田雪娜，孔唯唯，孫津，程代*

（1.天津科技大學(xué) 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.優(yōu)能康（天津）醫(yī)療科技有限公司，天津 300480）

乳清蛋白（whey protein，WP）是人體所需的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源之一[1]，主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白和乳鐵蛋白等構(gòu)成[2]。研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白具有增強免疫細胞功能、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、降血壓等生理功能[3-4]。此外，乳清蛋白的生物活性較強，氨基酸組成模式與人體十分相似，因而極易被人體吸收利用[1]。酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide，CPP）是酪蛋白酶解產(chǎn)物之一，具有促進鈣吸收以及增強免疫力的作用[5]。機體抵抗力調(diào)節(jié)、新陳代謝、組織修復(fù)等維持人體健康的過程，都需要蛋白質(zhì)的參與，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽作為人體膳食營養(yǎng)補充劑可能是強化機體免疫功能的有效途徑。

免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞及免疫因子組成，在識別和排除抗原性異物以及維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要作用，對預(yù)防疾病的發(fā)生具有重要的意義[6]。本實驗以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠為模型，探究乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，為乳清蛋白的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白、酪蛋白磷酸肽：優(yōu)能康（天津）醫(yī)療科技有限公司；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）：美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量檢測試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性檢測試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性檢測試劑盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN） 含量檢測試劑盒、肌酐（creatinine，CR）含量檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；一抗（TLR4、MyD88、NF-κB、β-actin）、二抗（山羊抗兔、山羊抗鼠）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FastKing RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal Pre－Mix Plus（SYBR Green）實時定量試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；實驗所用引物：天津擎科生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP5101N電子天平：上海恒平儀器有限公司；QUOMTIX65-1CN分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；DM4M顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司；Multiskan FC酶標儀、5810/R離心機：上海賽默飛世爾科技有限公司；CFX connect熒光定量 PCR儀、1658033電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Las4000化學(xué)發(fā)光儀：美國通用電氣公司。

1.3 實驗動物

ICR 小鼠 [雄性，（18±2）g，SPF 級，SCXK （京）2019-0010]：斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度（25±1）℃，濕度（55±5）%，12 h暗/光循環(huán)。本研究由天津科技大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準，遵守所有適用于實驗室動物的護理和使用指南。

1.4 方法

1.4.1 動物分組

動物適應(yīng)性喂養(yǎng)后，稱量初始體質(zhì)量，隨機分為4組，分別為空白組（CK）、環(huán)磷酰胺模型組（CTX）、乳清蛋白保護組（WP+CTX）、乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽保護組（WP+CPP+CTX）。實驗第1天～第3天，除空白組外，其余各組每天腹腔注射0.1 mL 80 mg/kg bw環(huán)磷酰胺，建立免疫抑制小鼠模型，空白組每天注射等量生理鹽水。第4天起，乳清蛋白保護組每天灌胃0.2 mL 0.85 g/kg bw乳清蛋白（該劑量相當于成人每日每千克體重推薦攝入量的5倍左右）。乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽保護組每天灌胃0.2 mL 0.85 g/kg bw乳清蛋白+0.10 g/kg bw酪蛋白磷酸肽，空白組和模型組每天灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d后，禁食24 h，麻醉后處以安樂死。眼眶取血，1 500 r/min離心10 min分離血清。解剖，取脾臟、小腸，用于后續(xù)指標測定。

1.4.2 檢測指標

1.4.2.1 小鼠體質(zhì)量變化率

從環(huán)磷酰胺造模第1天起，每隔1 d記錄小鼠體質(zhì)量，將小鼠前一次體質(zhì)量記為W1，后一次體質(zhì)量記為W2，根據(jù)下列公式計算小鼠體質(zhì)量變化率。

小鼠體質(zhì)量變化率/%=（W2-W1）/W1×100

1.4.2.2 小鼠脾臟指數(shù)的測定

分離小鼠脾臟后，置于預(yù)冷的生理鹽水中清洗，濾紙擦去表面水分后稱量小鼠脾臟質(zhì)量。根據(jù)公式：脾臟指數(shù)/（mg/g）=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量，計算得到小鼠脾臟指數(shù)。

1.4.2.3 組織病理學(xué)觀察

將脾臟和小腸組織在10%甲醛中固定，后經(jīng)流水沖洗、脫水、浸蠟、包埋等步驟制作石蠟切片，利用蘇木精-伊紅染色進行組織病理學(xué)觀察。

1.4.2.4 血清生化指標的檢測

分別按照說明書的方法，使用AST活性檢測試劑盒、ALT活性檢測試劑盒、BUN含量檢測試劑盒以及CR含量檢測試劑盒對小鼠血清中AST活性、ALT活性、BUN含量和CR含量進行檢測。

1.4.2.5 小鼠抗氧化系統(tǒng)指標測定

使用GSH含量檢測試劑盒和SOD活性檢測試劑盒對小鼠脾臟和小腸中的GSH含量和SOD活性進行檢測。

1.4.2.6 TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路的活化檢測

采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路的活化。樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用針對目標蛋白的一抗檢測，然后用對應(yīng)的二抗檢測抗體-抗原復(fù)合物。通過凝膠成像和分析系統(tǒng)收集信號。

