洪偉鳴，李睿婷，郭子杰，徐 海，左偉勇，張 亮，宋 亮

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

噬菌體是一類(lèi)寄生在原核生物，如細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌或螺旋體等宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒，在發(fā)現(xiàn)之初就被用于細(xì)菌感染性疾病的治療[1]。隨著人類(lèi)進(jìn)入抗生素時(shí)代，噬菌體治療逐漸淡出公眾的視野。近年來(lái)由于抗生素的濫用，導(dǎo)致耐藥菌的不斷出現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥性已然成為全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題，噬菌體作為細(xì)菌的天然殺手再次受到關(guān)注[2-3]。

噬菌體對(duì)其宿主的識(shí)別具有嚴(yán)格的特異性，不同種、甚至不同分離株常常表現(xiàn)出差異較大的噬菌體敏感性[4]。宿主譜較窄已然成為限制噬菌體抗菌發(fā)展與運(yùn)用的主要障礙之一。雞尾酒療法和廣譜噬菌體分離被認(rèn)為是克服這一障礙最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑。將不同宿主識(shí)別譜的噬菌體配伍成混合制劑即為雞尾酒療法，格魯吉亞的Eliava噬菌體治療中心已成功運(yùn)用該方法數(shù)十年[5-6]。但該方法也存在一定的被動(dòng)性，Eliava中心需定期更新雞尾酒制劑的噬菌體構(gòu)成，以保證治療針對(duì)性與有效性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、基因編輯以及各種生物組學(xué)的快速發(fā)展，人們對(duì)噬菌體的認(rèn)知已經(jīng)超出形態(tài)學(xué)觀察及生理生化活性鑒定的范疇，逐步從被動(dòng)篩選自然突變株噬菌體，向主動(dòng)改造或創(chuàng)造新噬菌體轉(zhuǎn)變。其中，CRISPR-Cas[6]、Bacteriophage recombinant of electroporated DNA(BRED)[7]等技術(shù)正在被廣泛地用于噬菌體改造。Scholl等[8]通過(guò)基因改造使T7噬菌體能夠表達(dá)一種唾液酸酶，利用該酶消化大腸桿菌產(chǎn)生的K1莢膜，進(jìn)而拓展了T7噬菌體宿主譜。樂(lè)率[9]將PaP1噬菌體的尾絲蛋白替換成JG004噬菌體對(duì)應(yīng)蛋白，使得新構(gòu)建的PaP1噬菌體獲得感染JG004宿主的能力，但喪失對(duì)原有宿主的裂解性。T4噬菌體感染大腸埃希菌以及親緣關(guān)系近的志賀氏菌，Tétart等[10]將噬菌體SV76.3和Mi基因組成的片段置換T4噬菌體尾絲基因的同源結(jié)構(gòu)，構(gòu)建的雜合噬菌體不僅能識(shí)別天然宿主，也能夠識(shí)別假結(jié)核耶爾森菌。

T7噬菌體是侵染大腸埃希菌的小型烈性噬菌體，其病毒顆粒有二十面體頭部和非常小的尾，二者之間由頭尾頸圈連接。T7噬菌體gp17基因編碼533氨基酸的尾絲蛋白(p17)，每個(gè)噬菌體含有6條尾絲蛋白(圖1-A)，為同源三聚體結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)識(shí)別宿主、啟動(dòng)感染。決定T7噬菌體宿主識(shí)別的區(qū)域位于最末端的球狀區(qū)，結(jié)構(gòu)學(xué)解析表明，該區(qū)域有4個(gè)暴露的柔性loop環(huán)(BC-、DE-、FG-和HI-loop)(圖1-B)，該區(qū)域氨基酸組成的改變導(dǎo)致宿主識(shí)別譜的變化，是主要的宿主識(shí)別區(qū)域[11]。易錯(cuò)PCR(error-prone PCR，EP-PCR)通過(guò)改變常規(guī)PCR的擴(kuò)增條件來(lái)調(diào)整反應(yīng)過(guò)程中的錯(cuò)配頻率，進(jìn)而獲得隨機(jī)突變的DNA群體，其操作簡(jiǎn)便，特別適用于構(gòu)建較小基因片段的突變文庫(kù)。本研究利用EP-PCR技術(shù)對(duì)T7噬菌體尾絲蛋白羧基末端基因序列進(jìn)行隨機(jī)突變，拯救T7噬菌體尾絲蛋白隨機(jī)進(jìn)化文庫(kù)，為后續(xù)篩選相對(duì)廣譜噬菌體或者特定病原菌噬菌體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

