 d時，CJZ1和CJZ2組的木質(zhì)素過氧化物酶活性分別下降至2.07 U·mL-1和2.17 U·mL-1。

圖3 不同菌群木質(zhì)素過氧化物酶活性

2.2.3 纖維素酶活性

如圖4所示，JZ5、CJZ1、CJZ2組均在發(fā)酵7 d時達到峰值，分別為16.45、23.6、22.7 U·mL-1，CJZ1、CJZ2組間無顯著差異，均顯著高于JZ5組；CJZ1和CJZ2組的纖維素酶活性在發(fā)酵前7 d快速升高，在發(fā)酵12 d時分別降至16.1 U·mL-1和

圖4 不同菌群纖維素酶活性

15.1 U·mL-1。構(gòu)建菌群的纖維素酶活性整體優(yōu)于原始菌群。

2.2.4 半纖維素酶活性

圖5為3組菌群的半纖維素酶活性變化曲線。與纖維素相比，半纖維素具有支鏈結(jié)構(gòu)和乙?；?，結(jié)構(gòu)較為松散，更易于被降解。JZ5組半纖維素酶活性在發(fā)酵7 d時達到峰值(81.3 U·mL-1)；CJZ1、CJZ2組的半纖維素酶活性從發(fā)酵1 d開始快速上升，分別在發(fā)酵5 d和7 d達到峰值，分別為98.7、91.8 U·mL-1，兩組間無顯著差異；發(fā)酵12 d時，CJZ1、CJZ2組的半纖維素酶活性分別為75.6、82.7 U·mL-1。結(jié)果表明，在峰值處，構(gòu)建菌群的半纖維素酶活性顯著高于原始菌群，說明構(gòu)建菌群對秸稈中半纖維素的利用能力更強。

圖5 不同菌群半纖維素酶活性

2.3 秸稈降解率

在15 ℃條件下，經(jīng)過12 d的降解，JZ5、CJZ1、CJZ2組對秸稈的降解率如圖6所示。JZ5組秸稈降解率為30.54%，CJZ1組秸稈降解率為31.01%，CJZ2組秸稈降解率為30.79%，構(gòu)建菌群的秸稈降解率未顯著(P>0.05)提高。

圖6 不同菌群的秸稈降解率

3 結(jié)論與討論

近年來，開發(fā)并利用新型微生物技術(shù)加速作物秸稈降解的相關(guān)研究受到了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。細菌微生物復合菌系的構(gòu)建是一個復雜的過程，培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件的優(yōu)化是構(gòu)建復合菌系發(fā)酵體系不可或缺的一部分[20]。以往秸稈分解菌的篩選和評價主要集中在中高溫條件[21]，對于低溫下分解木質(zhì)纖維素的研究相對較少。本實驗室前期在低溫條件下，富集篩選出20株具有秸稈降解的菌株[22]，并構(gòu)建原始菌群JZ5。原始菌群中Sphingobacteria占比最多，推測其在秸稈降解菌群中屬于優(yōu)勢菌種。

科研人員在研究不同農(nóng)作物秸稈轉(zhuǎn)化生成甲烷時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavobacterium屬在木質(zhì)素降解過程中起到了主要作用[23-24]。Jiang等[25]以木質(zhì)素磺酸鈉為底物，在寒冷條件下篩選出了具有木質(zhì)素降解能力的節(jié)桿菌，證明其具有木質(zhì)素降解能力。降解木質(zhì)素用到的主要酶系有漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶等[26]，推斷優(yōu)化后的菌群CJZ1、CJZ2由于缺少Flavobacterium和Arthrobacter的參與，導致漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶活性下降，需要在后續(xù)試驗中，進一步研究漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶下降的具體原因。有研究表明，菌群中Sphingobacteria能夠降解多種芳香族化合物[27]，是研究芳香族化合物的代謝途徑的模式菌株[28]。因此，菌群JZ5、CJZ1和CJZ2都具有良好的纖維素降解能力，有利于秸稈中纖維素的降解[29]。穆春雷等[5]在探究pH值對纖維素酶的影響中發(fā)現(xiàn)，當pH值為8.0時，纖維素酶活性會受到一定程度的抑制。本試驗中JZ5的pH值在3 d時達到7.96，并在5 d后穩(wěn)定在8.0以上，此時菌群JZ5的纖維素酶活性峰值為16.45 U·mL-1；優(yōu)化菌群CJZ1、CJZ2的pH值在培養(yǎng)周期內(nèi)一直緩慢上升，未超過8.0，此時菌群CJZ1、CJZ2的活性峰值分別為23.6、22.7 U·mL-1。由此推斷，優(yōu)化前后菌群因受到pH值的影響而導致纖維素酶活性產(chǎn)生差異。

薩如拉等[30]構(gòu)建了兩組秸稈降解復合菌系，在15 ℃條件下培養(yǎng)，其中1號復合菌系15 d后秸稈降解率達到30.21%。本實驗優(yōu)化構(gòu)建新的菌群CJZ1(鞘氨醇桿菌屬、地桿菌屬、黃桿菌屬、代爾夫特菌屬、鞘氨醇單胞菌屬)，在15 ℃培養(yǎng)12 d，秸稈降解率達到31.01%，纖維素降解率為25.4%，木質(zhì)素降解率為24.7%，半纖維素降解率為66.5%；CJZ2(鞘氨醇桿菌屬、地桿菌屬、代爾夫特菌屬、鞘氨醇單胞菌屬)，15 ℃培養(yǎng)12 d，秸稈降解率達到30.79%，纖維素降解率為24.6%，木質(zhì)素降解率為25.3%，半纖維素降解率為66.1%。

Jiménez 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，黃桿菌與節(jié)桿菌具有木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)換的能力。本試驗中優(yōu)化構(gòu)建的菌群，雖去掉了原有菌群中負相關(guān)的節(jié)桿菌屬、黃桿菌屬，但由于二者均具有一定的秸稈降解能力，因此秸稈降解率未顯著提高。本研究在實驗室前期富集篩選的基礎(chǔ)上，在不改變外界理化因素條件下，利用宏基因組分析，重新構(gòu)建了CJZ1、CJZ2兩個菌群，通過改變菌群組成結(jié)構(gòu)，降低菌群復雜性，在實際應用過程中具有一定的優(yōu)勢。綜上所述，復合菌群CJZ1、CJZ2在低溫環(huán)境下具有較強的玉米秸稈降解能力，對高效秸稈降解菌劑的開發(fā)具有一定的指導意義。