1.4.2.7 脾臟中炎癥因子的測定

利用Trizol法提取脾臟組織RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成，再使用實時定量試劑盒進行基因表達分析。β-actin基因作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計算各組mRNA水平，引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS Statistics 25軟件進行統(tǒng)計分析，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）和LSD法進行多組數(shù)據(jù)比較，數(shù)據(jù)記錄為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對小鼠體質(zhì)量變化的影響

為探究乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠體質(zhì)量變化的影響，每隔1 d記錄小鼠的體質(zhì)量變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body weight of mice

由圖1可知，與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量變化率下降明顯，表明其生長速度緩慢。在實驗的第12天～第16天，WP+CPP+CTX組小鼠體質(zhì)量較WP+CTX組增加明顯，說明乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽可以有效地緩解免疫抑制所致的小鼠體質(zhì)量降低的情況。

2.2 乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對小鼠脾臟指數(shù)的影響

脾臟是機體重要的免疫器官，脾臟指數(shù)在一定程度上可以反映機體免疫功能情況，結(jié)果見圖2。

圖2 小鼠脾臟指數(shù)Fig.2 Spleen index of mice

由圖2可知，與空白組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)顯著（P<0.05）降低，表明機體免疫功能失調(diào)。經(jīng)過乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽的保護后，小鼠脾臟指數(shù)恢復(fù)，與空白組相比沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.3 乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對小鼠脾臟和小腸組織病理的影響

圖3為脾臟組織病理學(xué)染色結(jié)果。

圖3 小鼠脾臟組織病理圖（HE染色，100×）Fig.3 Histopathology of mice spleen（HE staining，100×）

由圖3可知，空白組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)清晰，無病變。模型組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)重度異常，視野內(nèi)脾小結(jié)結(jié)構(gòu)散亂，紅白髓分界不清晰，淋巴細胞胞核圓潤，局部排列較疏松，紅髓內(nèi)多核巨噬細胞大量增生。經(jīng)過乳清蛋白保護后，小鼠脾臟組織細胞間質(zhì)充血情況減輕，但仍存在部分組織充血現(xiàn)象。經(jīng)過乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽保護后，小鼠脾臟組織狀態(tài)病理損傷明顯發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

圖4為小腸組織病理學(xué)染色結(jié)果。

圖4 小鼠小腸組織病理圖（HE染色，100×）Fig.4 Histopathology of mice small intestine（HE staining，100×）

由圖4可知，空白組小鼠小腸組織上皮細胞排列整齊，無病變。模型組小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)異常，固有層可見少量炎癥細胞浸潤；隱窩上皮胞漿淡染，顯示氣球樣變，伴有明顯的水腫；黏膜下層水腫，致使黏膜層和肌層出現(xiàn)較大間隙。經(jīng)過乳清蛋白保護后，小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)排列稍有松散，但整體病變程度明顯減輕。經(jīng)過乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽的保護后，小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)較為完整，排列較為整齊。

2.4 乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對小鼠肝腎功能的影響

AST和ALT的釋放是衡量肝臟功能的重要指標。為了檢測乳清蛋白對免疫抑制小鼠肝臟功能的影響，測定了小鼠血清中AST和ALT活性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 小鼠血清AST和ALT活性Fig.5 Serum activities of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase in mice

由圖5可知，模型組小鼠的血清AST活性和ALT活性較空白組分別顯著（P<0.05）升高了120.4%和334.5%。與模型組相比，WP+CTX組和WP+CPP+CTX組血清AST活性分別顯著（P<0.05）下降了36.4%和47.5%；血清ALT活性分別顯著（P<0.05）下降了38.3%和62.7%。結(jié)果表明，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對免疫抑制小鼠的肝功能有良好的保護效果。

BUN和CR的升高意味著腎功能的損害，一旦腎功能出現(xiàn)損傷，二者將無法經(jīng)過腎小球濾過而被直接釋放到血液中。小鼠血清中BUN和CR含量如圖6所示。

圖6 小鼠血清BUN和CR含量Fig.6 Serum levels of blood urea nitrogen and creatinine in mice

由圖6可知，模型組小鼠血清BUN和CR含量較空白組顯著（P<0.05）升高62.6%和132.8%，表明小鼠腎功能受損。與模型組相比，WP+CTX組和WP+CPP+CTX組小鼠血清BUN含量分別顯著（P<0.05）下降了24.3%和30.6%；血清CR含量分別顯著（P<0.05）下降了33.1%和51.3%。結(jié)果表明，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對免疫抑制小鼠腎功能有良好的保護效果。

2.5 乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對小鼠抗氧化系統(tǒng)的影響

小鼠脾臟和小腸中GSH含量如圖7所示。

圖7 小鼠脾臟和小腸中GSH含量Fig.7 Content of glutathione in spleen and small intestine of mice