噬菌體與質(zhì)粒：T7 Select 415-1b噬菌體(GenBank accession number V01146噬菌體為骨架改造)拯救試劑盒購(gòu)于Merck公司，pMD19-T simple載體購(gòu)于寶生物公司。

主要試劑：限制性?xún)?nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Diversify PCR Random Mutagenesis Kit均為寶生物公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

主要儀器：臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beck-man公司；BTX電轉(zhuǎn)化儀、PCR儀購(gòu)自寶生物公司；Geldoc-It Imaging System購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.2 T7噬菌體基因組提取與酶切

采用苯酚-氯仿抽提的方法提取T7噬菌體基因組[12]，100 mL T7噬菌體培養(yǎng)液8 000 r·min-1離心15 min，去除裂解細(xì)菌的碎片，收集上清液。加入終濃度為1 μg·mL-1的RNase A、DNaseⅠ，37 ℃反應(yīng)1 h，以1∶4體積比加入PEG-NaCl溶液(20%PEG-8000，2.5 mol·L-1NaCl)，搖勻溶解后，放置4 ℃過(guò)夜。次日，12 000 r·min-1離心30 min并收集沉淀。用5 mL SM緩沖溶液重懸沉淀，加入50 μL 10%SDS、50 μL 0.5 mol·L-1EDTA，于60 ℃消化30 min。加入等體積的DNA提取液(苯酚/氯仿/異戊醇體積比 25∶24∶1)，抽提2次，轉(zhuǎn)移上清液，加入等體積的乙醇混勻，-20 ℃放置1 h，12 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀并用1 mL預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀于室溫下自然晾干，然后溶于100 μL TE溶液，即為提取的T7噬菌體DNA。取10 μL基因組經(jīng)SfiⅠ單酶切，0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收約33 kb片段。

1.3 常規(guī)PCR擴(kuò)增

以T7噬菌體基因組為模板：用引物F1/R1擴(kuò)增尾絲蛋白羧基末端(Tail fiber carboxy-terminal，TF-ct)33 308～33 663位約350 bp基因序列。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。在F1引物5′端引入SfiⅠ酶切位點(diǎn)，R1引物5′端引入SphⅠ酶切位點(diǎn)。用引物F2/R2擴(kuò)增基因組33 663～37 314位約4 000 bp基因序列。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；52 ℃ 45 s；72 ℃ 2 min，30個(gè)循壞，并在F2引物5′端引入SphⅠ酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，SphⅠ單酶切4 000 bp片段，切膠回收，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 文庫(kù)構(gòu)建及鑒定引物

1.4 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增

以回收的TF-ct基因片段為模板，用F1/R1引物進(jìn)行EP-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL，其中包含模板(1 ng·μL-1，1 μL)、引物(10 μmol·L-1，1 μL)和TITANIUMTaq酶(1 μL)；比較3種緩沖條件(buffer condition，BC)下擴(kuò)增效率和突變率的差異：BC9(buffer，5 μL、8 mmol·L-1Mn2+，4 μL、2 mmol·L-1dGTP，5 μL)、BC6(buffer，5 μL、8 mmol·L-1Mn2+，4 μL、2 mmol·L-1dGTP，2 μL)、BC3(buffer，5 μL、8 mmol·L-1Mn2+，2 μL、2 mmol·L-1dGTP，1 μL)。EP-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性 30 s，68 ℃退火延伸1 min，25個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定EP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并切膠回收。

1.5 質(zhì)粒文庫(kù)的構(gòu)建

將突變的TF-ct基因以3∶1的物質(zhì)的量之比與pMD19-T simple連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有Amp+/IPTG/X-gal LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，37 ℃過(guò)夜。統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)和藍(lán)色菌落數(shù)，計(jì)算質(zhì)粒文庫(kù)的容量和重組率[13]。質(zhì)粒庫(kù)容量=菌落總數(shù)×轉(zhuǎn)化產(chǎn)物量；重組率(%)=(菌落總數(shù)-藍(lán)色菌落數(shù))/菌落總數(shù)×100。剔除藍(lán)色菌落，收集培養(yǎng)皿中所有菌落，LB液體培養(yǎng)基重懸菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)SfiⅠ、SphⅠ雙酶切鑒定，回收350 bp目的片段。

1.6 噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建

將SfiⅠ單酶切回收的33 kb基因組片段、SfiⅠ和SphⅠ雙酶切回收的隨機(jī)突變TF-ct片段以及SphⅠ單酶切回收的4 000 bp片段以1∶1∶1的物質(zhì)的量之比進(jìn)行連接(圖1-C)。取5 μL連接產(chǎn)物與25 μL包裝蛋白混合，25 ℃反應(yīng)2 h，反應(yīng)體系中加入270 μL LB液體培養(yǎng)基終止反應(yīng)，即為拯救的噬菌體文庫(kù)[13]。取5 μL包裝產(chǎn)物10倍梯度稀釋并與200 μL過(guò)夜培養(yǎng)的T7噬菌體宿主細(xì)菌BL21混合，經(jīng)雙層瓊脂夾心法測(cè)定噬菌體滴度；挑取單噬斑，用引物F1/R1進(jìn)行PCR檢測(cè)目的基因插入情況。每組隨機(jī)挑選5個(gè)噬斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，采用DNAStar序列分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。分別統(tǒng)計(jì)目的基因中突變的堿基數(shù)及對(duì)應(yīng)的氨基酸突變數(shù)，按照突變率(%)=突變堿基數(shù)(個(gè))/目的基因大小(bp)×100計(jì)算突變率。將剩余的295 μL包裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)接100 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BL21，37 ℃搖床培養(yǎng)3 h至宿主細(xì)菌完全裂解，PEG-NaCl沉淀法回收噬菌體，即為構(gòu)建的T7噬菌體尾絲蛋白隨機(jī)進(jìn)化文庫(kù)。

圖1 定向進(jìn)化文庫(kù)構(gòu)建原理及流程

1.7 單克隆噬菌體吸附力比較

從已測(cè)序的15個(gè)單克隆噬菌體中隨機(jī)挑選EP3、EP6、EP10、EP12和EP13這5個(gè)在loop區(qū)域有點(diǎn)突變的克隆進(jìn)行純培養(yǎng)，用于比較宿主吸附能力的差異。將宿主細(xì)菌BL21培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在預(yù)熱的LB培養(yǎng)基稀釋至1×107CFU·mL-1。以5 mL每管分裝BL21細(xì)菌，往其中分別接種單克隆噬菌體至濃度為1×105PFU·mL-1，并于37 ℃繼續(xù)孵育5 min。取200 μL孵育混合物立即離心分離游離噬菌體和吸附在BL21表面的噬菌體；另取200 μL孵育混合物不做離心處理。分別測(cè)定離心后上清中游離噬菌體的滴度(Nf)和未離心處理混合物中的噬菌體滴度(Nt)。計(jì)算噬菌體吸附率α=-0.2[ln(Nf/Nt)][14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因片段的制備

從T7噬菌體培養(yǎng)液中成功提取到高純度T7噬菌體基因，電泳顯示基因組條帶單一、大小符合預(yù)期；經(jīng)SfiⅠ單酶切可將線(xiàn)性T7噬菌體基因組分成約33 kb左側(cè)片段以及約4 000 bp右側(cè)片段(圖2-A)。以提取的基因組為模板，F(xiàn)1/R1引物擴(kuò)增出350 bp的T7噬菌體尾絲蛋白羧基末端基因片段(圖2-B)，F(xiàn)2/R2引物擴(kuò)增出尾絲蛋白基因下游約4 000 bp基因片段(圖2-C)。

A：T7噬菌體基因組提取及酶切；M，DL15000 DNA marker；1，T7噬菌體基因組；2，SfiⅠ單酶切T7噬菌體基因組。B：PCR擴(kuò)增T7噬菌體尾絲蛋白羧基末端基因片段；M，DL2000 DNA marker；1，TF-ct基因片段。C：PCR擴(kuò)增T7噬菌體尾絲蛋白下游末端基因片段；M，DL5000 DNA marker；1，尾絲蛋白下游末端基因片段。

2.2 TF-ct基因片段的隨機(jī)突變及質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建

為了有效擴(kuò)增TF-ct基因片段同時(shí)保證獲得足夠的突變率，根據(jù)突變?cè)噭┖惺褂谜f(shuō)明，選擇3個(gè)緩沖條件進(jìn)行EP-PCR擴(kuò)增。隨著擴(kuò)增體系中Mn2+、dGTP含量的逐漸下降，從圖3-A可以看出，目的條帶的亮度逐漸升高，說(shuō)明下調(diào)擴(kuò)增體系中Mn2+及dGTP的含量有助于提高擴(kuò)增效率。分別回收3個(gè)緩沖條件下擴(kuò)增的TF-ct基因片段，與pMD19-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)。提取文庫(kù)質(zhì)粒，經(jīng)SfiⅠ和SphⅠ雙酶切，獲得與預(yù)計(jì)大小相符的目的條帶(圖3-B)，說(shuō)明質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建成功。重復(fù)構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)3次，其庫(kù)容分別為1.25×107、2.33×107、3.46×107CFU·mL-1，通過(guò)統(tǒng)計(jì)藍(lán)白斑比率發(fā)現(xiàn)3個(gè)質(zhì)粒文庫(kù)的重組率均高達(dá)90%以上。