由圖7可知，模型組小鼠脾臟中GSH的含量相比于空白組顯著下降了60.9%。與模型組相比，WP+CTX組和WP+CPP+CTX組小鼠脾臟GSH含量分別顯著（P<0.05）升高了111.2%和143.6%。與模型組相比，WP+CTX組和WP+CPP+CTX組小鼠小腸GSH含量分別顯著（P<0.05）升高了60.0%和119.3%。

小鼠脾臟和小腸中SOD活性如圖8所示。

由圖8可知，與空白組相比，環(huán)磷酰胺處理顯著降低了小鼠脾臟和小腸組織中的SOD活性。與模型組相比，WP+CTX組和WP+CPP+CTX組小鼠脾臟中SOD活性依次升高17.8%和28.0%；小腸中SOD活性依次升高22.2%和29.8%。結(jié)果表明，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對免疫抑制小鼠的抗氧化系統(tǒng)的影響顯著優(yōu)于乳清蛋白單獨保護組。

圖8 小鼠脾臟和小腸中SOD活性Fig.8 Activity of superoxide dismutase in spleen and small intestine of mice

2.6 乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對小鼠脾臟中炎癥信號通路活化的影響

TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，小鼠TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路表達情況如圖9所示。

圖9 小鼠脾臟中TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路表達Fig.9 Expression of TLR4/MyD88/NF-κB inflammatory signaling pathway in mice spleen

由圖9可知，與空白組相比，模型組小鼠脾臟中TLR4、MyD88、NF-κB 的表達顯著（P<0.05）升高，分別為空白組小鼠的1.9倍、2.3倍、2.1倍。經(jīng)過乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽保護后，炎癥蛋白TLR4、MyD88、NF-κB的表達均出現(xiàn)不同程度的下降，下降程度分別為46.6%，55.6%，46.2%，表明乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對抑制TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路的激活有良好的作用。

2.7 乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對小鼠脾臟中炎癥因子表達的影響

一旦TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路被激活，則會誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生炎癥因子，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對小鼠脾臟中炎癥因子表達的影響結(jié)果如圖10所示。

圖10 小鼠脾臟中炎癥因子表達水平Fig.10 Expression levels of inflammatory cytokines in mice spleen

由圖10可知，模型組小鼠脾臟中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平較空白組顯著（P<0.05）升高，分別是空白組的5.5倍、4.5倍、10.6倍。經(jīng)過乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽的保護后，IL-1β的mRNA水平較模型組顯著（P<0.05）下降69.5%，IL-6的mRNA水平較模型組顯著（P<0.05）下降73.2%，TNF-α的mRNA水平較模型組顯著（P<0.05）下降81.5%。相比于乳清蛋白單獨保護，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽對炎癥因子的抑制程度更高。

3 討論與結(jié)論

免疫系統(tǒng)在監(jiān)視、防御和調(diào)節(jié)機體功能上發(fā)揮著重要的作用[7]。脾臟作為機體最大的免疫器官，參與細胞免疫和體液免疫[8]；小腸也是人體重要的免疫器官之一[9]。大多數(shù)免疫調(diào)節(jié)劑存在價格昂貴和具有副作用的缺點[10]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)乳清蛋白在調(diào)節(jié)機體免疫活性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[11-14]。

良好的抗氧化能力對于機體防止氧化損傷和維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[15]。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化活性較高的膳食營養(yǎng)補充劑可以改善免疫功能，并能維持巨噬細胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對細菌的吞噬作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽能夠增強免疫抑制小鼠脾臟和小腸中GSH和SOD的水平。GSH和SOD能幫助機體保持正常的免疫系統(tǒng)功能，具有清除過量的自由基、減弱脂質(zhì)過氧化程度的作用[17]。含硫氨基酸和支鏈氨基酸是合成GSH必需的谷氨酸鹽的前體物質(zhì)之一，能夠更好地維持人體的抗氧化能力和水平[18]。乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽通過保護機體免受氧化應(yīng)激，有效地改善了機體的免疫反應(yīng)功能，這一調(diào)節(jié)機制可能與乳清蛋白中含有的含硫氨基酸（半胱氨酸和蛋氨酸）和支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）有關(guān)。

TLR4是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，能夠識別病原體分子，從而影響免疫應(yīng)答[19]。TLR4表達水平升高激活下游蛋白MyD88和NF-κB信號的級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)下游靶基因炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[20]。細胞因子、炎癥介質(zhì)等細胞產(chǎn)物參與免疫細胞的各種功能，并在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽通過抑制脾臟TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路的活化以及炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的產(chǎn)生來實現(xiàn)對免疫抑制小鼠的有益調(diào)控，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽的抗炎活性與免疫調(diào)節(jié)活性之間可能存在潛在關(guān)系。

乳清蛋白的應(yīng)用雖已十分廣泛，但是乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽這種蛋白復(fù)配應(yīng)用較少。本文通過增強小鼠免疫功能的研究，為這種新型復(fù)配蛋白粉的生物活性功能和應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。相比于單一的乳清蛋白，乳清蛋白聯(lián)合酪蛋白磷酸肽具有更優(yōu)的調(diào)節(jié)機體免疫活性的特點。本研究為乳清蛋白和酪蛋白磷酸肽在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)利用提供參考。