A：EP-PCR擴(kuò)增TF-ct 基因片段；M，DL5000 DNA marker；1～3，BC9、BC6和BC3緩沖條件下擴(kuò)增TF-ct基因片段。B：雙酶切鑒定質(zhì)粒文庫(kù)；M，DL5000 DNA marker；1～3，BC9、BC6和BC3質(zhì)粒文庫(kù)雙酶切鑒定。

回收SfiⅠ和SphⅠ雙酶切條帶，用于T7噬菌體尾絲蛋白定向進(jìn)化文庫(kù)的構(gòu)建。

2.3 隨機(jī)進(jìn)化文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定

按照?qǐng)D1-C中的構(gòu)建流程，將33 kb的T7噬菌體基因左側(cè)片段、3個(gè)質(zhì)粒文庫(kù)中回收的TF-ct片段以及尾絲蛋白下游至基因右側(cè)的片段，以等物質(zhì)的量之比進(jìn)行連接，通過(guò)包裝蛋白包裝拯救T7噬菌體尾絲蛋白隨機(jī)進(jìn)化文庫(kù)。測(cè)定BC9、BC6和BC3噬菌體文庫(kù)的滴度分別為1.37×107、5.52×107和8.26×107CFU·mL-1，并隨機(jī)挑選5個(gè)噬斑進(jìn)行PCR鑒定，從圖4-A可以看出，TF-ct基因均成功插入到設(shè)計(jì)位點(diǎn)。對(duì)15個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，通過(guò)與原始序列相比對(duì)發(fā)現(xiàn)(圖4-B)，隨機(jī)挑選的15個(gè)克隆均有隨機(jī)突變位點(diǎn)，突變率高達(dá)100%。

A:單克隆噬菌體PCR鑒定；M，DL2000 DNA marker; 1～5，BC9噬菌體文庫(kù)；6～10，BC6噬菌體文庫(kù)；11～15，BC3噬菌體文庫(kù)T7噬菌體基因組。B：氨基酸序列分析；15個(gè)測(cè)序樣品的氨基酸序列各需相同，且在對(duì)應(yīng)的4個(gè)loop區(qū)域均有氨基酸點(diǎn)突變。

2.4 不同緩沖條件下突變率的分析

本研究選擇BC9、BC6和BC3三個(gè)緩沖條件，并依次降低體系中Mn2+和dGTP濃度，從表2可以看出：隨著Mn2+和dGTP濃度的降低，其平均堿基突變數(shù)及對(duì)應(yīng)氨基酸突變數(shù)均同步下降。

表2 不同BC條件下EP-PCR的突變率統(tǒng)計(jì)

2.5 尾絲蛋白突變對(duì)吸附能力的影響

分析已測(cè)序噬菌體單克隆TF-ct氨基酸序列，挑選EP-4(I 517K)、EP-6(K 498 T)、EP-10(S 477 I)、EP-12(K 498 R)和EP-13(G 476 A)5個(gè)在loop區(qū)域有點(diǎn)突變的單克隆進(jìn)行純培養(yǎng)。通過(guò)測(cè)定突變株T7噬菌體吸附大腸埃希菌宿主能力，評(píng)價(jià)尾絲蛋白羧基末端loop區(qū)域氨基酸突變對(duì)T7噬菌體生物學(xué)功能的影響。以T7-wt作為對(duì)照，比較吸附能力，從圖5可以看出，EP-6、EP-12對(duì)應(yīng)于DE loop的突變降低了噬菌體與宿主的吸附能力，而EP-10、EP-13對(duì)應(yīng)于BC loop的突變，僅EP-13提高了噬菌體與宿主的吸附能力。

以T7-wt標(biāo)準(zhǔn)株為參照，比較5株尾絲蛋白點(diǎn)突變T7噬菌體吸附宿主大腸埃希菌的效率差異，相同字母標(biāo)記表示差異不顯著，不同字母標(biāo)記表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

自然進(jìn)化往往是隨機(jī)的過(guò)程，而實(shí)現(xiàn)進(jìn)化的兩個(gè)前提是突變與篩選。定向進(jìn)化則是人為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的選擇，很早就被運(yùn)用于動(dòng)植物的育種篩選。針對(duì)特定蛋白分子的體外定向進(jìn)化，又被稱(chēng)為實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，無(wú)需事先了解蛋白的空間結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，幾乎適用于任何蛋白質(zhì)的分子改造和篩選，這為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能提供了一種更為方便、快捷的途徑。定向進(jìn)化的成功實(shí)現(xiàn)，需要滿(mǎn)足3個(gè)方面的條件：合理的進(jìn)化策略、合適的表達(dá)系統(tǒng)以及高通量篩選方法[15]。

在分子生物學(xué)飛速發(fā)展的今天，定向進(jìn)化的先驅(qū)們建立了許多經(jīng)典的進(jìn)化策略和技術(shù)，例如Leung團(tuán)隊(duì)建立的EP-PCR技術(shù)[16]、Willem教授建立的DNA Shuffling[17]技術(shù)以及Miguel Alcalde開(kāi)發(fā)的MORPHING[18]技術(shù)等，為定向進(jìn)化研究提供了技術(shù)保證。其中，EP-PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上演化而來(lái)的，是在擴(kuò)增過(guò)程中引入錯(cuò)誤配對(duì)，使得擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)數(shù)量眾多的點(diǎn)突變，是一種體外誘導(dǎo)DNA序列突變的高效方法。擴(kuò)增過(guò)程中DNA聚合酶保真性、4種dNTP比例、Mg2+離子濃度、Mn2+離子濃度、模板濃度等都是影響錯(cuò)配率的關(guān)鍵因素，優(yōu)化EP-PCR條件可以確保獲得隨機(jī)度更高的擴(kuò)增產(chǎn)物。本研究中通過(guò)采用3種不同濃度的Mn2+、dGTP進(jìn)行EP-PCR擴(kuò)增，獲得3個(gè)不同突變率的目的片段，從而使尾絲蛋白羧基末端的突變子覆蓋最適合的范圍，提高了后期文庫(kù)篩選的得率。

從自然界中篩選相對(duì)廣譜的噬菌體是一項(xiàng)長(zhǎng)期且艱巨的工作，而噬菌體宿主識(shí)別譜較窄的特性更是給這項(xiàng)工作增加了難度[19]。T7噬菌體通過(guò)尾絲蛋白與宿主細(xì)菌表面LPS相作用，每條尾絲獨(dú)立結(jié)合LPS能力很弱且可逆，這樣使得T7噬菌體能沿著細(xì)菌表面滑動(dòng)；只有當(dāng)多條尾絲和LPS相互作用后才能使噬菌體在細(xì)菌表面穩(wěn)定定植，此時(shí)基盤(pán)正對(duì)細(xì)菌外膜，這種初步吸附使信號(hào)從噬菌體底部傳遞到頭部，從而啟動(dòng)感染的不可逆步驟。決定T7噬菌體宿主識(shí)別的區(qū)域位于尾絲蛋白最末端的第4個(gè)球狀區(qū)，結(jié)構(gòu)學(xué)解析表明，該區(qū)域有4個(gè)暴露的柔性loop環(huán)，是主要的宿主識(shí)別區(qū)域。Heineman等[20]發(fā)現(xiàn)T7噬菌體p17蛋白在FGloop的Asp520突變成Glu和HI-loop的Val544突變成Ala，使其喪失與宿主E.coliB和E.coliK2的結(jié)合能力，說(shuō)明該區(qū)域的氨基酸組成對(duì)宿主的選擇識(shí)別至關(guān)重要，氨基酸的突變導(dǎo)致其宿主識(shí)別的改變。本研究中挑選5個(gè)loop區(qū)域發(fā)生點(diǎn)突變的克隆進(jìn)行宿主吸附能力的差異比較，發(fā)現(xiàn)在DE loop的K498T和K498R突變能夠降低T7噬菌體與宿主的吸附能力，而位于BC loop的G476A突變能夠提高T7噬菌體與宿主的吸附能力，該發(fā)現(xiàn)再次驗(yàn)證了T7噬菌體尾絲蛋白loop區(qū)域與宿主識(shí)別的相關(guān)性。

受到實(shí)驗(yàn)室生物材料積累的限制，尚未針對(duì)臨床細(xì)菌樣品尤其是畜禽致病性大腸埃希菌開(kāi)展相對(duì)廣譜的T7噬菌體篩選。但本研究構(gòu)建的T7噬菌體尾絲蛋白隨機(jī)進(jìn)化文庫(kù)為后續(xù)篩選工作奠定了良好的基礎(chǔ)。